专利名称：棉花油菜素内酯合成酶基因的用途及含有其的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及棉花油菜素内酯合成酶基
因的用途，含有该基因的编码蛋白质及植物表达载体；本发明还涉及制备含有 上述基因的转基因植物的方法。
背景技术：
油菜素内酯类物质(brassinosteroids， BRs)是广泛存在于植物体中的一类具 有类似于动物甾醇结构的激素。油菜素内酯类物质在植物生长发育的许多生理 过程中都具有重要的作用，而且浓度极低(nmol，U1)的油菜素内酯类物质 就能表现出极高的生理活性，因此油菜素内酯类物质被认为是继生长素、赤霉 素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯之后的第六大植物激素。
在模式植物拟南芥上的研究表明，BRs合成和信号传导途径的缺失突变体 表现出极度矮化的表型，同时出现叶片变小、开花数少、结实率极低等表型。 在拟南芥中超量表达油菜素内酯合成酶基因能有效提高植物体中油菜素内酯 的含量，同时植株表现出叶片舒展、叶柄变长、花序轴变长、花序轴数量增多、 果荚数增多、种子产量增加等表型。这些结果表明，BRs对植物生长发育有非 常重要的作用，BRs的合成或者信号传导途径受阻会显著影响植物的正常生长 发育，极大的降低植物的育性以及生物总量；反之，提高植物体中BRs的含 量能有效提高植物生物总量，增加果实数和种子数。这说明BRs在提高植物 的营养组织的生物产量和果实种子产量上有较大的潜力。
目前人工合成的油菜素内酯类似物己经一定程度上在生产中得到应用，其 结果表明，油菜素内酯类物质能有效提高农作物的产量和品质性状。利用"天 丰素"(一种人工合成的油菜素内酯)对水稻种子浸种，不但发芽率可以提高 10%以上，而且出芽齐，芽后的秧苗壮，根系十分发达，不易感染病害；在生 长期应用可促进光合作用，植株壮，平均每株分蘖多1.5 3个小枝；在花前 喷施对提高花粉活性、促进授粉十分有利；灌浆期喷施可以促进籽粒饱满，明显提高千粒重，减少败育粒。用BR做10种蔬菜的增产试验，普遍都有增产， 幅度在10% 30%之间；分析营养成分后发现， 一些对人体健康有利的成分都 有不同程度的增加，而对人体不利的有机酸类(破坏人体钙质)成分明显下降； 而且应用BR后蔬菜、瓜果的表皮油亮光滑、外观亮丽，很少有畸型瓜果，大 大提高了农产品的商品性能。(油菜素内酯在农业上的应用成效，广东农业科 学，2006, 5)。此外，BRs在棉花的栽培应用中已经得到推广，云大120 ( — 种人工合成油菜素内酯类物质)可促进棉花营养生长和生殖生长，降低蕾铃脱 落，增加伏桃、秋桃个数，为提高产量打下基础。在粮食作物如小麦、水稻、 玉米的示范试验中施用BRs仍具有明显效果。这些在生产应用上的实例表明， 油菜素内酯类物质对提高农作物的产量和品质性状有明显效果，这对于提高农 作物产量，提高人们的生活品质有重要意义。
虽然外施BRs能够有效提高农作物的品质和产量，但是人工化学合成油 菜素内酯类似物的过程非常复杂，在合成过程中存在对环境的污染。而且合成 甾体母核所用的原材料豆甾醇、麦角甾醇和孕甾醇酮价格比较昂贵，在合成侧 链时由于存在四个手性中心，所合成的甾醇产物也会存在一些非活性构型，从 而进一步增加了油菜素内酯类物质的人工合成成本。另外，由于油菜素内酯类 物质的生理活性极高，施用过程中浓度难以控制，由此也会导致施用效果不稳 定，甚至因浓度过大对农作物产生危害。利用转基因技术提高植物体内高生理 活性BRs的含量，在选择适宜的转基因株系后，能有效避免上述问题，同时 也可以获得产量和品质提高的作物。
在拟南芥中研究表明DWF4是一个BRs合成的关键限速酶，催化油菜素 类固醇物质在C-22上的a-羟基化。研究发现DWF4的底物在植物体中大量累 积但生理活性极低，而DWF4的直接产物在植物体中含量极低，却有很高的 生理活性。这表明DWF4基因的表达可能受到了很严密的调控，从而维持植 物体内有生理活性的BRs在一定的浓度水平。进一步对拟南芥dwf4突变体、 野生型和超量表达DWF4基因的拟南芥植株中BRs的检测含量，发现在野生 型中campestanol (DWF4的底物)比6誦Deoxocathasterone (DWF4的产物)含 量高150倍，突变体中几乎检测不到或只能检测到极少量的DWF4的下游产 物，而超量表达DWF4基因的拟南芥中有生理活性的BRs总量明显增多。这 一结果表明了 DWF4基因可能是维持植物体内有生理活性的BRs的一个关键酶基因，能够决定植物体内有生理活性的BRs的总量。
因此，利用转基因技术，提高植物受体中DWF4基因的表达水平，能够 有效提高植物体内源高生物活性BRs的水平，进而获得产量和品质性状得到 改良的作物。
发明内容
本发明的一个目的在于提供棉花油菜素内酯合成酶基因(Gossypium hirsutum. L brassinosteroids C22a-hydroxylase，下称G7lD『F4基因)的用途， 即在提高农作物产量和改善品质性状以及农作物或林木育种中的应用。本发明 也提供G/ld『/^基因在制备油菜素内酯类物质(BRs)中的应用。 本发明另一目的在于提供含有该GAZ)『i^基因的植物表达载体。 本发明又一目的在于提供制备基于本发明植物表达载体的转基因植物的 方法。
本发明所述的编码棉花油菜素内酯合成酶基因GM)『/^具有如下核苷酸 序列之一
1) 如SEQ ID NO. 1所述的cDNA序列；
2) 如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的gDNA序列；
3) 与上述l)或2)中所限定的DNA序列具有85。/。以上同源性，且编码 相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
3)在高严谨条件下可以与上述1)或2)中所限定的核苷酸序列杂交的核 苷酸序列；其中所述的高严谨条件为在6XSSC (或6XSSPE)， 0.1%SDS， 2 XDenhardt溶液中，65"C条件下杂交；在0.1XSSC， 0.1。/。SDS溶液中，65°C 条件下洗膜。
SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列为编码棉花油菜素内酯合成酶基因 G7 Z)『^/的cDNA序列，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两个核苷酸序 歹U 禾n gG/^『F4-2为gDNA (基因组)序列。cDNA序列为编码
序列，gDNA序列除编码序列外还含有外显子和内含子序列。
由上述GW附W基因编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸 序列，本领域技术人员可以理解的是，将SEQ ID NO.4的氨基酸残基序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.4的氨基酸残基序列相同生物活性的由SEQ ID N0.4衍生的蛋白质序列也同样属于上 述范围。
