一种发光细菌及其在食品或水样总体生物毒性检测中的应用的制作方法

专利名称：：一种发光细菌及其在食品或水样总体生物毒性检测中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明毒物检测领域，尤其涉及一种发光细菌及其在食品或水样总体生物毒性检测中的应用。
背景技术：
：食品安全问题是一个人类永远不可能忽略的问题。随着人民生活水平的不断提高，重金属、农药残留、抗生素和激素、变质食品产生的毒素、包装材料迁移物等有毒有害物质污染食品导致的食源性疾病，已成为当今社会关心食品安全问题的重点。造成有毒有害物质对食品污染的原因有很多，既有外来因素，如农产品生产过程中喷洒农药、食品加工过程中添加辅料等；又有内在因素，如食品加工过程中发生化学反应；还有水、空气、土壤等生产环境污染因素。传统的食品安全监测方法以气相、液相色谱以及分光光度计等仪器分析为主，这些方法可检出样品中的痕量污染物，具有检测限低、精确度高等特点，但是存在着操作复杂、时间长、成本较高的问题，尤其不适宜作为食品生产流通过程中的现场监测，也无法对污染物质进行生物危害性评估。一些以生物化学、免疫学、分子生物学原理为基础的传统快速检测方法一般都只是针对已知的食品污染物进行检测，对于未知成分则大多无能为力。食品中需要检测的种类和组分很多，分子结构复杂，往往难以下手。己经建立的一些食品中总的有毒有害物质的初步检测方法灵敏度低和可操作性不强。例如大鼠的急性和慢性毒性实验，如果用于食品中有毒有害物质的检测不但周期相对较长，而且检测成本也过高。生物传感器分析技术与传统的检测方法相比具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在线检测等优点，它作为一种检测手段已经成为食品安全检测的重要发展趋势。目前针对食品中总的有毒有害物质的常见的生物学检测体系包括大鼠、小鼠等哺乳动物，鱼等较低等脊椎动物，动物细胞以及细菌、酵母等微生物等。所有这些检测体系中以使用单细胞微生物细菌或酵母的方法最为简便，易于实现对大量样品的高通量筛选，并且检测成本通常也是最低的。但目前的细菌或酵母检测体系如果仅仅检测有毒有害物质对于其生长速度的影响，会遗漏掉大量有毒有害信息。微生物学检测方法虽然因其快速、灵敏、经济等特点得以迅速发展，但其缺陷是不能满足对环境质量实时预报预警、突发毒物泄漏应急处置、污染处理设施在线监控等的需要，而微生物传感器符合上述要求。微生物传感器中典型代表发光细菌在生物毒性检测中应用最为广泛。发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见光的异养细菌，其发光原理为正常生理状况下细胞利用还原型黄素单核苷酸(FMNH2)、长链脂肪醛(RCH0)为底物，在氧与细菌荧光素酶的参与下，可发出波长为420—670nm的可见光。当环境条件不良或有毒物存在时，由于细菌荧光素酶活性或细胞呼吸受到抑制，发光能力受到影响而减弱，其减弱程度与毒物的毒性大小和浓度成一定比例关系。利用该发光特性，发光细菌能同时对多种毒物产生发光受抑反应，且前处理简单，成本低廉，在定性、半定量的现场快速检测中逐渐显现出了其优势。随着食品工业的发展，采用发光细菌法检测食品安全性作为一种快速的初筛方法，已逐渐受到人们的广泛关注。通常用发光细菌进行有毒有害物质检测时，检测体系中需要添加一定浓度的盐浓度以保证发光细菌的发光能力。国内外已有的海洋发光细菌的研究结果表明用其进行检测时，样品中需要添加盐离子的终浓度至少为2-3%，才可以使发光细菌对样品中有毒有害物质作出较好的响应。但是从应用的角度考虑，用发光细菌法检测时，这样高盐浓度的加入会影响待检测样品本身的性质发生改变，从而对其毒性评估的真实性与可靠性产生怀疑。一般而言，在利用发光细菌进行有毒有害物质检测时，对温度的要求较为苛刻，都要在细菌的最适生长温度附近，显然，这将减小其适用范围。因此本领域迫切需要一种新的发光细菌，不仅可以高盐浓度条件下利用其进行有毒有害物质检测，而且在低盐浓度下也可以对样品进行检测，且具有较高的灵敏性；并且能在较宽的温度范围下发挥作用，从而更有效、真实地评估待测样品的毒性，而且拓宽了检测样品的适用范围，具有更深远的应用前景。
