专利名称：：固氮嗜麦芽窄食单胞菌株c4y41及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明专利属于生物
技术领域：
，涉及一株固氮嗜麦芽窄食单胞菌株C4Y4及其应用。
背景技术：
：目前全世界约有5000万hm2的热带人工林，且每年增加300万hm2左右(Binkleyetal.，2004)。其中，桉树(Eucalyptussp.)占热带人工林总面积的40%左右，木材产量占50%以上，正发挥着越来越重要的作用。中国的桉树人工林面积已达170万hi^，桉树已成为我国三大造林树种之一，造林面积仅次于印度和巴西，居世界第三位。桉树速生、高产、优质，最优杂交家系年平均生长量可达69.8mVhm2，最优无性系年平均生长量达64.8m3/hm2。桉树产业的发展带动了交通运输业、造纸、人造纤维、人造板工业等的发展，同时为社会提供了大量的劳动就业机会，为社会稳定起到了重要的作用。桉树人工林也存在很多问题，例如(1)生产力问题。桉树人工林2、3、4代木材蓄积量分别比第l代下降了20.9%，38.7%和50.5%;生物量分别下降了19.6%，26.7%和44.6%。可见，桉树人工林的地力衰退问题是相当严重的。许多桉树林轮伐期只需45年。这意味着被带走的养分越来越多。除了过度收获外，全垦整地和不合理施肥也会导致桉树人工林地力衰退。(2)水分问题。20世纪80年代以来，桉树人工林是否较其他树种人工林消耗更多的土壤水分成为关注的焦点。对比观测地下水位，发现桉树林地下水位深911m、裸地为14m、混交林为34m。桉树是不具有固氮自肥能力的非豆科植物，目前桉树人工林的速生高产完全依赖施用N、P、K复合肥，导致土壤微量元素缺乏，土壤肥力降低，出现生产力下降；大量施用化学肥料，导致土壤板结，土壤结构被破坏，林地保水能力差而出现的水分问题。这是实现桉树可持续发展的最大障碍。然而通过人工接种固氮菌，建立桉树根际联合固氮体系，使原本不能共生固氮的桉树获得固氮能力，将空气中的分子态氮变为可供桉树吸收利用的氨态氮，促进桉树生长。这对于日趋贫瘠的桉树林地土壤改良，地力保持具有重要意义和应用前旦豕。
发明内容本发明的目的是提供经过筛选、具有高效固氮活性、对桉树苗木有明显促生作用的一株固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41新菌种。本发明还有一个目的是提供该菌株菌液的培养方法和应用于桉树苗木的接种方法，公开该菌株的应用。本发明人经过广泛的野外调查，发现罗汉松在自然界中普遍具有结瘤现象。且从罗汉松根瘤中分离出内生细菌，经过鉴定，其中的一些内生细菌具有固氮酶活性，用这些菌株接种后能促进苗木生长。为利用这些菌株接种植物、促进植物生长的应用奠定了基础。本发明人已作过广泛深入的研究，从非豆科植物罗汉松根瘤分离纯化获得内生细菌，对其生物学特性、生理生化特性、固氮结瘤能力、接种苗木促进生长等系统试验和检测。本发明所述的固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41已于2009年10月23日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址中国科学院微生物研究所)，保藏编号CGMCCNo.3349。—.固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41的分离从小叶罗汉松侧根上采集有根瘤的细根，用自来水冲洗干净后，用75%乙醇对根瘤表面进行消毒lmin，再用0.1%的酸性氯化汞消毒56min。将根瘤置于灭过菌的研钵中轻轻研磨。取汁液用划线法接种于已加刚果红的YMA培养基上，2『C培养2天左右，挑选不吸刚果红的菌落，重复划线筛选，然后根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘形状和菌落颜色的差别，挑选单菌落，经过光学显微镜检查得到所需的纯化完全的菌株。所述YMA培养基成分及含量为磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.lg，甘露醇10.0g，酵母膏0.4g，琼脂粉15g，水1000ml，自然p朋.8，121。C蒸汽灭菌20min。二.固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41的性质1.形态特征在YMA培养基上，菌株的菌落为圆形、乳白色、产粘液、边缘整齐。有鞭毛，可运动。无芽孢。2.培养特性该菌的最适生长条件为pH=7.27.4，温度28°C。能利用广泛的碳源和氮源。3.生理特性经革兰氏染色反应镜检为阴性，呈直杆状。