根据本发明的另一方面，提供的植物或微生物表达载体，其至少含编码油 菜素内酯合成酶基因G/lD『Z^的核苷酸和启动子序列，所述植物或微生物表 达载体通过将编码油菜素内酯合成酶基因C /lD『F4、启动子序列与植物表达 载体可操作地连接而构建。为了筛选和表达的需要，还可选地在表达载体中包 含筛选基因序列、报告基因序列以及其它的为基因工程操作的需要而插入的各 种内切酶位点，筛选基因和报告基因可以从本领域常用的基因序列中选择，优 选地，本发明的植物表达具有如图l所示的结构。例如，可以在所述表达载体 中加入在植物或微生物中能表达的编码可发生颜色变化的酶或发光化合物的 基因，如GUS基因、GFP基因、荧光素酶等；具有抗性的抗生素标记物，如 抗庆大霉素标记物、抗卡拉霉素标记物等；抗化学试剂标记基因，如抗除草剂 基因等。
用于构建本发明植物表达载体的启动子可以是任意一种启动子，包括增强 型、组成型、组织特异型以及诱导型启动子。构建表达载体时，所述启动子可 以单独使用，还可以和其它植物启动子或微生物启动子结合使用。用于构建本 发明植物表达载体的启动子优选组成型启动子或组织特异性启动子，更优选来 源于花椰菜花叶病毒的植物组成型启动子CaMV35S。通常，将G7lD『F4基因 构建在CaMV35S的下游。
用于构建本发明植物表达载体的出发载体可以是任意一种双元农杆菌载 体或者可用于微弹轰击的载体。
在本发明的一种具体实施方案中，将G/zD『i^基因正向插入植物表达载 体pCambia-35S-NOS中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有G/lD『^Z 基因的植物表达载体pCambia-35S- GM)『i^-NOS，其具有如图3所示的结构， 该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切 酶位点，本领域技术人员可以理解的是，上述报告基因、筛选基因好各基因操 作序列均是可以替换的，本发明并不对此进行限制。
根据本发明的另一方面，提供一种转化体，通过使用Ti质粒、Ri质粒、 植物或微生物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导或农杆菌介导等常规 生物学方法，将含有本发明GW)『i^基因的表达载体转染植物或微生物宿主而获得转化体。被转化的植物宿主可以是水稻、小麦、大麦、大豆、玉米、油 菜、烟草、高粱、棉花、苜蓿、杨树、番茄、麻等具有经济价值的植物。被转 化的微生物宿主可以是酵母、大肠杆菌、农杆菌、各种丝状真菌以及其它有潜 在经济利用价值的微生物。
根据本发明的又一方面，提供制备含有GW)『F4基因的转基因植物或微 生物的方法。用GM)『^V基因与启动子构建植物或微生物表达载体，将所述 植物或微生物表达载体转化宿主获得含G/^『i^/基因的转化体，用所述转化 体转化植物或微生物获得转基因材料。
本发明提供了 GM)『F4基因的新用途，成功地构建了包含G/LD『F4基因 和启动子的植物表达载体，并以该表达载体转化植物获得转基因植物，在转基 因植物中GAD『F4基因被超量表达。超量表达的G/^『/W基因明显提高了植 物中的油菜素内酯类物质的含量，可以用于制备油菜素内酯类物质，该物质可 用于农作物和林木育种，而目前通过人工合成的油菜素内酯类物质成本高，收 率低，合成十分困难。
本发明获得G/lD『^/组成型超量表达的转基因烟草，分别提取该转基因 烟草和野生型烟草的叶片的油菜素内酯类物质，检测其生物活性，发现超量表 达G/^『F4基因能够增加植株中内源高生物活性油菜素内酯类物质的含量， 促进植物下胚轴的伸长，增加植物叶片的面积；同时该基因的超量表达能增加 转基因烟草的果实大小和生物生长量，这对于培养优良的作物品种具有重要的 理论和实际意义。
图l:含G7^『i^基因的植物表达载体的结构图，其中
35S，代表CaMV35S启动子；GhDWF4:代表G/lD『^V基因cDNA ; term， 代表终止子；LB，代表T-DNA左边界；RB，代表T-DNA右边界。
图2:组成型启动子CaMK 5S调控下的棉花G/ Z)『7W基因表达载体的构 建流程图，其中
GRP-GusPlus-His6，代表GUSPlus报告基因，该基因在N端融合了GRP 信号肽，在C端融合了His6序列标签；NPTII，代表新霉素磷酸转移酶基因， 具有卡拉霉素抗性；Nosterm， Nos终止子；CaMV35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB， T-DNA左边界；RB， T-DNA右边界。pf/C-G/LD『^/ 载体为对GM)『i^基因进行TA克隆时获得的载体，植物表达载体为改造的 pCambia载体(详见实施例二)。 pt/C-G/^『^V载体用Kpnl和Xbal酶切后， 回收G/^『W片段。改造的pCambia载体用Kpnl和Xbal酶切后回收载体。 回收的载体片段和目的基因片段连接后转化大肠杆菌，获得超量表达G/lD『/^/ 基因的植物表达载体pCambia-35S-G/LD『F4-NOS。
图3:本发明优选的植物表达载体？031111^&-358- ( /z￡>『i^-NOS结构图4:转基因烟草中G/^『F4的表达分析
以野生型烟草和转基因烟草植株的叶片为材料，提取叶片总RNA，通过 反转录合成单链cDNA。用Real-Time PCR方法分析转基因烟草中目的基因的 表达，具体操作方法参照Bio-Rad Quantitative Real-Time PCR试剂盒。GhDWF4 基因用引物D4-500 (SEQIDNO.9)和GhDWF4-2 (SEQIDNO.6)扩增，内 标采用烟草ACTIN基因(登录号AB158612)，引物为actin-l (SEQIDNO.7) 和actin画2 (SEQIDN0.8)。扩增程序为94'C预变性3min; 94°C， 30sec; 56 。C，30sec;72。C，30sec;预设循环数为35。图中标示OD4-l、 OD4-5、 OD4-6 、 OD4-7 、 OD4-8、 OD4-21禾nOD4-23，为不同株系的超量表达G/lD『F4的烟 草材料；野生型，为没有进行遗传转化的野生型受体材料。
图5:超量表达G/LD『i^的转基因烟草与野生型的株高比较
超量表达GW)『/^基因的转基因烟草和野生型烟草同时种植在培养钵 中，在温室中按照常规管理方式进行管理。观察植株生长表型发现，植株迸入 盛花期后转基因烟草植株的株高高于野生型。图中标示OD4，为超量表达 GhDWF4的烟草材料；对照，为野生型烟草。
图6:超量表达G/lD『T^的转基因烟草叶片表型
观察转基因烟草叶片表型发现，转基因烟草叶片形态发生较大变化，主要 表现在烟草叶形变得狭长，叶片宽度没有明显变化，而叶片长度要长于野生型， 最终表现为叶片面积比野生型大。图中叶片均为不同植株从下往上数的第12 张叶片。图中标示OD4，为超量表达G/^『/^的不同株系的烟草材料；对 照，为野生型烟草材料。
图7:超量表达C^Z)『i^的转基因烟草叶片的长度和宽度统计 统计了转基因烟草部分株系以及野生型的叶片长度和宽度。测量的叶片为每一株从下往上数第8到第16张叶片。图中标示OD4-l、 OD4-7、 OD4-8 和OD4-21，为超量表达G/lD『F4的烟草材料；对照，为野生型烟草。