发明内容本发明旨在提供一种发光细菌。本发明的另一个目的是提供一种食品或水样中总体生物毒性的检测方法。本发明的再一个目的是提供一种检测食品或水样中总体生物毒性的试剂在本发明的第一方面，提供了一种微生物CCTCCM208027(州otoZac^r/〃历sp.)，它具有以下特性(i)菌体呈短杆状；(ii)菌落呈乳白色、半透明；(iii)菌落及菌液均能发出蓝绿光。在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的微生物的用途，所述的微生物用于检测食品或水样中总体生物毒性。在本发明的第三方面，提供了一种食品或水样中总体生物毒性的检测方法，所述的方法包括步骤(1)将如上所述的微生物分别与待测食品和空白对照品混合，分别得到待测混合物和阴性对照混合物；(2)检测待测混合物发光值，同阴性对照混合物发光值比较，获得发光强度抑制率(InhibitionRate,IR);(3)如果发光强度抑制率》50%，则说明待测品有毒。在另一优选例中，所述的IR可通过(但不限于)以下公式计算发光强度抑制率(InhibitionRate,IR)Tn/—阴性对照混合物发光值一待测混合物发光值inn。/IR/o=阴性对照混合物发光值Xl0"。在另一优选例中，所述的待测混合物和/或阴性对照混合物中含有盐，所述盐浓度为0.1—6.0w/v%;所述的盐优选钠盐。在另一优选例中，所述待测混合物和/或阴性对照混合物pH6-8。在另一优选例中，它还使用阳性对照混合物，所述阳性对照混合物中含有阳性对照品、如上所述的微生物和盐，所述阳性对照混合物中盐浓度为0.l—6.0w/v%，所述阳性对照混合物的发光强度抑制率等于50%;所述的盐优选钠盐。在另一优选例中，所述的空白对照品选自去离子水或无毒食品。在另一优选例中，所述的阳性对照品是有毒物质标准品，包括但不限于氯化汞、重铬酸钾、硫酸铜等。在另一优选例中，所述的食品选自谷物、水果、蔬菜、肉禽类、或海产食品；所述的水样选自饮用水、污水、或灌溉水。在另一优选例中，所述检测可在1一37。C进行；更优选5—30。C。在本发明的第四方面，提供了一种食品或水样中总体生物毒性检测试剂盒，所述的试剂盒包括如上所述的微生物、空白对照品、阳性对照品、盐溶液和缓冲液；所述的微生物优选发光杆菌CCTCCM208027冻干粉。在另一优选例中，所述的空白对照品选自去离子水或无毒食品。在另一优选例中，所述的阳性对照品是有毒物质标准品，包括但不限于氯化汞、重铬酸钾、硫酸铜等。在另一优选例中，所述的盐溶液中盐浓度为0.05—50w/v%，优选浓度为0.l—25w/v%;所述的盐溶液中的盐优选钠盐。在另一优选例中，所述的缓冲液为PH5-9的缓冲液，优选pH6-8的缓冲液，包括但不限于Tris缓冲液、磷酸缓冲液等。据此，本发明提供了一种新的发光细菌，不仅可以高盐浓度条件下利用其进行有毒有害物质检测，而且在低盐浓度下也可以对样品进行检测，且具有较高的灵敏性；并且能在较宽的温度范围下发挥作用，从而更有效、真实地评估待测样品的毒性，而且拓宽了检测样品的适用范围，具有更深远的应用前景。图1显示了实施例1中所获得的不同发光细菌发光强度的差异。图2显示了发光杆菌CCTCCM208027菌落发光照片。图3显示了发光杆菌CCTCCM208027培养液发光照片。图4显示了发光杆菌CCTCCM208027的显微菌体照片。