专利名称：：一种平菇多糖的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种平菇多糖的制备方法，尤其是一种采用发酵法生产平菇多糖的方法。
背景技术：
：平菇侧耳属一类真菌的总称,是古今中外著名的保健食用菌之一。平菇多糖是从平菇中提取、分离、纯化的^种多糖，能促进蛋白质、核酸的合成，提高机体生物免疫力。目前平菇多糖主要从子实体中提取，人工栽培平菇周期长，从中提取多糖工艺不容易控制，且成本高、产量低。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、设备投入小的平菇多糖的制备方法，使其生产胞外多糖时，在发酵罐内实现连续发酵，延长发酵时间，简化操作流程，提高多糖得率。为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案(1)斜面菌种活化将平菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24'C恒温培养5-10天；马铃薯汁综合培养基含有下列重量体积百分比的物质葡萄糖2.0%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，马铃薯汁20%，琼脂2.0%。培养天数优选为8天。(2)摇瓶种子培养三角瓶内装种子培养基，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养4-6天；摇瓶种子培养基的配方为玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%,酵母1%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.0051摇瓶种子培养的条件为25'C下，摇床转速150r/min，摇瓶装液量为三角烧瓶总容量的2/5,培养液初始pH值为6.0-7.0。(3)液体深层发酵将摇瓶种子接入装有培养基的发酵罐发酵，接种量1-10%,发酵温度为28-3(TC，发酵时进行通气搅拌；液体深层培养基的配方为玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素Bl和维生素B2各0.005%。液体深层发酵的条件为pH变化范围在5.5-7.0;培养前期24h，通气量为1:1，v/v/m，搅拌速度为150r/m;24h至发酵结束，通气量控制在1.2:1，v/v/m，搅拌速度为180r/m。(4)连续发酵液体深层发酵60-75小时后将发酵液强制循环，通过0.2ym的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；(5)超滤膜分离并浓縮将上述总发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓縮液的体积降至原来的1/8-1/3;(6)醇沉加入3倍体积量的95%乙醇至上述浓縮液，0-4。C静置12-24小时，收集沉淀，洗涤干燥，即得。与从子实体中提取多糖工艺相比，从深层发酵液中提取平菇多糖具有縮短生产周期，减少生产占地面积，严格控制生产条件，生产过程受自然条件影响少等优点。在发酵后期，罐内多糖存在反馈抑制现象当浓度升高到一定程度，生物体多糖的合成与外排将受到抑制；同时，发酵液中己经生成的多糖^K会被生物体消耗。这时，将发酵液在密闭稳态的条件下通过膜分离装置，固体菌丝体被截流在反应器内继续利用，而多糖则随着发酵液被排出，在滤过的同时补充新鲜培养液到反应器内，这样就降低了发酵液中多糖的浓度，打破反应平衡，促进生物体的发育和代谢产物的转化，实现连续发酵，延长发酵时间，同时减少反应后期生物体对多糖的消耗，提高代谢物的产率。连续发酵生产与间歇发酵生产相比的优势通过下述试验体现试验例1连续发酵与间歇式发酵多糖产量的比较1、试验方法1.1单级发酵工艺(1)斜面菌种活化将平恭菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24'C恒温培养8天。所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质葡萄糖2.0%，磷酸二氢钾O.1%,硫酸镁O.05%，马铃薯汁20%,琼脂2.0%。(2)摇瓶种子培养50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养5天；种子培养基配方玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。摇瓶种子培养的条件为25'C下，摇床转速150r/min，培养液初始pH值为6.0-7.0。(3)单级发酵培养5L发酵罐培养将摇瓶种子接入装有2L培养基的发酵罐发酵，接种量为1%，发酵的条件为发酵温度为28-3(TC;pH变化范围在5.5-7.0;培养前期24h,通气量为1:1，v/v/m，搅拌速度为150r/m;24h至放罐前，通气量控制在1.2:1，v/v/m,搅拌速度为180r/m。培养基配比玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%,维生素Bl和维生素B2各0.005%。放罐标准:菌丝球上浮1/3，镜检有锁状联合，无杂菌，共发酵时间70小时。发酵结束后，将发酵液离心，收集上清液。(4)超滤膜分离并浓縮将上述发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓縮液的体积降至原来的1/5。(5)醇沉加入3倍体积量的95%乙醇至上述浓縮液，0-4'C静置18小时，收集沉淀，洗涤干燥，称重。1.2多级间歇式发酵工艺(1)斜面菌种活化将平菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24'C恒温培养8天。所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质葡萄糖2.0%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁O.05%，马铃薯汁20%，琼脂2.0%。(2)摇瓶种子培养50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养5天；种子培养基配方玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。4摇瓶种子培养的条件为25'C下，摇床转速150r/min，培养液初始pH值为6.0-7.0。