图8:超量表达G/iD『/^的转基因烟草叶柄长度统计
观察转基因烟草叶片表型时发现，超量表达G/lD『F4的转基因烟草叶片 的叶柄长度要长于野生型。图中标示OD4-l、 OD4-7、 OD4-8和OD4-21，为 超量表达G/LD『i^的烟草材料；对照，为野生型烟草。
图9:转基因烟草Tl代种子摇瓶培养结果
超量表达G/lD『F4的转基因烟草Tl代种子用摇瓶培养，观察Tl代幼苗 的表型变化，野生型烟草种子同时培养作为对照。在28t， 110rpm的条件下 培养7天的烟草表型变化。图中标示OD4-l、 OD4-5、 OD4-7、 OD4-8 、 OD4-21 和OD4-22，为超量表达GhDWF4的烟草材料；对照，为野生型烟草材料。
图10:转基因烟草Tl代种子摇瓶培养下胚轴长度统计
超量表达G/2D『F4的转基因烟草Tl代种子用摇瓶培养，从第5天起开始 测量下胚轴长度，连续测量4天。数据显示超量表达G/2"『/^的转基因烟草 Tl代幼苗下胚轴生长速度要比野生型的快，表明G/LD『7^表达水平的增加促 进了烟草下胚轴的生长。图中标示OD4-l、 OD4-5、 OD4-7、 OD4-8 、 OD4-21 和OD4-22，为超量表达GM)『i^的烟草材料；对照，为野生型烟草材料。
图ll:转基因烟草和野生型烟草的果实比较
取转基因植株和野生型烟草相似部位的果枝，观察果实表型的变化。超量 表达GM)『F4基因的转基因烟草的果实略大于野生型，转基因植株的果柄也 比野生型的长。图中标示OD4，为超量表达G7lD『T^的烟草材料；对照， 为野生型烟草。
图12:用转基因烟草和野生型烟草叶片BRs提取物处理野生型烟草的结
果
以野生型烟草种子为材料，用从野生型和转基因烟草的叶片中提取的BRs 来处理种子，观察提取物对烟草种子生长发育的影响。100nM的epi-BL作为 阳性对照，提取过程中的溶剂作为阴性对照。结果显示从超量表达GM)『^/ 的转基因烟草叶片中提取的BRs活性要高于从野生型烟草叶片中提取的BRs， 表明超量表达G/^『^/的材料中高生物活性的BRs含量比野生型的高。图中 标示阳性，为100nM的epi-BL处理；阴性，为用溶剂处理；OD4叶片提取物，为从超量表达G/LD『7^的烟草叶片中提取的BRS处理；对照提取物，为
从野生型烟草叶片中提取的BRs处理。
图13:用转基因烟草和野生型烟草叶片BRs提取物处理野生型烟草的下 胚轴长度统计
提取的BRs处理野生型烟草种子7天后，统计了烟草幼苗的下胚轴长度。 与野生型相比，从相同质量的超量表达G/lD『F4的转基因烟草叶片中提取的 BRs，更能促进烟草幼苗下胚轴的生长，表明转基因材料中生物活性的BRs 含量高于野生型烟草。图中标示epi-BL阳性对照，为100nM的epi-BL处理； 溶剂阴性对照，为用溶剂处理的结果;OD4叶片提取物，为从超量表达G7LD『F4 的烟草叶片中提取的BRs处理；对照提取物，为从野生型烟草叶片中提取的 BRs处理。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发 明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属 于本发明所附权利要求所定义的范围。
本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做 具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell， 2001)。
在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为徐州142 (Gossypium hirsutum cv. Xuzhoul42)，所用的烟草实验材料为Nicotiana tabacum。实施例一GhDWF4基因序列的克隆 1、棉花RNA的提取
选取约3 g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心 管，加入15ml65。C预热的RNA提取液(2。/。CTAB (W/V)， 2% PVP (W/V)， 100薩ol/LTris誦HCl (pH8.0)， 0.5g/L Spermidine, 2.0mol/LNaCl， 2%巯基乙 醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65。C水浴3 10min，期间混匀2~3次。 氯仿:异戊醇(24:1)抽提2次(10,000 r/min，室温，5 min)。取上清，加入 1/4体积10mol/LLiCl溶液，4。C放置6h，以氯仿:异戊醇(25:24:1)各抽提1 次(10,000 r/min，室温，5 min)。加2倍体积的无水乙醇，在-7(TC冰箱沉淀 30min以上。12,000 r/min， 4。C离心20min，弃上清。沉淀用200 |xL的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇(24:1)各抽 提1次(IO，OOO r/min，室温，5 min)。力tj 1/10体积3 mol/L NaAc溶液和2.5 倍体积的无水乙醇，在-70。C冰箱沉淀30min以上。12,000 r/min， 4。C离心20 min，弃上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，风干。加200 的DEPC处理 水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。
2、 cDNA合成和C^DWF4基因cDNA序列的PCR扩增
利用拟南芥"『i^/基因cDNA序列，在NCBI中査找棉花中同源性高的 EST序列，根据EST序列设计引物进行染色体爬行获得G/ld『i^的cDNA5' 和3'端序列，设计5'端引物GhDWF4-l (SEQ ID NO.5)和3'引物GhDWF4-2 (SEQ ID N0.6)。提取棉花10dpa的纤维总RNA，用试剂盒(Fermentas)合成 cDNA —链后，利用PCR的方法获得G7lD『/^的cDNA全长序列(SEQ ID NO.O。具体方法如下
(1) cDNA—链合成
取约10吗总RNA至J DEPC-处理的扩增管中，加入1 pL 2.5 |imol/L Oligo-dT ，加DEPC处理的水至终体积12pL， 7(TC水浴5min使RNA变性后， 立即冰浴3 min。然后向扩增管中依次加入4|aL 5x reaction buffer, 2 |uL 10 mmol/L dNTPs， 1 RNase inhibitor (20U)， 37。C处理5min。加入1|^L AMV Rtase (5U)后，保温程序为42。C, 60min; 70°C， 5 min; 5°C， 5 min。程序 结束后， 一链产物于-2(TC冻存。
(2) 扩增
