专利名称：一种利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法
技术领域：
本发明属于生化工程和酶工程技术领域。具体涉及一种利用动物肝脏微粒 体酶合成7-脱氢胆固醇的方法
背景技术：
维生素D3是人与动物生长、发育、繁殖、维持生命和保持健康必不可少的 一种脂溶性维生素。它的主要作用是调节钙磷代谢，促进肠内钙磷吸收和骨质 钙化，维持血钙和血磷的平衡，可用作药物制剂、食品和饲料添加剂等，在临 床上还可用于治疗佝偻病、老年骨质疏松、甲状腺机能减退症等。目前维生素D3 是采用光化学法生产，即以7-脱氢胆固醇(7-DHC)为原料，经紫外照射后转变 为维生素D3前体(PreD3)，再热异构化而得。作为主生产原料的7-脱氢胆固醇， 可采用多种不同的原料和工艺路线，通过化学合成法制备。如可从羊毛脂提取 胆固醇，再进行酯化、氧化生成7-酮胆固醇酯，后者可还原成7 a和7 0-羟基 胆固醇酯，再通过消除反应生成7-脱氢胆固醇。我国中科院理化所张建成等人 的工艺路线，则以胆固醇为基本原料，经氧化、加成等一系列反应得到7-脱氢 胆固醇。
目前，无论采用何种化学合成法制备原料7-脱氢胆固醇，都有反应步骤长， 总产率不高，副反应多，条件难控制，效率偏低，成本高等缺点，从而影响维 生素D3的生产成本、销售价格、市场推广。因此，研究开发一种工艺路线短、 成本低的7-脱氢胆固醇生产方法变得十分迫切和必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的 方法，它能够克服现有技术中的不足之处,縮短反应步骤，提高总产率，减少副 反应，条件易于控制，效率高，成本低。
本发明的技术方案如下
一种利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法，该方法包括以
下步骤
(1) 微粒体酶液的制备
将切成块状的新鲜肝脏放入pH 7. 3、 0. 1 mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液 中，在4X:条件下用组织匀浆机匀浆，过滤，滤液进行超声波细胞破碎，随后于 4 。C， 12000 r.min—、 10 min离心分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2) 酶促转化反应
将所述微粒体酶液和促进剂混匀，静置15min，加入一定量的角鲨烯或羊 毛甾醇、还原型辅酶II、三磷酸腺苷、烟酰胺、MgCL2等混合物，反应5 h，得 到一种酶促转化反应液。
(3) 皂化反应
步骤(2)反应液加入5 ml 15% K0H-乙醇溶液，振荡反应1 h，得到一种 皂化反应液。
(4) 萃取
步骤(3)反应液用有机溶剂萃取，萃取剂与反应液体积比为6:1，萃取温 度5CTC，萃取时间1 h，萃取结束后，氮气或减压条件下浓縮。
所述步骤(1)中的肝脏为猪肝、牛肝或羊肝等动物肝脏，缓冲溶液为 O.O卜0. lmol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液，超声波处理条件为功率150-400 W、温度4_35 。C、时间5-40 min;
所述步骤(2)中混合物是1-100 ug/ml的角鲨烯或羊毛甾醇、0. 1-10 mmolZL 的还原型辅酶n、 0. 1-10咖ol/L的三磷酸腺苷、1-100mmol/L的烟酰胺、1-10
咖0l/L MgCL2;
所述步骤(3)中皂化反应是加入15% K0H-乙醇溶液，在回流或密闭条件 下进行，在6(TC振荡反应i h;
所述步骤(4)中萃取剂石油醚加热到30-6CTC，萃取剂与皂化反应液体积 比为4:1-8:1，萃取时间1 - 4 h，萃取2-3次。萃取后有机相在40°C氮气 或减压条件下浓縮。
本发明的有益效果
本发明从动物肝脏中提取微粒体酶，以角鲨烯或羊毛甾醇为原料，生物合 成7-脱氢胆固醇的方法，简单易行，既可以降低维生素D3生产成本，又减少环 境污染。
图1为对照样品的高效液相色谱图。
图2 -图6为不同条件下酶促转化反应液高效液相色谱图。
图7为标品7-脱氢胆固醇高效液相色谱图。
实施例1 (1)微粒体酶液的制备
将50 g切成块状的新鲜猪肝脏放入pH 5、 0.01 mol/L的谷胱甘肽磷酸 缓冲溶液中，在4°C条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超声 波细胞破碎仪中，处理条件为功率400 W、温度4 °C、时间5 min。随后离 心(4 。C， 12000 r.min"， 10 min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。(2) 酶促转化反应
将得到的20 ml微粒体酶液添加20 ml lug/ml角鲨烯、2 ml 2 mmol/L还 原型辅酶II 、 1 ml 5腦ol/L三磷酸腺苷、2 ml 20腿ol/L烟酰胺，反应5 h，得到一种酶促转化反应液。
(3) 皂化反应
将所述酶促转化反应液加入5 ml 15% K0H-乙醇溶液，3(TC振荡反应2 h， 得到一种皂化反应液。
(4) 萃取
将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为4: 1， 萃取温度30 °C，萃取时间1 h。萃取结束后，有机相在4(TC氮气或减压条件 下浓縮、检测。色谱条件为C18柱5nm， 250 mmX4.6rran，流动相乙腈-异 丙醇为7 : 3，柱温3CTC，流速l.O mL/min，检测波长280 nra，结果参见附 图2。
实施例2
