专利名称：：鉴定hbv基因型的特异性探针及使用其检测hbv基因型的方法、试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种特异性探针，及通过特异性组合探针，利用荧光PCR多通道技术，鉴定HBV基因型的方法、试剂盒。
背景技术：
：多年来，国内外众多研究人员对全球各地HBV进行了全基因组测序，并通过序列分析研究，己经明确HBV具有8种基因型(A-H)。据2008年WHO最新资料显示，全球约20亿人感染HBV，其中近4亿为慢性肝炎，每年死亡人数约60万。2/3数量处于亚洲地区，其中中国地区HBV以B、C型或BC混合型为主，也有少部分A、D型。HBV不仅具有地域分布的特点，同时对疾病的发生和发展有影响。目前，通过临床横向比较、对照分析以及预后研究，证实C基因型较B基因型更容易导致严重肝炎。而且，从HBeAg到抗HBe的血清转化状况也有所差异。B基因型在precore终止子突变机率要显著高于C基因型，抗HBe的血清转化更早出现，近来有报道，不同基因型的HBV导致肝癌的机率也有不同。因此，对HBV进行基因分型不仅有助于对病毒进化变异研究，流行病学调査有积极意义，也对疾病治疗与转归的评估，以及未来制定治疗方案和策略有实用价值。目前，对HBV基因分型的实验室方法主要包括有l)PCR产物限制性片段长度多态性分析，相对简单，但是缺点一是可能酶切不完整，二是变异干扰大，谱型的一致性不好，影响结果判定。2)PCR微流芯片技术检测HBV基因分型，多态芯片酶联分析基因分型等等，但是上述方法，技术复杂，实验流程长。3)Microarmy芯片虽然可以高通量、较为准确地检测分型，但是对于HBV分型来讲，结构体系就太大了，不经济，也没必要。4)全基因组测序，虽然能很好分型，但是机器昂贵，成本高，技术要求高，实用性不佳，普及受限。相比较来看，实时荧光PCR更适合HBV基因分型。实时荧光PCR由美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems)于1996年发明，通过检测每个循环PCR产物的总累积量，借助荧光标志(主要是水解探针)，来达到很好的定量结果。由于该技术具有很强的特异性和灵敏度、有效解决传统PCR的污染问题、自动化程度高等特点，因此，被广泛用于临床微生物的检测。随着技术发展，包括ABI、Bio-rad、Roche等多家公司都相继生产了多通道/多色荧光PCR检测仪，可以对一个反应体系中，不同波长的荧光进行区分。这样就可以使得不同型间特异性探针于一个体系中，鉴定出目标模板的基因型。利用多通道荧光PCR鉴定HBV基因型的关键，就是选取合适的特异性位点构建探针。由于探针长度有限(一般25-35bp为佳)，而且HBV基因组的变异性很大，如果不能很好地选择有意义的型间特异性位点，或选择的特异性位点数量不足，或特异性位点的在探针中所处位置不当，均不能有效分型。有类似发明就存在这样的缺陷，而不能很好地达到鉴定的目的。在HBV基因组上有一个最长的基因重叠区，就是大S区域，任何一个位置的突变会同时影响两个基因的编码，因此，产生致死性突变的机率很大，而这些突变就很难被保留下来，也是说，该区域较其它区域相对保守，所以，该区域的特异性位点用于分型就更有意义。
发明内容本发明的目的在于克服现有的上述技术之不足，研究出一种采用型间高特异性组合探针，利用多通道荧光PCR技术，快速、有效地鉴定HBV基因型的方法。本发明所述鉴定HBV基因型的特异性探针，其具有SEQIDNO:l-8所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列中的至少一种(包括潜在点突变造成的个别碱基差异的这些序列)。本发明的优选实施例中，上述的鉴定HBV基因型的特异性探针具有SEQIDNO:l-8所示的核苷酸序列。本发明的优选实施例中，上述鉴定HBV基因型的特异性探针来自于HBV基因组中的大S重叠基因区域序列，位于SEQIDNO:9-10所示引物的扩增区域之中。本发明还提供一种鉴定HBV基因型的方法，其主要包括步骤a.制备SEQIDNO:9-10所示的引物和上述的鉴定HBV基因型的特异性探针；b.提取PCR模板；c.将各待测样本放入荧光PCR仪，与a和b中所得引物、特异性探针和模板混合后进行荧光PCR反应；d.结果判读，确定各待测样本的HBV基因型。其中，步骤c中进行荧光PCR反应时，步骤a中所述特异性探针的一个位置为荧光基团修饰，而另一位置为淬灭基团修饰；或者不同荧光或淬灭基团的各种组合。其中，步骤d包括在标记探针对应的荧光波长进行荧光检测。