25pL的cDNA扩增体系含2.5|nL 10xEx PCR buffer (Mg2+ free), 2|iL 2.5腿ol/LdNTPs， 2 25mmol/LMgCl2， 1 pL特异引物GhDWF4-l (SEQID NO.5 ) (5 nmol/L ) ， 1 GhDWF4-2 (SEQ ID N0.6 ) (5 pmol/L ) ， 0.2 |iL Ex TaqDNA聚合酶，1 |iL cDNA—链产物。扩增程序为94°C， 5 min; 94°C， 30sec， 56。C， 30sec， 72°C， 1.5 min， 30个循环;72。C延伸10min。
3、 cDNA片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a
(1) 电泳
将cDNA扩增产物在1.0。/。 (W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
(2) 回收
使用回收试剂盒回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。
(3)克隆和测序
回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克 隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，
将回收片段克隆到pUCm-T (上海Sangon)载体上。序列测定由英骏公司完 成。
回收的片段与pUCm-T (上海生工)载体建立如下连接体系 10xT4 DNA连接缓冲液 1 载体DNA片段 1 外源连接产物DNA片段 1
T4 DNA连接酶_1
用双蒸水补足体积至10 pL的连接体系
载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3， 16。C连接12h。 之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。 4、 GhDWF4基因组DNA的克隆
通过southern杂交实验表明GhDWF4在棉花野生型中存在两个拷贝。在 野生型陆地棉中存在A和D两个基因组，为了克隆A和D基因组中的GhDWF4 基因，提取了陆地棉、中棉和雷蒙德氏棉的基因组DNA，用GhDWF4-l (SEQ ID NO. 5)和GhDWF4-2 (SEQIDN0.6)扩增前面三种基因组DNA，获得 的片段连接到T克隆载体上进行测序(其中陆地棉的基因组扩增后获得的片 段用酶切表明存在两种不同的片段，将两种片段均进行了测序)。测序后把前 面所克隆的cDNA与四条片段同时比对发现，四条片段的外显子区域几乎完全 一致。陆地棉中克隆的两条片段(标记为gGADPT/^-/和gG/LD『i^-2)存在 内含子数量以及位置上的差异，而外显子上仅存在少数几个碱基的差异。
和gG/LO『F4-2与中棉和雷蒙德氏棉中克隆的片段(分别标记为 GaD『F4和GW)『/W)比较发现纟(^/)附^-/ (SEQIDN0.2)和gG/LD『/^-2 (SEQIDN0.3)分别与OD『i^和GoD『i^的同源性更接近，表明两者分 属D基因组和A基因组。
实施例二超量表达载体的构建和烟草遗传转化1、 超量表达载体的构建
pt/C-G/ld『i^载体是在克隆G/lD『F4基因时构建，其上的G/iZ)『i^片 段已测序。植物表达载体为改造的pCambia载体，该载体的HPTII基因用Xho1 单酶切后替换为NPTII基因(设计引物从pBI121载体中扩增获得，引物设计 两端带Xhol位点)，限制性酶切和测序结果验证了 NPT II基因的方向。在 pBI121载体中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，同时这两个元件两 端也引入了相应的酶切位点，这两个元件最后分别导入pCambia的多克隆位 点，形成CaMV35S: :MCS: :NOS单元。该植物表达载体含有1套2XCaMV35S 启动子控制NPTII基因的植物表达元件、1套CaMV35S启动子控制报告基因 Gi^-GM_P/i -/^6的植物表达元件和一套CaMV35S启动子控制目标基因的植 物表达元件，可实现Kan和GUS活性的双标记筛选。在多克隆位点(Multiple cloning site, MCS)插入外源基因，可以实现外源基因的超量表达。
为了在转基因植物中超量表达GM)『W基因，需要将G/lD『W基因正向 插入植物表达载体中，并用适当的启动子启动表达。为此根据pf/C-G/zZ)『i^ 载体上的酶切位点和GAD『F4的插入方向以及改造的pCambia植物表达载体 上的多克隆位点和CaMV35S启动子的方向，设计了如图2所示的载体构建路 线。根据这个植物表达载体构建路线，构建了超量表达G/ld『i^基因的植物 表达载体pCambia-35S-G/ld『F4-NOS (图3 )。
2、 烟草遗传转化
用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。 参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入 农杆菌LBA4404。
上述的植物表达载体通过农杆菌介导叶盘感染的方法导入烟草。具体方法 如下
烟草种子用1%的次氯酸钠消毒后，在MSB固体培养基上萌发，培养条 件为25°C、 16hr光照/8hr黑暗的光周期。约一个月后生长健壮的无菌苗即可 用作转化外植体。
采用农杆菌介导的叶盘转化法含植物表达载体的农杆菌菌株接种于液体 YEB， 28'C200rpm摇床培养过夜，从已摇好的菌液中重新吸取l~2ml于 20~25ml液体YEB中再次活化。待菌液摇至OD600约为0.8时，取出用YEB稀释到0.05~0.2备用。
将无菌苗健壮叶片，切成约0.5cmX0.5cm大小叶盘，放入OD600值为 0.05-0.2的农杆菌菌液中，轻轻振荡浸染5min后，立刻倾去菌液，将外植体 接入表面铺有一层滤纸的共培养基上，24。C暗培养3d。
共培养完成后，外植体接入筛选培养基中进行分化培养，每2 3w继代一 次。出现再生绿芽后，将其切下转入生根培养基中生根。
当抗性苗的根生长到2 3cm长时，洗净根部的琼脂，水培炼苗2 3d，移 栽到营养钵，于自然条件下生长。 表l:根癌农杆菌介导的烟草遗传转化用培养基
培养基名称成分
基本培养基MSB (MS无机+B5有机+7g /L琼脂+30 g/L蔗糖，pH5.8)
预培养基MSB+2.0 mg/L 2,4-D
共培养培养基MSB+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA
筛选培养基MSB+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA +500 mg/L Cef十100 mg/L Kan
生根培养基MSB+300 mg/L Cef+150 mg/L Kan
MS: Murashige & Skoog， 1962 B5: Gamborg， 1986 Gelrite: Sigma，货号G1910 3、转化植株的鉴定