(3)二级发酵培养5L发酵罐培养将摇瓶种子接入装有2L培养基的发酵罐发酵，接种量为1%，发酵的条件为发酵温度为28-3(TC;pH变化范围在5.5-7.0;培养前期24h，通气量为1:1，v/v/m，搅拌速度为150r/m;24h至转罐前，通气量控制在1.2:1，v/v/m，搅拌速度为180r/m。培养基配比玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%，维生素Bl和维生素B2各0.005%。放罐标准菌丝球上浮1/3，镜检有锁状联合，无杂菌，共发酵时间70小时。50L发酵罐发酵培养将种子接入装有20L培养基的发酵罐发酵，接种量为10%,发酵的条件为发酵温度为28-30°C;PH变化范围在5.5-7.0;培养前期24h，通气量为l:1，v/v/m,搅拌速度为150r/m;24h至放罐前，通气量控制在1.2:1，v/v/m，搅拌速度为180r/m。培养基配比玉米粉3%，淀粉1%,麸皮IV酵母1%,磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。放罐标准发酵时间40小时，菌丝球上浮1/2，镜检有锁状联合，无杂菌。发酵结束后，将发酵液离心，收集上清液。(4)超滤膜分离并浓縮将上述发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓縮液的体积降至原来的1/5。(5)醇沉加入3倍体积量的95%乙醇至上述浓縮液，0-4'C静置18小时，收集沉淀，洗漆干燥，称重。2.1.3连续发酵工艺(1)斜面菌种活化将平菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24'C恒温培养8天。所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质葡萄糖2.0%，磷酸二氢钾O.1%,硫酸镁O.05%，马铃薯汁2(m，琼脂2.0%。(2)摇瓶种子培养50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养5天；~种子培养基配方玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。摇瓶种子培养的条件为25'C下，摇床转速150r/min，培养液初始pH值为6.0-7.0。(3)液体深层培养将摇瓶种子接入装有2L培养基的发酵罐发酵，接种量为1%,发酵的条件为发酵温度为28-30°C;pH变化范围在5.5-7.0;培养前期24h，通气量为1:1，v/v/m，搅拌速度为150r/m;24h至转罐前，通气量控制在1.2:1，v/v/m，搅拌速度为180r/m。培养基配比玉米粉3%，淀粉1%,麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。(4)连续发酵液体深层发酵70小时后将发酵液强制循环，通过0.2ym的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；(5)超滤膜分离并浓縮将上述总发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓縮液的体积降至原来的1/5。(5)醇沉加入3倍体积量的95%乙醇至上述浓缩液，0-4'C静置18小时，收集沉淀，洗涤干燥，称重。2.2试验结果试验结果见表2表2三种发酵方式发酵时间和产量的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>试验结果表明，采用连续发酵生产平菇多糖,可延长在单级发酵罐内的发酵时间，产量约是同等条件下单级发酵的6倍；在总发酵时间少于间歇式发酵时间的情况下，产量高于后者,可以减少设备投入，简化工艺流程，降低生产成本。下面将结合具体实施方式对本发明做进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。具体实施方式实施例1(1)斜面菌种活化将平菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24X:恒温培养8天。所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质葡萄糖2.0%，磷酸二氢钾O.1%,硫酸镁O.05%,马铃薯汁20%，琼脂2.0%。(2)摇瓶种子培养50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养5天；种子培养基配方玉米粉3%,淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。摇瓶种子培养的条件为25。C下，摇床转速150r/min，摇瓶装液量为三角烧瓶总容量的2/5，培养液初始pH值为6.5。(3)液体深层培养将摇瓶种子接入装有2L培养基的5L发酵罐发酵，接种量为1%，发酵的条件为发酵温度为28-30'C;pH变化范围在5.5-7.0;培养前期24h，通气量为1:1,v/v/m，搅拌速度为150r/m;24h至结束，通气量控制在1.2:1，v/v/m，搅拌速度为180r/m。培养基配比玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%,酵母W，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。(4)连续发酵液体深层发酵70小吋后将发酵液强制循环，通过0.2nm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；(5)超滤膜分离并浓縮将上述总发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓縮液的体积降至原来的1/5。(6)醇沉加入3倍体积量的95%乙醇至上述浓缩液，0-4'C静置1R小时，收集沉淀，冼滏于燥，即得244.6g平菇多糖。实施例2(1)斜面菌种活化将平燕菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24t:恒温培养5天。所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质葡萄糖2.0%,磷酸二氢钾O.1%,硫酸镁O.05%，马铃薯汁20%，琼脂2.0%。