本发明还提供一种鉴定HBV的基因型的试剂盒，其包含上述的鉴定HBV基因型的特异性探针和上述的引物；使用量均为IO一，而且HBV型间特异性荧光双标探针分开包装，使用时可任意组合。其还可以进一步地包含HBVDNA的提取液和反应液。其中，HBVDNA的提取液包括I液NaCl终浓度是0.5mol/L，10%(w/w)PEG6000;II液5。/。(w/v)Chelex-100裂解液；反应液包括O.lU/nlTaq聚合酶，500^MdNTPeach,20一Tris-HCl,lOOmMKCl，3mMMgCl2，0.004U/}ilUNG酶，ddH20。本发明可对HBV的八种基因型(A-H)进行鉴定，分型设计完备。技术上，较传统方法，流程简单，操作简便，用时短；同时，灵敏性更高，大大降低污染干扰；在理论上，以及生物信息分析结果来看，本发明方法弥补类似发明中特异性不足的特点，从而具备显著的型间差异度和实际可操作性。本试剂盒费用经济，便于推广，有利于相关各级单位使用。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳6实施例，并配合附图，作详细说明如下。图1、B基因型双标探针(5，FAM—3，TAMRA)和C基因型双标探针(5，Cy3—3'TAMRA)组合检测HBV基因型，结果显示B2、B3、C2、C3、C5样本于490nm吸收波长有扩增，证实这些样本为B基因型；图2、B基因型双标探针(5，FAM—3，TAMRA)和C基因型双标探针(5，Cy3—3'TAMRA)组合检测HBV基因型，结果显示B2、B3、C2、C3、C5样本于530nm吸收波长没有扩增，同时证实这些样本不为C基因型；图3、B基因型双标探针(5'FAM—3'TAMRA)和C基因型双标探针(5'Cy33'TAMRA)组合检测HBV基因型；结果显示B4、B5、Cl、C4样本于530nm吸收波长有扩增，证实这些样本为C基因型；图4、B基因型双标探针(5'FAM—3'TAMRA)和C基因型双标探针(5'Cy3—3'TAMRA)组合检测HBV基因型；结果显示B4、B5、Cl、C4样本于490nm吸收波长没有扩增，同时证实这些样本不为B基因型。具体实施例方式以下仅以中国地区HBV基因样本为例，进一步说明本方法，而不应视为对本发明的限制。技术方案特异性组合探针鉴定HBV基因型的方法1.技术步骤第一步，获取HBV基因组DNA取HBV感染患者，加入10X(w/w)PEG6000震荡混匀，离心弃上清，再加入5%(w/v)Chelex-lOO,煮沸IO分钟，离心，取上清液作为PCR模板。第二步，利用型间特异性探针建立PCR反应体系上述鉴定HBV基因型的荧光PCR反应体系包括Taq聚合酶，dNTPeach,Tris-HCl，KCl，MgCl;!,UNG酶，HBV非特异性引物，特异性水解探针，ddH20，HBV基因组DNA模板。第三步，荧光定量PCR反应，扩增条件为95*C5分钟94°C20秒}49"30秒(40个循环)72'C30秒第四步，结果判定与病毒基因型一致的特异性探针在PCR过程中被水解后，发出相应波长的荧光，并通过PCR循环荧光量得以累积，PCR反应结束后，通过对应探针的荧光波长及CT值即可确定基因型及其量(包括单一或混合型)。由于病毒基因组的变异随时可发生，所以，可能会有假阴性的出现，但该方法从理论上，已将这种可能降低到最小。2.引物与探针本法鉴定HBV的基因型，其核心技术就是提供了一组高特异性的型间探针。其来源是我们运用生物信息学技术，分析来自Genbank中的913条HBV全基因组序列和本课题组测序获得的大陆地区120例乙肝病毒序列样本，总共获得约1030条HBV基因组序列(其中，A型131例，B型290例，C型389例，，D型93例，，E型66例，，F型43例，G型13例，H型8例)，着重以HBV基因组中最大的基因重叠区——S区域为目标序列，设计一对HBV非特异性(通用)引物(上游引物GGTCACCATATTCTTGGGAACA;下游引物ACTGCATGGCCTGAGGATG)进行产物扩增，并以此区域设计型间特异性探针。通过这些特异性探针的选择组合，利用实时荧光定量PCR方法，就可到达快速鉴定HBV基因型的目的。各型的特异性探针列表如下(型间平均特异位点数高达7.3个/26.5&):序列(5，->3，)长度A型探针CATCAAAACCTCGCAAAGGCATGG24B型探针CTCAACCCGCACAAGGACAACTGGCCGGAC308c型探针TCACTGGCCAGAGGCAAATCAGGTAGGAGCG31D型探针TGGGATTCACCCCACCGCAC20E型探针CACAATCCCAACAAAGACCACTGGACAGAA30F型探针CGGTCCGGGAGAAAGCCAACC21G型探针CCTATGGACCCGGGTTCACCCCTCCA26H型探针AATTGGCCAATGGCAAACAAGGTAGGAGTG30由于病毒自身变异特点，上述探针也可能会有点突变发生，但是该区域的仍然是最佳的分型序列，与之80%同源序列及其互补链均未改变发明方案的实质性，故同样受权利保护。