组织化学鉴定转化植株在生根培养基上生根并长到2~3cm时，将幼苗 从培养瓶中取出洗净，转入三角瓶上水培炼苗2~3d。同时，取一小块叶片和 一小段根进行GUS染色。GUS阳性的植株直接移栽到营养钵中。
PCR鉴定待烟草植株移栽成活并生长到一定大小，取0.5g叶片提取烟 草基因组DNA，以GhDWF4-l (SEQ ID NO.5)和GhDWF4-2 (SEQ ID NO.6) 进行扩增。25 |LiL的扩增体系含2.5 |uL 10x PCR buffer， 2 |iiL 2.5mmol/L dNTPs， 1.5 |uL 25醒ol/L MgC12，各1 |LiL引物GhDWF4-KSEQ ID NO,5)和GhDWF4-2 (SEQIDN0.6) (5 |imol/L)， lUTaqDNA聚合酶，1 ^L烟草基因组DNA (50ng)。扩增程序为94。C， 5 min; 94。C， 30 sec， 56°C， 30 sec， 72。C， 1.5min, 35个循环；72。C延伸10min。用P6-GhDWF4载体质粒作阳性对照， 以水和野生型烟草基因组DNA作阴性对照。实施例三检测GhDWF4基因在转基因烟草中的表达水平
按照实施例一中提取棉花RNA的方法，提取转基因烟草和野生型烟草叶 片的总RNA，并合成cDNA—链。用Real-Time PCR方法分析转基因烟草中 目的基因的表达，PCR在quantitative real-time PCR仪上进行，在25 的反 应体系中包括12.5pL MIX buffer (包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和 MgC12， quantitative real-time PCR试剂盒提供，Bio-Rad)。 GhDWF4基因用引 物D4-500 (SEQIDNO.9)禾B GhDWF4-2 (SEQIDNO.6)扩增，内标采用烟 草ACTIN基因(登录号AB158612)，引物为actin-1 (SEQ ID N0.7)和actin-2 (SEQIDN0.8)。扩增程序为94。C预变性3min; 94°C， 30 sec; 56°C， 30 sec; 72°C， 30sec;预设循环数为35。在运行quantitative real-time PCR前，用相同 引物和模板在相同的温度变化程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩 增产物是单带。定量PCR分析的结果表明(^Z)『i^基因已在检测的转基因烟 草中表达，不同植株之间在表达量上有一定差异。
实施例四转基因烟草与野生型烟草的表型比较
1、 转基因烟草与野生型烟草株高和叶片的比较
超量表达G/lD『F4基因的转基因烟草和野生型烟草同时种植在培养钵 中，经过正常的栽培管理，植株进入成熟期后，观测转基因烟草和野生型烟草 的生长状况。观察结果表明，在盛花期转基因烟草株高明显高于野生型植株， 转基因烟草叶片形态发生较大变化，主要表现在烟草叶形变得狭长，叶片宽度 没有明显变化，而叶片长度要长于野生型，最终表现为叶片面积比野生型大。 从植株形态上来看，超量表达GAZ)『F4的转基因烟草显得较舒展，叶柄比野 生型的长，株高和节间长均长于野生型。
2、 转基因烟草与野生型烟草果实发育的比较
超量表达GM)『i^基因能够促进转基因烟草的营养生长。为了弄清 GAZ)『F4对烟草生殖器官发育的影响，观测了超量表达GW)『/^基因的转基 因烟草的果实大小。取转基因烟草相似部位的果枝，观察果枝上的果实大小， 发现转基因烟草果实比野生型的大，果柄也比野生型的长。
3、 超量表达GAZ)Wi^的转基因烟草与野生型烟草幼苗的比较超量表达GhDWF4的转基因烟草TO代植株收获种子后，用摇瓶培养Tl 代烟草种子，观察T1代幼苗的表型变化，野生型烟草种子同时培养作为对照。 在28i:， 110rpm的条件下培养5天后开始观察烟草表型变化，发现超量表达 GhDWF4的转基因烟草Tl代幼苗下胚轴生长速度要比野生型的快。数据统计 也表明GhDWF4表达水平的增加促进了烟草下胚轴的生长。
实施例五转基因烟草叶片中BRs的提取和活性测定
GAi)『F4基因是一个合成高生理活性油菜素内酯类物质的关键酶。为了 了解在超量表达G/LD『F4的转基因烟草中，高生理活性BRs的含量是否提高， 提取了转基因烟草和野生型烟草叶片中的BRs，检测提取物的生理活性。结果 表明，转基因烟草叶片中BRs的生理活性明显高于野生型，说明G/zZ)『F4表 达水平的提高增加了烟草叶片中高生理活性BRs的含量。具体实施方案如下
1) 烟草叶片中高生理活性BRs的提取
烟草叶片中BRs的提取参照已报道的标准程序进行取烟草叶片材料，
液氮速冻，研磨成粉末，用提取液(甲醇氯仿=4:1)在4'C浸泡过夜。
过滤，残渣再次用提取液抽提三次。合并浸提液，10000rpm， 5。C离心10min， 取上清35'C真空浓縮。用水和氯仿抽提三次，直至水相中杂质很少，取氯仿 相过滤真空蒸干。提取物再次用正己烷和80%甲醇萃取三次，取甲醇相浓縮蒸 干。最后的提取物用甲醇溶解保存于-2(TC备用。
2) 提取物中活性BRs的含量比较
为了比较单位重量的烟草材料中活性BRs的含量，先将前面的提取物按 照取材时所称的重量进行稀释后备用，例如取材为80g溶解的最终体积为800 lnL，取材为100g溶解的最终体积为1000 nL。将稀释后的提取物取10pL再次 稀释到lmL，此时的稀释液用来进行下面的实验。
将野生型烟草种子摇瓶萌发，每瓶加入40ml蒸馏水，同时加入4pL提取 物。同时以甲醇作为阴性对照和100nM的epi-BL作为阳性对照。120rpm,28 x:摇瓶培养7天后，观察统计烟草下胚轴长度。09P103581—ST25. txt
SEQUENCE LISTING
<110>西南大学
<120>棉花油菜素内酯合成酶基因的用途及含有其的表达载体
〈130> 09P103581
<160> 9
〈170> Patentln version 3. 5
<210〉 1
〈211〉 1657
<212> 隨
<213〉 Gossypi咖hirsut咖 <220>
<221> misc—feature
<222> (1).,(1657)
<223>棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的核苷酸序列(cDNA)
<■〉 1
tttaagteigctgccgcaagtgactctaaatactccagaaataggatctccttttc犯gaa60
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cgatacggat gaagcctttg ccttcccttt tgtcgacttc cctaaaggcc tacccatcag 1620 agtcttcaaa tcttaaaaca gacatctcag caggcag 1657
<210> 2
<211> 3278
<212〉 ■
〈213〉 Gossypium hirsutum <220〉
<221> misc—feature
〈222〉 (1) (3278)
