专利名称：：对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Btcry40Dal基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属微生物基因工程
技术领域：
，亦属于生物防治
技术领域：
，具体涉及一种来自苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因克隆，在宿主细胞(工程菌)中的诱导表达及其在生物防治领域的应用。
背景技术：
：苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringensis,简称Bt)能产生对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫具有高毒杀作用的杀虫晶体蛋白(又称内毒素)。杀虫晶体蛋白在Bt菌株形成芽孢生成期间形成，并形成伴孢晶体，是由cry基因和cyt基因编码。自Schn印f等1981年首次从Bt中克隆cry基因，现在已有400余种杀虫蛋白基因(http//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html)。Hofte禾口whiteleyl989年Hofte和Whiteley根据晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同，将已经发表的42种Cry蛋白分为4群13亚类。现在分类原则是根据杀虫晶体蛋白的氨基酸序列同源性，NeilCrickmore为首Bt内毒素命名委员会将它们分为为57大类。不同种类的Cry蛋白不仅杀虫范围不同，而且大小也不一样，大致有三个区域范围129-138KD、65-67KD和25-28KD。它经特定蛋白酶的水解作用后，释放有活性的毒性肽核心片断(toxincorefragment)，然后与敏感昆虫消化道刷状缘膜囊(brushbordermemberancevesicles,BBMV)上的受体不可逆特异的高亲和结合，快速插入细胞质膜形成穿孔(pore)或病灶(lesion)。引起细胞膜非极化，离子梯度的破坏，扰乱了细胞内外正常的跨膜电势，及破坏细胞的酸碱平衡。另外Bt在敏感昆虫的血腔迅速增值会导致昆虫的败血症。一般认为内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入和孔洞或离子通道形成等五个环节。蚊虫、蝇等双翅目昆虫吸血叮人，不仅扰乱人们的工作和睡眠，而且传播疟疾，丝虫病，登革热，黄热病及乙型脑炎等多种疾病，其以疟疾和乙脑危害最为严重，目前世界上约有5亿多人口遭受疟疾的威胁，严重危害人类健康。以前一般利用化学农药控制蚊虫生长繁殖，但长期大量使用，不可避免地造成环境污染，并使害虫产生抗性。控制蚊虫现在人们把眼光都转向生物农药，在1976年，Goldberg等发现了Bt0NR260菌株对蚊虫具有很强的杀虫活性。这种菌株属于一种新的血清型并被命名为Bt以色列亚种(Btsubsp.israelensis)，在它的包涵体中发现了多种杀虫晶体蛋白成分(GoldbergL.J.，MargalitJ.Mosq.News,1977，37(3)355358)。苏云金芽孢杆菌以色列亚种作为生物杀虫剂成功地用于蚊虫和蚋等多种双翅目昆虫的控制已有多年，在疟疾，登革热，黄热病和丝虫病等蚊媒疾病的控制上发挥了重要的作用(李洁，张应阔，钱万红.昆虫知识，1997，34(2):109111)。近年来，在巴西，印度，法国，尼日利亚，塞内加尔等地，Bti已广泛地用于蚊幼虫孽生地的控制，取得了良好的应用防和治效果。作者从中国广西百色大王岭自然保护区收集了大量微生物土壤样品，从中分离到一株高产椭圆形晶体蛋白的Bt菌株，命名为BtS2096-2(见附图1)。本发明建立了PCR-RFLP方法鉴定该Bt菌株cry40基因的鉴定体系，然后利用PCR方法获得获取了Cry40Da基因全基因序列，该基因苏云金芽孢杆菌国际命名委员会确认为一个新的cry模式基因，命名为cry40Dal基因。Cry40Dal基因并在大肠杆菌中表达，其表达产物对三龄致倦库蚊具有相当毒力。本发明的意义在于从野生的Bt菌株S2096-2中分离克隆了杀虫晶体蛋白基因Cry40Da，转化到大肠杆菌表达，表明CrylAc22蛋白对库蚊双翅目昆虫有相当的杀虫活性，菌株BtS2096-2的Cry40Dal基因克隆为构建杀蚊工程菌提供一种候选基因。