(1) 微粒体酶液的制备
将50 g切成块状的新鲜猪肝脏放入pH 6.5、 0.05 mol/L的谷胱甘肽磷 酸缓冲溶液中，在4°C条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超 声波细胞破碎仪中，处理条件为功率150 W、温度35 °C、时间40 min。随 后离心(4 。C， 12000 r.min-1， 10min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2) 酶促转化反应
将得到的20 ml微粒体酶液添加20 ml 40ug/ml角鲨烯、2 ml 1 mmol/L还 原型辅酶II 、 1 ml 2.5mm。l/L三磷酸腺苷、2 ml 30 mmol/L烟酰胺，反应5 h ，得到一种酶促转化反应液。(3) 皂化反应
将所述酶促转化反应液加入5 ml 15% K0H-乙醇溶液，7(TC振荡反应1 h， 得到一种皂化反应液。
(4) 萃取
将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为6: 1， 萃取温度60 r,萃取时间4 h。萃取结束后，有机相在4(TC氮气或减压条件 下浓縮、检测。色谱条件为C18柱5um， 250腿X4.6醒，流动相乙腈-异 丙醇为7 : 3，柱温30°C，流速l.O mL/min，检测波长280 mn， 结果参见附 图3。
实施例3
(1) 微粒体酶液的制备
将50 g切成块状的新鲜羊肝脏放入pH 9、 0.05 mol/L的谷胱甘肽磷酸 缓冲溶液中，在4°C条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超声 波细胞破碎仪中，处理条件为功率300 W、温度4 °C、时间20 min。随后离 心(4 °C， 12000 r.min"， 10 min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2) 酶促转化反应
将得到的20 ml微粒体酶液添加20 ml 40 ug/ml角鲨烯、2 ml 2誦ol/L 还原型辅酶II 、 1 ml 5 mmol/L三磷酸腺苷、2 ml 40 mmol/L烟酰胺，1 ml 1 mmol/L MgCU，反应5 h，得到一种酶促转化反应液。
(3) 皂化反应
将所述酶促转化反应液加入5 ml 15% K0H-乙醇溶液，60。C振荡反应2 h，
得到一种皂化反应液。
(4) 萃取
8将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为8: 1，
萃取温度40 °C，萃取时间4 h。萃取结束后，有机相在4(TC氮气或减压条件 下浓縮、检测。色谱条件为C18柱5um， 250 mmX4.6mm，流动相乙腈-异 丙醇为7 : 3，柱温30°C，流速l.O mL/min，检测波长280 nm，结果参见附 图4。
实施例4
(1) 微粒体酶液的制备
将50 g切成块状的新鲜牛肝脏放入pH 8、 0.1 mol/L的谷胱甘肽磷酸缓 冲溶液中，在35°C条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超声 波细胞破碎仪中，处理条件为功率250 W、温度4 °C、时间30 min。随后离 心(4 。C'12000 r.min"， 10 min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2) 酶促转化反应
将得到的20 ml微粒体酶液加与1 ml 1 mraol/L促进剂混匀，静置15 min， 再添加20ml 100ug/ml角鳘烯、2 ml 10誦ol/L还原型辅酶II 、 1 ml 10mmol/L 三磷酸腺苷、2 ml 100 mmol/L烟酰胺，反应5 h，得到一种酶促转化反应液。
(3) 皂化反应
将所述酶促转化反应液加入5 ml 15% K0H-乙醇溶液，70。C振荡反应2h， 得到一种皂化反应液。
(4) 萃取
将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为7: 1， 萃取温度60 'C，萃取时间4 h。萃取结束后，有机相在4(TC氮气或减压条件 下浓缩、检测。色谱条件为C18柱5iiin， 250mmX4.6mm，流动相乙腈- 异 丙醇为7 : 3，柱温30°C，流速l.O mL/min，检测波长280 nm， 结果参见附图5。
实施例5
(1) 微粒体酶液的制备
将50 g切成块状的新鲜猪肝脏放入pH 7. 3、 0. 1 mol/L的谷胱甘肽磷酸 缓冲溶液中，在4°C条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超声 波细胞破碎仪中，处理条件为功率300 W、温度4 °C、时间20 min。随后离 心(4 °C， 12000 r.mirT1， 10 min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2) 酶促转化反应
将得到的20 ml微粒体酶液加与1 ml 1 mmol/L促进剂混匀，静置15 min， 再添加20 ml 30 ug/ml角鲨烯、2 ral 2誦ol/L还原型辅酶II 、 1 ml 5 mmol/L 三磷酸腺苷、2 ml 30腿ol/L烟酰胺、1 ml 10咖ol/L MgCL2，反应5 h，得 到一种酶促转化反应液。
(3) 皂化反应
将所述酶促转化反应液反应液加入5 ml 15% K0H-乙醇溶液，6CTC振荡反 应1 h，得到一种皂化反应液。.