(2)摇瓶种子培养-50ml三角瓶内装种子培养基20ni1,灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养4天；种子培养基配方玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。摇瓶种子培养的条件为25'C下，摇床转速150r/min，摇瓶装液量为三角烧瓶总容量的2/5，培养液初始pH值为6.0。(3)液体深层培养将摇瓶种子接入装有2L培养基的5L发酵罐发酵，接种量为10%，发酵的条件为发酵温度为28-30°C;pH变化范围在5.5-7.0;培养前期24h，通气量为1:1，v/v/m，搅拌速度为150r/m;24h至结束，通气量控制在1.2:1，v/v/m,搅拌速度为180r/m。培养基配比..玉米粉3%,淀粉1%，麸皮1%，酵母1%,磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。(4)连续发酵液体深层发酵60小时后将发酵液强制循环，通过0.2ym的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；(5)超滤膜分离并浓縮将上述总发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓縮液的体积降至原来的1/3。(6)醇沉加入3倍体积量的95%乙醇至上述浓缩液，0-4'C静置12小时，收集沉淀，洗漆干燥，即得144.4g平菇多糖。实施例3(1)斜面菌种活化将平菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24'C恒温培养10天。所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质葡萄糖2.0%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁O.05%，马铃薯汁20%，琼脂2.0%。(2)摇瓶种子培养50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养6天；种子培养基配方玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%,酵母1%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。摇瓶种子培养的条件为25。C下，摇床转速150r/min，摇瓶装液量为三角烧瓶总容量的2/5,培养液初始pH值为7.0。(3)液体深层培养将摇瓶种子接入装有2L培养基的5L发酵罐发酵，接种量为5%，发酵的条件为发酵温度为28-30'C;pH变化范围在5.5-7.0;培养前期24h，通气量为1:1，v/v/m，搅拌速度为150r/m;24h至结束，通气量控制在1.2:1，v/v/m，搅拌速度为180r/m。培养基配比玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。(4)连续发酵液体深层发酵75小时后将发酵液强制循环，通过0.2um的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；(5)超滤膜分离并浓縮将上述总发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓縮液的体积降至原来的1/8。(6)醇沉加入3倍体积量的95%乙醇至上述浓縮液，0-4。C静置24小时，收集沉淀，洗涤干燥，即得153.5g平菇多糖。8权利要求1、一种平菇多糖的制备方法，其特征在于所述的方法包含下列步骤(1)斜面菌种活化将平菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养5-10天；(2)摇瓶种子培养三角瓶内装种子培养基，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养4-6天；(3)液体深层发酵将摇瓶种子接入装有培养基的发酵罐发酵，接种量1-10％，发酵温度为28-30℃，发酵时进行通气搅拌；(4)连续发酵液体深层发酵60-75小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；(5)超滤膜分离并浓缩将上述总发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/8-1/3；(6)醇沉加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置12-24小时，收集沉淀，洗涤干燥，即得。2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的马铃薯汁综合培养基含有下列重量体积百分比的物质葡萄糖2.()%，磷酸二氢钾O.1%，硫酸镁0.05%，马铃薯汁20%，琼脂2.0%。3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的斜面菌种活化恒温培养的时间为8天。4、根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于所述的摇瓶种子培养基和液体深层培养基含有下列重量体积百分比的物质玉米粉3%，淀粉1%，麸皮1%，酵母1%，磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%，维生素B1和维生素B2各0.005%。5、根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于所述的摇瓶种子培养的条件为25'C下，摇床转速150r/min，摇瓶装液量为三角烧瓶总容量的2/5，培养液初始pH值为6.0-7.0。6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的液体深层发酵的条件为PH变化范围在5.5-7.0;培养前期24h，通气量为1:1,v/v/m，搅拌速度为150r/m;24h至发酵结束，通气量控制在1.2:1，v/v/m，搅拌速度为180r/m。全文摘要本发明涉及一种操作简便、设备投入小的平菇多糖的制备方法，工艺步骤包括斜面菌种活化、摇瓶种子培养、液体深层发酵、连续发酵、超滤膜分离并浓缩、醇沉。采用本发明制备平菇多糖，可在发酵罐内实现连续发酵，延长发酵时间，简化操作流程，提高多糖得率。文档编号C12P19/00GK101492705SQ20091011621公开日2009年7月29日申请日期2009年2月19日优先权日2009年2月19日发明者范淦彬,高广印申请人:亳州市亳广中药饮片有限公司