发明内容本发明的主要内容是分离和克隆了一种对蚊子等双翅目昆虫有高效杀虫活性的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白模式基因cry40Dal，重组工程菌的构建，在宿主细胞(工程菌)中的诱导表达，目标蛋白的分离纯化及其在生物防治领域的应用。本发明提供了一种苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry40Dal，具有如下所示的核苷酸序列a)如SQENO:1所示的核苷酸序列；b)与SQENO1所示的核苷酸序列具有兼并性的核苷酸序列；c)与SQENO1所示的核苷酸序列有90%以上同源性的核苷酸序列。本发明还提供一种含有所述基因Cry40Dal的载体。本发明还提供一种含有所述基因Cry40Dal的宿主细胞。本发明还提供一种含有所述宿主细胞的工程菌株HIC40。进一步，本发明提供一种由SEQNO1所示的核苷酸序列编码的蛋白。本发明还提供一种如上所述的蛋白，其氨基酸序列如SQENO2所示。本发明还提供一种制备如上所述的基因Cry40Dal的方法。本发明还提供一种制备如上所述的宿主细胞的方法。本发明还提供一种制备如上所述的工程菌株的方法。进一步，本发明提供一种如上所述的基因cry40Dal的用途，对蚊子(Culexquinquefasciatus等双翅目昆虫有高效杀虫活性用。本次发明所述cry40Dal所编码的杀虫活性蛋白对双翅目害虫有很强的毒杀活性，可以制成各种生物杀虫剂，用于防治可能传播人畜疾病的蚊子等昆虫，减少化学农药的使用和保护环境，对人畜无害，具有广阔的应用前景。图1菌株S2096-2杀虫晶体蛋白扫描电镜图2菌株S2096-2的杀虫基因PCR鉴定扩增产物电泳其中M为DNALoadingMarker(250bp,500bp,750bp,IOOObp,1500bp,2000bp,3200bp)，1为引物up40-5/up40-5扩增0.9kb的PCR产物。图3:PCR片段RFLP分析M为DNALoadingMarker(300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，1000bp)，1为引物up40-5/up40-5在菌株S2096-2中扩增产物BglII和DraI酶切电泳带型。图4:cry40Da基因全序列PCR扩增M为DNALoadingMarker(250bp,500bp,750bp,IOOObp,1500bp,2000bp,3200bp),1为引物EP40-5/EP40-3在菌株S2096-2中扩增产物BglII和DraI酶切电泳带型。图5:cry40Da基因全序列PCR扩增M为DNALoadingMarker(250bp,500bp,750bp,IOOObp,1500bp,2000bp,3200bp),1为引物EP40-5/EP40-3在菌株S2096-2中扩增产物BglII和DraI酶切电泳带图6菌株S2096-2分泌蛋白SDS-PAGE分析M为蛋白质分子量标准(200kDa,120kDa,80kDa60kDa，40kDa)2为菌株S2096-2表达75kDa的毒素蛋白，1毒素为在胰蛋白作用下酶解成50kDa毒素核心片段。3为菌株蛋白在Na2C03(pHll)溶液溶解具体实施例方式本发明的技术方案是，首先通过PCR-RFLP鉴定菌株S2096-2含有cry40基因，通过反向PCR方法获得全基因序列。将crylAc22基因采用基因重组技术克隆到pQE30原核表达载体上，以构建重组质粒，获得一种工程菌HIC40，用IPTG诱导表达出融合蛋白，利用工程菌或纯化的表达蛋白，对双翅目昆虫致倦库蚊幼虫(Culexpipiens)具有高活力毒杀作用。具体技术方法如下1，菌株S2096-2中cry基因PCR-RFLP分析从GenBank下载已经克隆的cry40基因进行多重序列比对，寻找基因保守区域，然后在保守区域设计鉴定通用引物up40-5/up40-3，根据扩增片段，选择BglIIandDraI酶切，达到鉴定分析Bt菌株的基因型。总DNA提取参照(BourgouinC.TransferofthetoxinproteingenesofBacillussphaericusintoBacillusthuringiensissubsp.IsraelensisandtheirexpressionEJ].ApplEnvironMicrobiol.1990,56340~3),L^i,总DNA为模板，用cry40基因鉴定的通用引物up40-5/up40-3扩增约900bp左右片段，纯化PCR片段用现在内切酶消化PCR产物，酶切带型判断菌株S2096-2可能含有含有新型cry40类基因(如图2、3所示)。琼脂糖胶回收纯化后(胶回收试剂盒购自北京天根公司)，与克隆载体pMD18TVector(购自于大连Takara公司)连接，亚克隆测序。BLAST分析表明克隆片段为新型cry40基因部分序列。up40-5引物序列TGGAATCTTCATCGAATAACACup40_3引物序列CGTGTTCCATTAGCTTCTAAC2，菌株S2096-2中cry40Da基因克隆克隆的PCR通过序列比发现他和cry40Aa和cry40Ba基因序列有较高同源性，而且cry40Aa和cry40Ba编码序列两侧序列有较高保守性，于是根据cry40Aa和cry40Ba保守序列设计对引物F40-5/F40-3用来扩增cry40Da完整编码框序列，获得了约2.Okb的目的片段(如图4所示)，用限制内切酶BglII和DraI消化PCR片段片段不同于cry40Aa和Cry40Ba(如图5所示)。