图5显示了发光杆菌CCTCCM208027对模拟混合毒性样品总体毒性的快速检测效果。图6显示了发光杆菌CCTCCM208027对不同样品(水和苹果)中重金属Hg的响应；其中"ppm"是所加入的重金属Hg的浓度单位；苹果汁一CK表示无毒苹果。图7显示了发光杆菌CCTCCM208027对不同样品(水和苹果)中氰戊菊酯的响应；其中"ppm"是所加入的氰戊菊酯的浓度单位；苹果汁一CK表示无毒苹果。图8显示了发光杆菌CCTCCM208027对不同样品(水和青菜)中农药1605的响应；其中"ppm"是所加入的农药1605的浓度单位；青菜一CK表示无毒青菜。图9显示了发光杆菌CCTCCM208027对不同样品(水和面粉)中重金属Hg的响应；其中"ppm"是所加入的重金属Hg的浓度单位；面粉一CK表示无毒面粉。图10显示了发光杆菌CCTCCM208027对不同样品(水和面粉)中农药1605的响应；其中"ppm"是所加入的农药1605的浓度单位；面粉一CK表示无毒面粉。图11显示了发光杆菌CCTCCM208027对不同样品(水和猪肉)中NO2—的响应；其中"卯m"是所加入的N02—的浓度单位；猪肉一CK表示无毒猪肉。图12显示了不同检测温度发光杆菌CCTCCM208027对重金属Hg响应的比较情况；其中"卯m"是所加入的重金属Hg的浓度单位，10°C、15°C、25。C和3(TC是水浴温度，20'C是室温。具体实施例方式发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现了一种发光细菌，是发光杆菌属州ofofe"e/v'柳sp.的一种，该菌株于2008年2月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection,简称CCTCC)，编号M208027。进一步地，发明人发现使用该菌株在一个宽泛的盐浓度范围内对样品中总体生物毒性进行检测时的灵敏度都非常高；而且利用本发明提供的菌株可以在较为宽泛的温度范围内获得良好的检测效果。具体地，所述的盐浓度范围是是指在检测体系中盐的终浓度为0.1—6.0w/v%，较佳地为0.5—3.5w/v%，更佳地为0.8—3.0w/v%;所述的检测温度范围为1一37。C，较佳地为5—30。C。如本文所用，"急性毒性(acutetoxicity)"是指人或实验动物(如小鼠、大鼠、家兔等)一次或24小时内多次接触受试物后引起的中毒效应，甚至死亡，结果多以半数抑制浓度(50%inhibitionconcentration,ICj表示。如本文所用，"生物毒性(biotoxicity)"是指以微生物的某一项或几项7生理指标作为指征(如细胞生长、呼吸、酶活性等)，根据待测物影响这些指征的程度来判断毒性的强度。如本文所用，"半数有效浓度(50%effectiveconcentration,EC5。)"或"半数抑制浓度(50%inhibitionconcentration,IC5。)"都是在评估生物毒性时采用的评价指标或值，即计算影响或抑制微生物某种正常生理指标值50%所需的待测物浓度。如本文所用，"发光杆菌CCTCCM208027检测温度"是指利用发光杆菌CCTCCM208027对有毒有害物质进行检测时，测定发光值时检测系统的温度，所述检测系统中含有待测物和发光杆菌CCTCCM208027。本发明提供的发光杆菌CCTCCM208027具有以下特性1)菌体呈短杆状；2)菌落呈乳白色、半透明、易挑取；3)菌落及菌液均能发出的蓝绿光；4)处在对数生长期的细菌，其发光值可达2000-3000万RLU(相对发光强度)/100ul。5)在宽泛的盐浓度范围内0.1—6.0w/v%(较佳地为0.5—3.5w/v%,更佳地为0.8—3.0w/v%)，对多种有毒有害物质的响应都较为灵敏(如对多种重金属(Hg，Cu，和/或Pb)的ICs。