4.功能特性对固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y4116SrDNAPCR序列进行测定，测序结果如序列表所示，将菌株的16SrDNA序列在美国国立生物信息中心NCBI网上进行BLAST比较，找到与Genbank中同源性最高的相关序列，确定该菌株为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。用乙炔还原法检测菌株有固氮酶活性，其酶活为0.0190.030翻1.g-、h—、接种到桉树苗木能促进苗木生长，其中苗高增加2.2022.12%，地径增加22.1536.84%%，生物量增加40.4760.81%，叶绿素含量增加12.6834.07%，叶片硝酸还原酶活性增加21.8236.69%。具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实施例11、固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41菌株的分离、纯化从小叶罗汉松侧根上采集有根瘤的细根，用自来水冲洗干净后，用75%乙醇对根瘤表面进行消毒lmin，再用0.1%的升汞消毒56min。将根瘤连同细根置于灭过菌的研钵中研磨，加少量无菌水，研匀后加盖静置，澄清片刻。取上清液用划线法接种于已加刚果红的YMA培养基上，2『C培养2天左右，挑选不吸刚果红的菌落，重复划线筛选培养，然后再选择圆形、乳白色、产粘液、边缘整齐的菌落。显微镜检测有鞭毛，可运动，无芽孢。得到纯化完全的菌种。所述YMA培养基成分及含量为磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.lg，甘露醇10.0g，酵母膏0.4g，琼脂粉15g，水lOOOml，自然p朋.8，121。C蒸汽灭菌20min。2、固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41回接试验试验用Jenson液体培养基的成分及含量为磷酸氢钙1.Og，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，三氯化铁0.lg，水1升。每升加lml微量元素母液，所述微量元素母液含量如下硼0.05%，锰0.05%，锌0.005%，钼0.005%，铜0.002%。选饱满小叶罗汉松种子，先在75%的酒精中处理lmin，水洗56次，然后用0.1X的升汞表面灭菌6min，水洗67次，在无菌水中浸种过夜。将吸涨的种子移入无菌琼脂培养基中，25t:恒温培养催芽。将胚根长至45cm的小叶罗汉松幼苗转移到盛有Jensen培养液的封口三角瓶中，每瓶加2ml菌液，置于光照培养室中培养，以不加菌液为空白对照。对照与接种处理各设20个重复。接菌的小叶罗汉松幼苗培养至6个月时，采用日本产GA-9A气相色谱仪，用乙炔还原法测定幼苗根系的固氮酶活性，测得其酶活为0.0190.030nmol.g—、h—、实施例2用浸根法接种固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41对桉树苗木影响的试验本试验在位于南宁市郊广西国营高峰林场苗圃进行。试验用苗木来自广西国营高峰林场组培厂生产的广林巨尾桉9号(GLGU9)无性系组培瓶苗。把组培瓶苗移出瓶后，先用自来水将培养基清洗干净，再用甲基托布津消毒，滤干苗木体表的消毒液后备用。浸根法接种将以上处理的幼苗在移植到营养杯之前，用固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41菌液浸泡苗木根部2030min，然后定植到营养杯，共接种苗木5000株，营养杯土为黄心土。苗木按常规育苗方法管理。三个月后测定苗木平均株高、地径、生物量、叶绿素含量和叶片硝酸还原酶活性。结果见表l。表1浸根法接种C4Y41对桉树苗木的影响测定指标苗高(cm)地径C鹏)生物量(g/株)叶绿素含量(%)硝酸还原酶活性(4gN02/g.h)接种8.81.22.2490.49711.439CK7.20.91.3980.4349.390+CK(o/o)22.1225.0060.8114.6821.82从表1可见，接种C4Y41菌株能明显增加桉树苗木的株高、地径和单株生物量，促进了苗木的生长，还能提高苗木叶片的叶绿素含量和硝酸还原酶活性。方差分析结果表明，处理间的苗高差异达到极显著水平(F=7.5120**>FO.01=5.06);地径差异达到显著水平(F=5.0060*>FO.05=3.11);生物量差异达到极显著水平(F=15.3470**>FO.01=5.06);硝酸还原酶活性差异达到极显著水平(F=122.9640**>FO.01=5.06)。