琼脂糖胶回收纯化后(胶回收试剂盒购自北京天根公司)，与克隆载体pMD18TVector(购自于大连Takara公司)连接，亚克隆测序，获得cry40Da基因完整编码蛋白序列，如SEQNOl所示，编码659个氨基酸的毒蛋白质，如SEQN02所示。F40-5引物序列ATACGAGGAGTGAAATAGATGF40-3引物序列CACTTGTAAACATCGGACT3，基因cry40Da在大肠杆菌中表达根据编码序列设计表达引物EP40-5/EP40-3，并在分别在正向和反向引物N端加上BamHI和Sail酶切位点，质粒为模板扩增出1.977kb片段，纯化后与pMD18TVector载体连接，转入大肠杆菌JM110，Amp抗生素培养基选择，筛选正确克隆子，提取质粒，用BamHI和SalI完全消化，回收纯化1.977kp的基因目的带，同时用BamHI和SalI消化载体PQE30(购自QIAGEN公司)，基因目的产物和载体连接，转入大肠杆菌宿主M15，氨苄青霉素和卡那霉素抗生素选择正确的重组子HI40Da，然后用含有涂布于含lOOug/ml氨苄青霉素和25ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中37度120rpm培养1_2个小时至OD值到0.4至0.6之间后加入IPTG至终浓度为0.5mM,37度120rpm诱导20小时。诱导培养的菌液超声波破碎3次，每次用0.5M的NaCl洗涤，获得cry40Da基因表达的粗蛋白，7.5%SDS聚丙烯酰胺变性胶检测到75kDa蛋白带。EP40-5引物序列CGGGATCCATGAATTCATATCAAAATACAAATGGBamHIEP40-3引物序列:ACGCGTCGACTGTTAAACAGCGATACCTCGACSail4，Cry40Da蛋白活性测定诱导表达500mL工程菌株HI40Da，收集表达的蛋白，重新用30ml无菌水重新悬浮中，滴加ImlTritonX100，800W功率超声波破碎细胞5min。，弃上清，然后用40ml0.5M的NaCl充分悬浮，相同功率超声波破碎lmin，12000r/min离心lOmin。反复用0.5M的NaCl洗涤3次。最后用悬浮于20ml冰冷的无菌水中，制备成生侧粗蛋白样品。利用标准的BSA蛋白标定蛋白浓度，然后将粗蛋白取菌液稀释成六个不同浓度梯度被测液200mL，测定Cry40Da蛋白对三龄致倦库蚊(Culexpipiens)幼虫杀虫活性。通过毒力回归分析得出Cry40Da蛋白对三龄致倦库蚊幼虫活性。实施例实施例1菌株S2096-2的基因型分析1)总DNA提取Bt单菌落接种于7mL的LB液体培养基中，30°C，220rpm培养过夜，1%转接于盛有50mL的LB培养基的250mL体积的三角瓶中，30°C，220rpm继续培养4小时至0D600=1.O2.O；离心收集IOmL菌体，2mLJBuffer(0.IMTrisHCl(pH8·0)、0·IMEDTA(ρΗ8.0)、0.15ΜNacl)洗涤沉淀；将沉淀轻悬于2mLJBuffer中加入80uL新鲜配制的溶菌酶(50mg/mL)，混勻，37°C温育45min；再加入15uLRNase(10mg/mL)，50°C作用15min；接着加入200μL505(20%)，701处理201^11；缓慢冷却至37°C，用等体积酚氯仿异戊醇(25241)及氯仿异戊醇(241)各抽提一次，再加入等体积异戊醇混勻置-20°C沉淀上清20min，12，OOOrmp离心lOmin。70%乙醇洗涤沉淀2次，风干后溶IOOuLTEBuffer(IOmMTrisHCl(pH8.0)、ImMEDTA(pH8.0))中，取5uLDNA样品在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测。2)PCR-RFLP鉴定菌株Cry基因50uLPCR反应体系，包括提取的总DNAluL为模板，各上下游引物分别为0.2uM，加入dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP混合物)至浓度250uM，5uL的IOXPCRbuffer(200mMTris-HCl(pH8.3),500mMKCl,15or20mMMgCl2,0.01%(w/v)gelatin)0.5UTaq酶，补双蒸水至50uL。反应按如下程序进入循环前94°C预变性5min。然后进入30个循环反应，每个循环为94°C变性Imin；50°C退火Imin；72°C延伸2min。最后在72°C延伸IOmin。扩增反应结束后，取PCR产物5μ1，在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增PCR片段约为900bp情况。然后利用GelExtractionMiniKit纯化PCR产物，分别用BglIIandDraI双酶切消化引物up40-5/up40-3扩增产物，在2%的琼脂糖胶分析PCR产物酶切的带型。