可达4ppm以下)。一个优选获得本发明提供的发光杆菌CCTCCM208027的方法是将取自深海淤泥，置于基础培养基中，于25-35°C，100-400转/分钟培养2-4天，以1%的接种量接入到相同的培养基中，传代3-5次。然后取0.5ml培养液梯度稀释，取10—4—10—7稀释度的液体各0.lml涂布于基础培养基平板上，25-35'C培养2天后，进行暗室观察，挑取发出荧光的菌落。并分别将其接种于基础盐培养基试管中，于25-35°C，100-400转/分钟摇床培养10-20小时，用化学发光仪检测其发光效果。在分离过程中，检测到7株具有不同发光能力的发光细菌，其中一株发光能力超强，初次培养时检测到的发光值就可达到2200万RLU/s，并将其命名为LuB-1。以该菌株的基因组DNA为模板，利用细菌16Sr脂A通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.5kb的扩增产物，测序结果在GenBank上比对结果，并结合其生理生化特性，根据伯杰氏手册，该菌的各项特征与发光杆菌尸力oto力a"eriw历sp.吻合程度为较高，初步将其鉴定为尸/w"力a"eri〃历sp.。本发明提供的发光杆菌CCTCCM208027可通过常规方法制成冻干粉，一种优选的方法是将培养至对数生长期中期的发光杆菌CCTCCM208027培养液，4。C，10000-15000g/分钟，离心5-IO分钟，弃去上清液，用10-30ml基础培养液重悬一次(用微量移液器或滴管轻缓吹打均匀)，再于4。C,15000g/分钟，离心5分钟，弃上清，利用冷冻干燥仪将其制成发光杆菌CCTCCM208027冻干菌粉。所述的基础培养基或基础培养液可以使用本领域常规的基础培养基或基础培养液，优选的配方如下酵母粉2—7克/升、蛋白胨2—7克/升、氯化钠7一25克/升、氯化钾0.2—0.7克/升、氯化钙0.5—2克/升、氯化镁l一5克/升、碳酸氢钠0.05—0.2克/升、硫酸镁l一4克/升、甘油10—30毫升/升。培养中，发光杆菌CCTCCM208027的适宜生长温度为5—37°C，较佳地为10—30。C;其适宜生长pH为5—9，较佳地为6—8。发光杆菌CCTCCM208027处在对数生长期时，其发光值可达2000-3000万RLU(相对发光强度)/100ul。本发明提供了一种检测食品中总体生物毒性的方法，将发光杆菌CCTCCM208027分别同空白对照品和待测食品混合得到阴性对照混合物和待测混合物，然后分别检测阴性对照混合物和待测混合物的发光值，最后通过待测混合物发光强度受抑制情况判断待测食品中总体生物毒性情况。在本发明的一个优选例中，所述的食品中总体生物毒性的检测方法如下a、取一管发光杆菌CCTCCM208027冻干粉，用0.1—3.0w/v%的盐溶液溶解，并上下颠倒混匀，置于5-3(TC水浴锅中孵育5分钟；b、用微量移液器轻柔吹打均匀菌液，以每管O.lml分装到各检测管，立即置于化学发光仪上检测各管本底发光值；c、将盐浓度为O.l—3.0w/v^的样品溶液0.4ml加入可检测管中，上下颠倒混匀，再置于5-30'C水浴锅中反应10-30分钟后，检测并与对照组相比较各检测管发光值受抑情况，以判断样品生物毒性。可按以下公式计算发光强度抑制率(InhibitionRate,IR):IR%:阴性对照混合物发光值一待测混合物发光值-xl00%阴性对照混合物发光值在本优选方法中同时设立l个空白(阴性)对照(选自去离子水或己知无毒样品)和l个阳性对照(氯化汞)；其中所述的盐选自钠盐。其中阳性对照的发光强度抑制率应为50%;结果判定按下表进行IR%30-5050-80>80毒性可疑有毒强毒本发明提供一种检测食品中总体生物毒性的试剂盒，其中包括发光杆菌CCTCCM208027冻干菌粉、阴性、阳性对照品和缓冲液。