(4) 萃取
将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为6: 1， 萃取温度40 °C，萃取时间1 h。萃取结束后，有机相在4CTC氮气或减压条件 下浓縮、检测。色谱条件为C18柱5um， 250誦X4.6mm，流动相乙腈-异 丙醇为7 : 3，柱温3(TC，流速l.O mL/min，检测波长280 nm， 结果参见附 图6。
权利要求
1、一种利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)微粒体酶液的制备将切成块状的新鲜肝脏放入pH 5-9、0.01-0.1mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液中，在4-35℃条件下用组织匀浆机匀浆，过滤，滤液进行超声波细胞破碎，处理条件为功率150-400W、温度4-35℃、时间5-40min，随后于4℃，12000r·min-1，10min离心分离，取上清液，得到所述微粒体酶液，(2)酶促转化反应将所述微粒体酶液和促进剂混匀，静置15min，加入1-100ug/ml的角鲨烯或羊毛甾醇、0.1-10mmol/L还原型辅酶II、0.1-10mmol/L三磷酸腺苷、1-100mmol/L烟酰胺、1-10mmol/L MgCL2反应5h，得到一种酶促转化反应液，(3)皂化反应将步骤(2)制备得的反应液加入5ml 10-15％KOH-乙醇溶液，在30-70℃振荡反应1-2h，得到一种皂化反应液，(4)萃取将步骤(3)制备得的皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与皂化反应液体积比为4∶1-8∶1，萃取温度30-60℃，萃取时间1-4h，萃取结束后，在氮气或减压条件下浓缩，得到7-脱氢胆固醇。
2、 根据权利要求1所述的利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇 的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的新鲜肝脏为猪肝、牛肝或羊肝。
3、根据权利要求1所述的利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇 的方法，其特征在于，歩骤(l)中的肝脏为猪肝，缓冲溶液为0. lmol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶 液，匀浆温度为4'C，超声波处理条件为功率300W、温度4。C、时间20min;步骤(2)中混合物是30ug/ml的角鲨烯或羊毛甾醇、2 mmol/L的还原型 辅酶II、 5 mraol/L的三磷酸腺苷、30 mmol/L的烟酰胺、10隱ol/L MgCL2;步骤(3)所述皂化反应是加入15% K0H-乙醇溶液，在回流或密闭条件下 进行，在6(TC振荡反应1 h;步骤(4)中萃取剂石油醚加热到5(TC，萃取剂与反应液B体积比为6:1， 萃取时间为2 h，萃取2-3次，萃取后有机相在40°C氮气或减压条件下浓縮。
全文摘要
本发明属于生化工程和酶工程技术领域，具体涉及一种利用猪肝、牛肝或羊肝等动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法，包括以下步骤(1)微粒体酶液的制备；(2)酶促转化反应；(3)皂化反应；(4)萃取。利用本发明可以生产出与化学合成完全一致的7-脱氢胆固醇。并且工艺简单易行，既可以降低维生素D<sub>3</sub>生产成本又减少环境污染。
文档编号C12P33/00GK101575633SQ200910113920
公开日2009年11月11日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者何鑫平, 吴孔阳, 夏小斌, 超 康, 张云开, 李湘萍, 李灿明, 梁智群, 晟 汪, 陈桂光, 黄时海 申请人:广西大学