确定酶切带型和现已经克隆的cry40Aa和cry40Ba基因同样的酶切带型完全不同，初步确定为新型cry40基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2cry40Dal基因克隆1)菌株S2096-2质粒DNA提取离心收集IOmL菌体。每IOmL菌液加150uLSI(10%蔗糖，50mMTris.Cl(ρΗ8·0)，20mMEDTA(pH8.0)Lysozyme20mg/ml，用时现配)，混勻，37°C水浴3h；加1350uLSII(IOmMTris‘Cl,lmMEDTA，0.085MNaOH，1.I%SDS用时现配)，轻轻混勻，放置lOmin，然后加750uLSIII(5MKAc，用冰乙酸调至pH4.8)，上下倒置离心管轻轻混勻，冰浴4h以上；12，OOOrpm离心lOmin，取上清，加入30RNase(10mg/mL)，45°C作用30min，加入1/10体积3MNaAC和2倍体积无水乙醇，_20°C沉30min。12，OOOrpm离心lOmin，弃上清，沉淀用70%乙醇漂洗。将沉淀在真空干燥器中干燥后用IOOuL超纯水溶解。取5uL质粒DNA样品在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测。2)PCR扩增基因全序列质粒为PCR反应模板，总的反应体系为50ul，10XPCRBuffer5uL，dNTP为0.2mmol/LluL，引物Crylrs5/Crylrs3各0.2mmol/L，1单位/ulpfu酶。反应30个循环，94°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸2min，30个循环后延伸lOmin，PCR产物取5uL用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测目的产物2.OkbPCR产物，用NedI完全消化验证PCR产物是否正确。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3)PCR扩增片段亚克隆与测序PCR产物用鼎国DNAFragmentQuickPurification/RecoverKit回收纯化，然后和载体pMD18TEasyVector连接，重组质粒导入到用0.lmol/LCaC12诱导的大肠杆菌JM110感受态细胞中，转化子在含有Amp(100ug/ml)，5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-gaIactopyranoside(X-Gal)(64ug/ml)禾口isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(0.2mM)的LB培养基平板，37°C培养过夜，任意挑取白色菌落于LB液体培养基中培养，提取重组菌株的质粒，选择相应的引物PCR扩增和选择多克隆位点的合适的限制性内切酶消化，确定含有目的片段的重组质粒，送往北京奥科生物科技有限公司测序。实施例3cry40Da基因在大肠杆菌中表达0.5ng质粒为模板，表达引物EP40-5/EP40-3各为0.2uM，加入dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP混合物)至浓度250uM，5uL的IOXPCRbuffer(200mMTris-HCl(pH8.3)，500mMKCl,15or20mMMgC12,0.01%(w/v)gelatin)0.5ULATaq酶(东洋纺)，补双蒸水至50uL。反应按如下程序进入循环前94°C预变性5min。然后进入30个循环反应，每个循环为94°C变性Imin；50°C退火Imin；72°C延伸3min。最后在72°C延伸IOmin。然后利用GelExtractionMiniKit纯化的PCR产物，用限制内切酶BamHI和SalI37°C分别消化纯化的PCR产物和表达载体pEQ30质粒3h，65°C水浴15min失活，然后将消化产物混合，力口入T4DNA连接酶和Buffer过夜连接。转入大肠杆菌M15中，挑取重组菌落质粒DNA，BamHI禾口SalI酶切鉴定重组子HIC40为阳性重组子，在LB液体培养基中培养培养至OD=0.5或0.6(600nm)加入IPTG继续培养4_6个小时至终浓度为lmmol/L诱导表达重组子上的目的基因。实施例4Cry40Da蛋白对双翅目昆虫毒性测定粗蛋白取菌液六个不同浓度梯度被测液，将人工饲养的三龄致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)幼虫放到一定浓度待测液的500ml容积的水杯中，每个水杯放置25头，重复3次。恒温25°C，光照周期12:12，相对湿度65%环境，96h后，仔细观察剩下的活蚊数，就可以进行浓度_死蚊数/率的线性回归拟合了。利用spss软件进行毒力回归分析。