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有盐溶液，盐浓度为0.1—6.0w/vy。(较佳地为0.5—3.5w/v%，更佳地为0.8—3.Ow/v%);所述的盐选自钠盐。在另一优选例中，所述试剂盒中的空白对照品选自去离子水或无毒食品；阳性对照品选自氯化汞、重铬酸钾、硫酸铜等。本发明提供的试剂盒采用发光杆菌CCTCCM208027进行样品的急性毒性检测。根据加入待测样品前后细菌发光强度的改变情况，来判定样品的安全程度。本发明提供的试剂盒主要适用于(但不限于)对食品、水质等安全性进行总体生物学毒性的快速评估。可以一次性快速检测样品中总体水平上是否含有超标的有毒有害物质，甚至对未知样品也不需对其有毒成分组成、结构、性质等进行具体分析，单项检测指标，就可进行结果判定；对常见重金属、农药、多类致癌物等多类有毒有害物质它都有较高响应；操作简便、检测时间短，10-30分钟内即可完成一批样品的检测；可以对大批量样品进行现场快速检测，特别适于(但不限于)水样和食品安全的初筛；也可用于含有不溶性物质的复杂样品的测定；设备简单，成本价格低，仅需一台化学发光仪，便可完成全部检测需求。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于1、CCTCCM208027菌株能在0.1—6.0w/v。/。盐浓度范围内对样品总体生物毒性进行检测，特别是在低盐浓度(0.l—3.0w/v"的环境下仍能保证检测的灵敏度和重复性；2、CCTCCM208027菌株能对待检测样品的盐浓度要求更为宽广，可适用于盐浓度不等的多种样品的检测，拓宽了检测的应用领域和检测范围；3、快速检测样品，总体水平上评估是否含有超标的有毒有害物质；可大大提高批量的和经常性项目的有毒有害物质的检测效率；也可作为替代利用哺乳动物和鱼类进行有毒有害物质总体生物毒性判定的快速检测方法；4、对未知样品无需对其有毒成分组成、结构、性质等进行具体分析，单项检测指标，就可进行结果判定，省时省力大幅降低成本；5、除了食品，还包括(但不限于)对水质、环境中的总体生物学毒性进行检测；6、本发明提供的试剂盒的应用范围较广，对检测温度的要求温和。下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1获得发光杆菌CCTCCM208027将取自海洲湾赣榆海域深海淤泥5.00g，置于100ml基础培养基中，于30°C，200转/分钟培养2天，以1%的接种量接入到相同的培养基中，传代3次。然后取O.5ml培养液梯度稀释，取10—4—10—7稀释度的液体各0.lml涂布于基础培养基平板上，3(TC培养2天后，进行暗室观察，挑取发出荧光的菌落。并分别将其接种于基础盐培养基试管中，于3CTC，200转/分钟摇床培养24小时，用化学发光仪检测其发光效果。培养基配方为酵母粉Yeastextract5.00g蛋白胨Tryptone5.00g氯化钠NaCl9.00g氯化钾KC10.50g氯化钙CaCl2X2H20l.OOg氯化镁MgCl2X6H203.00g碳酸氢钠NaHC030.10g硫酸镁MgS04X7H202.00g甘油Glycerol20.O(M在分离过程中，检测到7株具有不同发光能力的发光细菌，其中一株发光能力超强，初次培养时检测到的发光值就可达到2200万RLU/s，见图l，并将其命名为LuB-1。图2、3分别代表发光细菌在培养基平板上的生长的菌落及其培养液均可发出肉眼可见的明亮的蓝绿光。图4为发光细菌LuB-l的显微镜下菌体照片，菌体呈短杆状。