3.探针制备上述探针以水解探针形式参与荧光PCR反应，即探针的一个位置为荧光基团修饰，而另一位置为淬灭基团修饰。在聚合酶的外切酶活性作用下，将与模板特异性结合的探针的碱基切下，使荧光基团和淬灭基团分离而发光；而其它无关探针未与模板结合，PCR反应过程中探针不被水解而不发光。4.探针使用说明一、反应体系中各探针荧光基团的最大吸收波长要求不同才便于甄别，荧光基团的选择与荧光PCR仪的特性与要求有关，一般不受其它特别限制。二、在一个反应体系中，探针的类别要小于荧光PCR仪的检测通道数。三、荧光探针可从上述列表中选择全部或部分，放入一个体系中反应。如果受某些老式荧光PCR仪的通道数局限，可在多个反应中实施，也可根据HBV地域分布特点，可先采用最大可疑的几种探针在一个反应中进行甄别。实施例一引物、荧光探针的制备(人工合成)上游引物5，GGTCACCATATTCTTGGGAACA3，(20D)下游引物5，ACTGCATGGCCTGAGGATG3，(20D)B型探针采用双标5，FAM—3，TAMRA(20D)CTCAACCCGCACAAGGACAACTGGCCGGACC型探针采用双标5'Cy3—3'TAMRA(20D)TCACTGGCCAGAGGCAAATCAGGTAGGAGCG实施例二模板提取及反应体系(1)模板提取I液NaCl终浓度是0.5mol/L,10%(w/w)PEG6000。II液5%(w/v)Chelex-100。操作步骤取100pl人血清，加入100pl"I液"震荡混匀，离心13000r/min,IO分钟，吸弃上清，再加入25^"II液"，煮沸10分钟，离心13000r/min,IO分钟,取5pl上清液作为PCR模板。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例三荧光PCR反应与检测按上述反应体系，将各样本放入荧光PCR仪(Bio-radIQcycler)选择双通道检测，分别用4卯nm(FAM)和530nm(Cy3)波长检测，扩增条件如下95匸5分钟94'C20秒}49'C30秒(40个循环)72n30秒B基因型阳性对照为测序确证的B基因型DNA样本，C基因型阳性对照为测序确证的C基因型DNA样本。结果判定综合分析仪器检测的数据，设定合理的基线和阈值，观察待测样本中两种荧光扩增曲线，计算Ct值，通过标准品，分别推算出两种荧光探针反应出的拷贝数，在如下的九例阳性样本的荧光PCR鉴定反应中，五例为纯B基因型，另四例是纯C基因型。如图l-4所示，其中，图l、B基因型双标探针(5'FAM—3'TAMRA)和C基因型双标探针(5'Cy3—3'TAMRA)组合检测HBV基因型，结果显示B2、B3、C2、C3、C5样本于490nm吸收波长有扩增，证实这些样本为B基因型；图2、B基因型双标探针(5'FAM…3'TAMRA)和C基因型双标探针(5'Cy3—3'TAMRA)组合检测HBV基因型，结果显示B2、B3、C2、C3、C5样本于530nm吸收波长没有扩增，同时证实这些样本不为C基因型；图3、B基因型双标探针(5'FAM-—3'TAMRA)和C基因型双标探针(5'Cy3—3'TAMRA)组合检测HBV基因型；结果显示B4、B5、Cl、C4样本于5300nm吸收波长有扩增，证实这些样本为C基因型；图4、B基因型双标探针(5，FAM--3，TAMRA)和C基因型双标探针(5'Cy3--3'TAMRA)组合检测HBV基因型；结果显示B4、B5、Cl、C4样本于490nm吸收波长没有扩增，同时证实这些样本不为B基因型。