<223〉棉^油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的核苷酸序列(gGhDWF4-1)
<400> 2
cttgga犯gctaagct犯gca犯gcaaa犯agtgggagtgggaaaggatt60
gaagaagaaa咖gggtcggtctccatgcctgactcagagcctattttcttgcttctacc120
atctattttatctttgattctgttcttcattctcatcaagagaaagcaaagaaggtataa180
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cgagtgcagttacccgagaagcattggtggcattcttgggaaatggtcgatgctggtttt540
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gctgaggactcatcttttgagagaagtggagaaacatactttgcttgttctaaatacttg660
g3朋gagaagtgcatattttcagctcEiggaaaggttttaa肌犯tatgag720
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tttaaatttacctggaactgcatscagaaaagccttacaagtaatgaaaggagttggtct960
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tgggtttgacagtctcgatcaacaatcctgaaatttattgaaaaga幼atgg幼gtaagg1080
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ttaaagcattctaatctttccacagagcaaatccttgacttgattttgagcttgcttttt1200
gctggacatgagacttcctcggtagccataaccttagccatctacttcttgcc站gttgt1260
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aaaacctgttctttttcttttttaattttttctggggggtggtgg犯aag gtmgatat1800
tCC3tgtgggtgg犯agtgcttccagtgattgcagcagtgcacttggatc cctgtctttt1860
tgaccgccctcaactcttcaatccatggcgatggcaggtcagtcagtcac cctatactct1920
ctcttttttctttttgtaatttttagatatttttttttcaaatagaattt taactctttt1980
ttctaaacgaaaataacattasateiaEitttggtcaatttttatcactata ttttgtaacg2040
aacttggattatgttgtcttcgaagaagacag,tgaagtctatgttaa caaaaatatg2100
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ggtggtgtacgcccaattaattattaagattatctaataaacaatttctt ttggacatta2280
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taaccttttctttcttttttttcttttaagaaat 11 aat ttttagcaaaa catggacaca2400
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ttgattactgtcgtatccggataaggcaagtaagtatagg gaagatatct gaaagataag2520
ctatgatccaacggatcctctaaacccat,gaactgtcatcatcattaacc ccccttcttg2580
caatactgtacggacgtaggcccccatcaatggaaaagaa atttgatgcg gcaaaaccca2640
ggcagtaactt c aaasitggtaaagcaagccactctcgtgcgtgtggg gggttttaag2700
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cagtgtggtcgggttccagcgtttcctttttccggtgggtcaatcacagt tcatagctac2820
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cagcaattacttcatgccgttcgggggaggaccacggcta tgtgcaggaa cagaactggc3120
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cgatacggatgaagcctttgctttcccttttgtcgacttccctaaaggcc tacccatcag3240
agtcttcaaat c 11 aaaac agacatctcagcaggcaga3278
〈210〉 3
〈211〉 3440
<212> 隱
<213〉 Gossypium hirsutum 〈220〉
<221〉 misc一feature
<222〉 (1).「(3440)
<223〉棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的核苷酸序列(gGhDWF4-2)
〈400〉 3
cttgga犯gctaagctaagc3gtgggagtggg犯aggaU60
aaagggtcggtctccatgcctgactcagagcctattttcttgcttctatc120
atctattttatctttgattctgttcttcattctcatcaagagaaagcaaagsaggtat犯180
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犯attcgacatttttcaggt&tgggEl￡lt3tctacaaatcg犯tttgtttggtgagaagac420
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tttatctttttctagaaggaaaggaatttgattttggttttggtmgtt780
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gatgattacagttcactcaatgtgtaagctctcacttttaaattt33ctt1500
ttgtttacatcta犯catt3ttttgtgatgttcatttcacttaagttatttttttttcU1560