实施例3用喷雾法接种固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41对桉树苗木影响的试验本试验在位于南宁市郊南宁蔬菜研究所苗圃进行。5试验用苗木来自广西国营高峰林场组培厂生产的广林巨尾桉9号(GLGU9)无性系组培瓶苗。把组培瓶苗移出瓶后，先用自来水将培养基清洗干净，再用甲基托布津消毒，滤干苗木体表的消毒液后备用。喷雾接种法在苗木移植入营养杯后，用喷壶将固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41菌液均匀喷雾于定植在营养杯的桉树苗木上，共接种苗木2万株，6小时内不浇水。营养杯土为黄心土。苗木按常规育苗方法管理。三个月后测定苗木平均株高、地径、生物量、叶绿素含量和叶片硝酸还原酶活性。结果见表2。表2喷洒法接种C4Y41对桉树苗木的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>从表2可见，用喷洒法接种C4Y41菌株也能明显增加桉树苗木的株高、地径和单株生物量，促进了苗木的生长，还能提高苗木叶片的叶绿素含量和硝酸还原酶活性。方差分析结果表明，处理间的苗高差异达到极显著水平(F=6.1890**>F0.01=5.06);地径差异达到极显著水平(F=5.9330**>F0.01=5.06);硝酸还原酶活性差异达到极显著水平(F=67.4260**>F0.01=5.06)。实施例4用固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41和根瘤菌双接种对桉树苗木影响的试验本试验在位于南宁市郊小高峰苗圃进行。试验用苗木来自广西国营高峰林场组培厂生产的广林巨尾桉9号(GLGU9)无性系组培瓶苗。把组培瓶苗移出瓶后，先用自来水将培养基清洗干净，再用甲基托布津消毒，滤干苗木体表的消毒液后备用。双接种法用固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41和豆科植物根瘤菌液混合，配成混合菌液，然后再以浸根方法接种，共接种苗木2万株。营养杯土为黄心土。苗木按常规育苗方法管理。三个月后测定苗木平均株高、地径、生物量、叶绿素含量和叶片硝酸还原酶活性。结果见表3。表3C4Y41和根瘤菌双接种对桉树苗木的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从表3可见，用C4Y41和根瘤菌双接种也能明显增加桉树苗木的株高、地径和单株生物量，促进了苗木的生长，还能提高苗木叶片的叶绿素含量和硝酸还原酶活性。方差分析结果表明，处理间的地径差异达到极显著水平(F=18.072**>F0.01=2.96);生物量差异达到极显著水平(F=12.4830**>F0.01=2.96);叶绿素含量达到差异显著水平(F=2.6510*>F0.05=2.15);硝酸还原酶活性差异达到极显著水平(F=10.8670**>FO.01=2.96)。以上实施例2、3、4表明，在桉树育苗其间，接种固氮菌株C4Y41能明显促进苗木的生长，苗高、地径、生物量、叶绿素含量、硝酸还原酶活性均高于对照。叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，植物叶片叶绿素含量的多少影响到植物光合作用的效果，进而影响到植物体光合产物的积累以及植物自身的固氮效果，对植物生长起到非常重要的作用。硝酸还原酶是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对植物生长有着重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物吸收利用氮素等营养以及生长的指标之一。桉树幼苗接种固氮菌后，叶绿素含量明显增加，硝酸还原酶活性显著提高，因而促进了苗木的生长，接种的幼苗苗高生长、地径生长及生物量明显提高。可见固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41适合应用于桉树苗木的育苗。