序列表〈110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院<120>鉴定HBV基因型的特异性探针及使用其检测HBV基因型的方法、试剂盒<130>〈160〉10<170>Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉24<212>DNA<213>特异性探针<400>1C3tCa3a3CCtCgC833ggC8tgg24<210>2<211>30<212>DNA〈213>特异性探针<210>3<211>31<212>DNA<213>特异性探针〈400>3tcactggccagaggcaaatc8ggt3gg8gcg31<210>4〈211>20〈212〉DNA<213>特异性探针〈400〉2ctcaacccgcacaaggacaactggccggac<400>4tgggattcaccccaccgcac<210>〈211>〈212>〈213〉530DNA特异性探针<400>5cacaatcccaacaaagaccactggacagaa30〈210>6<211>21<212〉DNA〈213>特异性探针〈400〉6cggtccgggsgaasgccascc21〈210>7<211>26<212>■<213>特异性探针〈400>7cctatggacccgggttcacccctcca26<210>8<211>30〈212〉DNA<213>特异性探针〈400>838ttggccaatggcaa3C33ggt3ggsgtg30<210>9〈211>22<212〉DNA<213>上游引物<400>9ggtcaccatattcttgggaaca22<210>10<211>19<212>DNA<213>下游引物〈400>10actgcatggcctgaggatg191权利要求1.一种鉴定HBV基因型的特异性探针，其特征在于具有SEQIDNO1-8所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列中的至少一种。2.根据权利要求1所述的鉴定HBV基因型的特异性探针，其特征在于具有SEQIDNO:l-8所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的鉴定HBV基因型的特异性探针，其特征在于探针来自于HBV基因组中的大S重叠基因区域序列，位于SEQIDNO:9-10所示引物的扩增区域之中。4.一种鉴定HBV基因型的方法，其特征在于包括步骤a.制备SEQIDNO:9-10所示的引物和权利要求1所述的特异性探针；b.提取PCR模板；c.将各待测样本放入荧光PCR仪，与a和b中所得引物、特异性探针和模板混合后进行荧光PCR反应；d.结果判读，确定各待测样本的HBV基因型。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤c中进行荧光PCR反应时，步骤a中所述特异性探针的一个位置为荧光基团修饰，而另一位置为淬灭基团修饰；或者不同荧光或淬灭基团的各种组合。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤d包括针对探针标记荧光对应的波长进行实时荧光检测。7.—种鉴定HBV的基因型的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的特异性探针。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于还包含权利要求3所述的引物。9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于还包含HBVDNA的提取液和反应液。10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述HBVDNA的提取液包括I液:NaCl终浓度是0.5mol/L,10%(w/w)PEG6000;II液5%(w/v)Chelex-100裂解液；反应液包括O.lU/nlTaq聚合酶，500mMdNTPeach,20|iMTris-HCl,lOOmMKC1,3mMMgCl2，0.004U/plUNG酶，ddH20。全文摘要本发明涉及一种鉴定HBV基因型的特异性探针，其具有SEQIDNO1-8所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列中的至少一种。本发明还提供一种鉴定HBV基因型的方法和试剂盒，该试剂盒包含上述的特异性探针。本发明可对HBV的八种基因型(A-H)进行鉴定，分型设计完备。技术上，较传统方法，流程简单，操作简便，用时短；同时，灵敏性更高，大大降低污染干扰；本发明方法弥补类似发明中特异性不足的特点，从而具备显著的型间差异度和实际可操作性。本试剂盒费用经济，便于推广。文档编号C12Q1/68GK101560576SQ20091010392公开日2009年10月21日申请日期2009年5月22日优先权日2009年5月22日发明者国卫,军吴,张园园,曹红卫,彦李,青毛,宁王,赵苛岑,凯郑,江郑申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院