tatatataggttattaacgagacacttaggcttggtaatgtcgtcagatttctccacaga1620
aaagctctcaatataaaggtgagtttaaaaC3tgct肌tactttaatttc1680
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tcttttctatttttttctggCggtggtggElaaaggttatgatattccatgtgggtggaaa1800
gtgcttccagtgattgcagc3gtgcwttggatccctgtctttttgaccaccctcaactc1860
ttcaatccatggcgatggcaggtcagtcagtcaccctatactctctctttutctttng1920
taatttttagattttattcttcttttttaaa犯犯犯tagaatttt犯cccttttttcta1980
aatttggtcaatttttatcactatattttgtaacgaactt2040
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ggcagc卿ggataggtggtgtactcacaattaattatct犯taaata犯ttcttttgga2400
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gcgtttcctttttccggtgggtcaatcgcagttcatagctaca_cagtctgctt犯犯caa3000
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attcgggggaggaccacggctatgtgcaggaaatggcggt3300
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tgccttcccttttgtcgacttccct犯aggcctacccatcagagtcttca3atctt犯333420
cagacatctc3gcaggC3ga3440
<210〉 4
〈211〉 485
<212〉 PRT <213>人工序列
<220>
<221> MISC—FEATURE
〈222〉 (l)..(鄉)
<223> GhDWF4基因编码的蛋白质序列
<400> 4
Met Pro Asp Ser Glu Pro lie Phe Leu Leu Leu Pro Ser lie Leu Ser
15 —
10
15
Leu lie Leu Phe Phe lie Leu lie Lys Arg Lys Gin Arg Arg Tyr Asn
20 25
30
Leu Pro Pro Gly Asn Met Gly Trp Pro Phe Leu Gly Glu Thr lie Gly
35 40
45
Tyr Leu Arg Pro Tyr Ser Ala Thr Ser Val Gly Glu Phe Met His Gin
50 55
60
His lie Ser Arg Tyr Gly Asn lie Tyr Lys Ser Asn Leu Phe Gly Glu
65 70
75
80
Lys Thr lie Val Ser Ala Asp Ala Gly Leu Asn Lys Phe lie Leu Gin 85 90 95
Asn Glu Gly Arg Leu Phe Glu Cys Ser Tyr Pro Arg Ser lie Gly Gly
100 105
110
lie Leu Gly Lys Trp Ser Met Leu Val Leu Val Gly Asp Met His Arg09P103581—ST25. txt 115 120 125
Asp Met Arg lie lie Ser Leu Asn Phe Leu Ser Asn Ala Arg Leu Arg 130 135 140
Thr His Leu Leu Arg Glu Val Glu Lys His Thr Leu Leu Val Leu Asn
145
150 155 160
Thr Trp Lys Glu Lys Cys lie Phe Ser Ala Gin Asp Glu Ala Lys Lys 165 170 175
Phe Thr Phe Asn Leu Val Ala Lys Asn lie Met Ser Met Asp Pro Gly 180 185 190
His Pro Glu Thr Glu Gin Leu Lys Lys Glu Tyr Val Thr Phe Met Lys 195 200 205
Gly Val Val Ser Ala Pro Leu Asn Leu Pro Gly Thr Ala Tyr Arg Lys 210 215 220
Ala Leu Gin Ser Arg Ser Thr lie Leu Lys Phe lie Glu Lys Lys Met
225
230 235 240
Glu Val Arg lie Arg Lys Met Lys Glu Gly Lys Glu Asn Ser Glu Glu 245 250 255
Asp Asp Leu Leu Glu Trp Val Leu Lys His Ser Asn Leu Ser Thr Glu 260 265 270
Gin lie Leu Asp Leu lie Leu Ser Leu Leu Phe Ala Gly His Glu Thr 275 280 285
Ser Ser Val Ala lie Thr Leu Ala lie Tyr Phe Leu Pro Gly Cys Pro 290 295 300
Leu Ala lie Gin Gin Leu Arg Glu Glu His Leu Glu Val Ala Arg Ala
305
310 315 320
Lys Asn Gin Ser Gly Glu Thr Glu Leu Asn Trp Asp Asp Tyr Lys Lys 325 330 335
Met Glu Phe Thr Gin Cys Val lie Asn Glu Thr Leu Arg Leu Gly Asn 340 345 350
Val Val Arg Phe Leu His Arg Lys Ala Leu Lys Asp lie Arg Tyr Lys 355 360 365
Gly Tyr Asp lie Pro Cys Gly Trp Lys Val Leu Pro Val lie Ala Ala 370 375 380
Val His Leu Asp Pro Cys Leu Phe Asp His Pro Gin Leu Phe Asn Pro 385 390 395 400