序列表〈110>广西大学〈120〉固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41及其应用〈160>1〈210>1〈211>1440〈212>DNA〈213>嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)〈220〉〈400〉1cggcgtacgtagcgttagatccgggctcgggccggcgteccaaggtegggteacctttgg60tttgtttttgagcggggaggaacteggaagaatcccctttgttttgtgggattttgtggg120gaaacttaaaateateaggcaatttttggttttgtgaaagcaggggatcttcggaccttg180cgcgattgaatgagccgatgtcggattegctegttggcggggteaaggcccaccaaggcg240acgatccgtegctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccaga300ctcctecgggaggcagcagtggggaatettggacaatgggcgcaagcctgatccagccat360accgcgtgggtgaagaaggccttcgggttgteaagcccttttgttgggaaagaaatccag420ctggtteatecccggttgggatgacggtecccaaagaateagcaccggctaacttcgtgc4807cagcagccgcggteatecga郷gtg咖gcgttectcgg皿ttectgggcgte皿gcgt540gcgteggtggttetttaagtccgttgtgaaagccctgggctcaacctggg皿ctgcagtg600gatectggatgacteg朋tgtggt卿gggtegcgg皿ttcctggtgteg660cgtegagatc3gg3gg朋C3tscatggcgaaggcagctecctggaccaacattgacactg7203ggC3Cg朋3gCgtgggg3gtegataccctggtegtccacgcccteaacg780atgcg朋ctgkatgttgggtgcaatttggcacgcagtetcg皿gcteacgcgttaagttc840gccgcctggggagtecggtcgc皿gactga皿ttgacgggggcccgcaca■3gCggtgg3gtatgtggatttaattcgatgc皿cgcg皿gaaccttecctggcccttgac960atgtcgag朋ctttccagag3tgg3ttggtgccttcgggaactcgaacac1020tggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggtt皿gtcccgcaacgagcgcaaccct1080tgtccttagttgccagcacgt皿tggtggg皿ctcteaggagaccgccggtg3C皿3CCg1140g郷朋ggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttecggccagggctacacacgtec1200tec朋tggteggg3C卿gggctgcaagccggcgacggteagccaatcccaga朋cccte1260tctcagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctegtaatcgc13203CtC3gC朋g朋g朋朋g朋tacgttcccgggccttgtctcaccgcccctgctccctect1380atctcccgcctcctcgccctccccccctttccgttcctcccaccgcctgc14408权利要求固氮嗜麦芽窄食单胞菌C4Y41(CGMCCNo.3349)菌株，其具有固氮和促进桉树苗木生长的能力。2.根据权利要求1所述的菌株的固氮酶活性为0.0190.030nmol.g—、h—、含有如序列表所示序列。3.权利要求1所述菌株在制备促进桉树苗木生长的生物菌肥中的应用。全文摘要固氮嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)C4Y41菌株及其应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3349。该菌株是对小叶罗汉松根瘤运用常规的微生物分离、纯化方法得到的一株新的固氮菌株，其固氮酶活性0.019～0.030nmol·g-1·h-1，接种桉树苗木后苗高增加2.20～22.12％，地径增加22.15～36.84％，单株生物量增加40.47～60.81％，叶绿素含量增加12.68～34.07％，硝酸还原酶活性增加21.82～36.69％。该菌可以作为制备促进桉树苗木生长的生物菌肥应用。文档编号C12R1/01GK101781628SQ200910114539公开日2010年7月21日申请日期2009年11月11日优先权日2009年11月11日发明者吕成群,黄宝灵申请人:广西大学