得出Cry40Dal蛋白对三龄致倦库蚊毒力LC50为0.01ug/ml，较阳性对照Cry4Ba蛋白活性(LC50:134ug/ml)高达13400倍。序列表SEQUENCELISTING<110>海南海德热带农业资源研究所有限公司<120>对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Btcry40Dal基因及其应用<130><160>1<170>PatentInversion3.1<210>1<211>3534<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)<220><221>gene<222>(1)..(1977)<223><400>11ATGAATTCATATCAAAATACAAATGGATATGAAATATTGGAATCTTCATCGAATAATACA61AATACGCCAAACAGATATCCTTTTGCAAATGATCCAAATATTTTTCCTATTATCCTGAAC121GATTGTCCGGGAAAACCATGGCAAGATACGTGGAAATCAATCTCGAATTTCATAAGTGTT181ATGGTAAGCATGGCAGGATTCATAAGCTCACCTGGTGTACTAATTGGAATTCCTGCACTA241TTGGGAATAGTAAACCTACTAATTCCATCTTCTGGTCCATCTGTGGCAGCACTTTCTATA301TGTGATTTATTATCTATAATTCGTAAAGAGGTAGACGAGAGTGTTTTAAATGACGCGGTT361GCAGATTTTAACGGTAAATTGACTAATTATAAAGAGTATTATCTTTCTTCTCTTCAGGAG421TGGCTTAGTGCAGGTAAACCAAATGATAGCAGACTTAGTAATGTGGTTGAGTATTTCAAA481AAGTCTGAAGAAGGTTTCAATGAAATTCTAGCAGGGTCATTATCAAGGCAGAATGCTCAA541ATATTATTATTGCCTACGTTTGCGCAAGCTGCAAATGTACAGTTATTACTATTAAGGGAT601GCCGTTCAATATAAAAAAGAATGGGGAGCATTGTTGAGTGCGGAGAAAGTAGGATCGGAA661TTAATATCACCTACTATTGATTATGGTCAGCGATTAAAAGATAAAATAGCACAGTATGCC721AAGTATTGTGTATTTTGGTATCAGGAGGGTTTAAATCAGATAAAAGAGGAGGGGGCAGGT781ACTACAACTTGGTTGAAATTTAATAAATTTCGTAGAGAAATGACGTTGGCGGTATTGGAT841ATTATCGCTCTATTTCCAATTTATGATTTTGAAAAATATCCATTAGGAACAAATGTAGAG901TTAACTAGGGAAATTTATACAGACCCAGTGGGATATTCACGGGGAAATTATCGTTGGGAA961GGGCTTTTTAGCTTTAATTCGCTAGAAGCTAATGGAACACGGGGACCTGGTTTAGTTACT1021TGGCTTCAAGCTATAGATATATATAGTCATCCTGTTTTTACTCAACCTGGTTATCTTATC1081GGCTGGGGAGGAACTCGTCATTATGAAGACTACACAAAGGGTAACGGTGCTTTTCAACGT1141ATGTCTGGAACTACGAGTAATGATCCACATTCTATTAGTTTCGGCAATACTGATATATTT1201AAAATTAGTTCATTAGCTAGAGTTGAATTGCAACCATTTGTTGGGTATTCAATCCCACGG1261TATCGTACTTCACGTGCAGAATTTTTTCCGACAACACTAAATACTTTACTATATGAGAGA1321AACAGTTCTGGGTACTCACAGACAATTGAATCTGTGTTACCAGGTATTGATAAGGATCTA1381CCACCTAGTGCTAGAAATTACTCTCATAGATTATCAAATGCGGCATGTGTTCAATATGAA1441ACCTCCGTAGTTAACGTATTTGGTTGGACACATACAAGTATGACAAGAAATAATCCAATT1501TATCCAGATAAAATTACACAAATACCGGCTGTGAAAGCTTTTGCTTTAGAAAACGGCGCT1561TATGTTAGCGCTGGACCTGGTGATACAGGGGGAGATGTAGTAACGTTACCATATCTTGGG1621CGTTTGAAAATACGTTTAACTCCTGCACCCACGAATAAAAATTACCGAGTTAGAATCCGC1681TATGCAACTTCTTATGGCGCTAGTTTAATGGTACAAAGATGGTCACCGAGTGGTTCTGAG1741AGTGACTATTTTGGTTCTTCACCTACGGGTCCTTATCCTACATTCGGATATATGAATACC1801TTAGTTACTACATTTAATCAATCAGGTGTTGAAATAATTATAGAAAATCGACATTATAGC1861AATATTATCATTGACAAAATTGAATTTTTACCGGATGATTTAACAACTTTAGAATCTGAA1921GGAGAACGGAATTTAGAAAAAACAAAGAAAGCGGTGAACGATTTATTTATCAATTAA<110>海南海德热带农业资源研究所有限公司<120>对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Btcry40Dal基因及其应用<130><160>1<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1178<212>氨基酸<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)<220><221>protein<222>(1)..(426)<223><400>11MNSYQNTNGYEILESSSNNTNTPNRYPFANDPNIFPIILNDCPGKPffQDTWKSISNFISV61MVSMAGFISSPGVLIGIPALLGIVNLLIPSSGPSVAALSICDLLSIIRKEVDESVLNDAV121ADFNGKLTNYKEYYLSSLQEWLSAGKPNDSRLSNVVEYFKKSEEGFNEILAGSLSRQNAQ181ILLLPTFAQAANVQLLLLRDAVQYKKEffGALLSAEKVGSELISPTIDYGQRLKDKIAQYA24IKYCVFffYQEGLNQIKEEGAGTTTffLKFNKFRREMTLAVLDIIALFPIYDFEKYPLGTNVE301LTREIYTDPVGYSRGNYRffEGLFSFNSLEANGTRGPGLVTWLQAIDIYSHPVFTQPGYLI36IGffGGTRHYEDYTKGNGAFQRMSGTTSNDPHSISFGNTDIFKISSLARVELQPFVGYSIPR421YRTSRAEFFPTTLNTLLYERNSSGYSQTIESVLPGIDKDLPPSARNYSHRLSNAACVQYE48ITSVVNVFGffTHTSMTRNNPIYPDKITQIPAVKAFALENGAYVSAGPGDTGGDVVTLPYLG541RLKIRLTPAPTNKNYRVRIRYATSYGASLMVQRffSPSGSESDYFGSSPTGPYPTFGYMNT601LVTTFNQSGVEIIIENRHYSNIIIDKIEFLPDDLTTLESEGERNLEKTKKAVNDLFIN权利要求一种苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry40Da1，具有如下所示序列a)如SQENO1所示的核苷酸序列；b)与SQENO1所示的核苷酸序列具有兼并性的核苷酸序列；c)与SQENO1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的核苷酸序列。2.一种含有权利要求1所述的基因cry40Dal的载体。3.一种含有权利要求1所述的基因cry40Dal的宿主细胞。4.一种含有权利要求3所述的宿主细胞，它是工程菌株HIC40。5.一种由编码cry40DalgSQENOl所示的核苷酸序列的蛋白。6.一种如权利要求5所述的蛋白其氨基酸序列如SQEN0:2所示。7.一种制备权利要求1所述的基因cry40Dal的方法。8.一种制备权利要求1所述的基因cry40Dal的宿主细胞的方法。9.一种制备权利要求1所述的基因cry40Dal的工程菌株的方法。10.一种如权利要求1所述的基因cry40Dal的用途，对双翅目昆虫有高效杀虫活性。全文摘要本发明公开了一种从苏云金杆芽胞杆菌野生菌株S2096-2中分离克隆的杀虫晶体蛋白基因cry40Da1，及其对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性和应用。本发明采用反向PCR克隆法从菌株S2096-2中克隆了cry40Da全长基因，该基因的开放阅读框(ORF)为1977bp，编码由659个氨基酸组成的蛋白质，被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry40Da1，GenBank登录序号为EU596478。利用工程菌以及提取的表达蛋白，对致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)等双翅目昆虫表现出高效的杀虫活性。文档编号C12N15/32GK101824419SQ20091011999公开日2010年9月8日申请日期2009年3月3日优先权日2009年3月3日发明者张文飞,方宣钧,谢柳申请人:海南海德热带农业资源研究所有限公司