Trp Arg Trp Gin Gin Asn Asn Gly Ser Arg Gly Ala Gly Thr Ala Thr 405 410 41509P103581—ST25. txt Ser Ser Ala Ser Ser Ser Asn Tyr Phe Met Pro Phe Gly Gly Gly Pro 420 425 430
Arg Leu Cys Ala Gly Thr Glu Leu Ala Lys Leu Glu Met Ala Val Phe
435
440 445
lie His His Leu Val Leu Asn Tyr Gin Trp Glu Leu Ala Asp Thr Asp 450 455 460
Glu Ala Phe Ala Phe Pro Phe Val Asp Phe Pro Lys Gly Leu Pro lie
465 470
Arg Val Phe Lys Ser 485
〈210〉 5
〈211〉 21
<212> 腿 <213>人工序列
<220>
<221〉 misc一feature
<222> (l)..加
<223> 扩增GhDWF的引物GhDWF4-l
<400〉 5
tttaagtagc tgccgcaagt g
<210〉 6
<211> 21
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉
<221> misc_feature <222> (1)..(21)
<223> 扩增Gh匿4的引物GhDWF4-2 <400> 6
ctgcctgctg agatgtctgt t
475 480
<210> 〈211〉 <212> <213>
<220> 〈221> <222> <223>
21 DNA
人工序列
misc—feature (1).7(21)
扩增GhDWF4的引物actin-1
<400> 7
tggatcttgc tggtcgtgat c
〈210〉 8
<211〉 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (l)..加
<223> 扩增GhDWF4的引物actin-2
21
21
21
2409P103581—ST25. txt
<400〉 8
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2权利要求
1、棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4在提高农作物产量和改善农作物品质性状中的应用，其中所述棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4具有下述核苷酸序列之一1)如SEQ ID NO.1所示的cDNA序列；2)如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的gDNA序列；3)与1)或2)所述的核苷酸序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；或4)在高严谨条件下能与1)或2)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；其中所述高严谨条件为在6×SSC或6×SSPE，0.1％SDS，2×Denhardt溶液于65℃条件下杂交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液于5℃条件下洗膜。
2、 棉花油菜素内酯合成酶基因G/^『F4在农作物育种或林木育种中的应用，其中所述棉花油菜素内酯合成酶基因G/LD『F4具有下述核苷酸序列之一1) 如SEQ IDNO.l所示的cDNA序列；2) 如SEQ ID N0.2或SEQ ID NO. 3所示的gDNA序列；3) 与1)或2)所述的核苷酸序列具有85%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；或4) 在高严谨条件下能与1)或2)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中所述高严谨条件为在6XSSC或6XSSPE， 0.1%SDS， 2XDenhardt溶液于65。C条件下杂交；在0.1XSSC， 0.1。/。SDS溶液于5。C条件下洗膜。
3、 棉花油菜素内酯合成酶基因G/ Z)『^/在制备油菜素内酯类物质中的应用，其中所述棉花油菜素内酯合成酶基因G/LD『i^具有下述核苷酸序列之一1) 如SEQ IDNO.l所示的cDNA序列；2) 如SEQ ID N0.2或SEQ ID NO. 3所示的gDNA序列；3) 与1)或2)所述的核苷酸序列具有85%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；或4) 在高严谨条件下能与1)或2)所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中所述高严谨条件为在6XSSC或6XSSPE， 0.1%SDS， 2XDenhardt溶液于65。C条件下杂交；在0.1XSSC， 0.1。/。SDS溶液于5'C条件下洗膜。
4、 根据权利要求l、 2或3所述的应用，其中所述棉花油菜素内酯合成酶基因GAD『/^具有与1)或2)所述的核苷酸序列具有85%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
5、 含有棉花油菜素内酯合成酶基因G/LD『/^和启动子的植物表达载体，其中所述启动子为增强型、组成型、组织特异型和/或诱导型启动子。
6、 根据权利要求5所述的植物表达载体，其具有如图l所示的结构。
7、 根据权利要求5所述的植物表达载体，其具有如图3所示的结构。
8、 一种转化体，以权利要求5所述的植物表达载体转化宿主获得。
9、 一种含有棉花油菜素内酯合成酶基因GW)FFi^的转基因植物的制备方法，包含下述步骤1) 将G/LDfTi^基因与启动子可操作地连接；2) 构建含有G/zZ)『i^基因与启动子的植物表达载体；3) 用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；4) 用所述转化体转化植物，获得转基因植物。
全文摘要
本发明公开了棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的新用途。在植物中表达GhDWF4基因可以促进植物下胚轴的伸长，增加植物叶片的面积和果实产量，促进植物生长。可用于农作物育种和林木育种，增加转基因植物的营养生长，提高植物的生物产量。本发明还提供包含GhDWF4基因的植物表达载体和其转化体；并提供制备含有该基因的转基因植物的方法。生产的转基因植株营养生长和生殖生长得到促进，植株高度增加，果实产量增加。
文档编号C12N5/10GK101519662SQ20091010627
公开日2009年9月2日 申请日期2009年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者磊 侯, 宋水清, 李先碧, 李德谋, 明 罗, 肖月华, 胡明瑜, 炎 裴 申请人:西南大学