以该菌株的基因组DNA为模板，利用细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.5kb的扩增产物。测序结果在GenBank上比对结果，并结合其生理生化特性，根据伯杰氏手册，该菌的各项特征与发光杆菌尸力"o&c^eri"历sp.吻合程度为较高，初步将其鉴定其为尸力o&力acter/z/历sp.。发光细菌LuB-l于2008年2月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection,简称CCTCC),编号M208027。该发光杆菌CCTCCM208027具有以下特性(i)菌体呈短杆状；(ii)菌落呈乳白色、半透明；(iii)菌落及菌液均能发出蓝绿光。实施例2发光杆菌CCTCCM208027冻干粉的制备12将实施例1中培养至对数生长期中期的发光杆菌CCTCCM208027培养液，立即置于冰水浴上进行以下操作4°C，15000g/分钟，离心5分钟，弃去上清液，用10ml基础培养液重悬一次(用微量移液器或滴管轻缓吹打均匀)，再于4'C，15000g/分钟，离心5分钟，弃上清，使用冷冻干燥仪将其制成发光杆菌CCTCCM208027冻干菌粉。所得的固态粉末即为发光杆菌CCTCCM208027冻干粉成品。实施例3将发光杆菌CCTCCM208027用于混合毒性模拟样品的生物毒性评估试验模拟制备了含有多种有毒有害物质(每种有毒物的浓度为IC5。)的混合水样H1、H2、H3，每种样品中含有的有毒有害物质的种类分别为2种、4种、6种(按表1配制，"+"代表添加种类)，同时将水样Hl、H2、H3进行浓度梯度稀释(2倍、4倍、6倍、8倍、10倍)，然后分别用实施例1中得到的发光杆菌CCTCCM208027检测对不同样品、不同浓度样品的响应情况。以发光值抑制50%为毒性判定标准。结果见图6。表1混合水样添加有毒有害物质的种类<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果表明，发光杆菌CCTCCM208027对样品中混有多种不同浓度的有毒物质响应，具有一定的累加或协同效应。随着混合样品中重金属的种类增加，样品稀释倍数也逐渐增大，同样可以使发光值抑制率达到50%。当样品中有毒有害物质的种类增加到6种(H3)时，样品溶液稀释10倍，同样可以达到50%的发光抑制率。可见该方法不仅使发光杆菌CCTCCM208027对混合样品中单一成分的检测灵敏度提高，还可对含有不同有毒有害物质的样品，进行总体生物毒性的快速定性和半定量评估。实施例4发光杆菌CCTCCM208027在食品安全检测中的应用一苹果称取新鲜待检测的苹果100g，切成2cm见方的小块，用家用型榨汁机约可搾取50ml的果汁，初始pH为5.0。用重蒸水适当稀释后，用一定量的Tris缓冲液将样品的pH调至6.0-8.0。当苹果作为食品安全检测对象时，以经常出现超标或残留的有毒有害物质(如重金属Hg、拟出虫菊酯类农药氰戊菊酯等)为研究对象，在新鲜榨好的果汁中外源添加一定量的重金属Hg(图7)或者氰戊菊酯(图8)，使其终浓度分别如图7和8所示，进行拟污染苹果样品的制备，同时以无毒的苹果样品作为阴性对照(即苹果汁-CK代表无毒苹果)。检测结果与用发光杆菌CCTCCM208027冻干粉检测空白水样中相同有毒物质时的相比较。用实施例2得到的发光杆菌CCTCCM208027冻干粉进行检测a、取一管发光杆菌CCTCCM208027冻干粉，用2.5w/vX的NaCl溶液溶解，并上下颠倒混匀，置于10-3(TC水浴锅中孵育5分钟；b、用微量移液器轻柔吹打均匀菌液，以每管O.lml分装到各检测管，立即置于化学发光仪上检测各管本底发光值；c、将NaCl浓度为2.5w/v^的样品溶液0.4nil加入可检测管中，上下颠倒混匀，再置于15。C水浴锅中反应15分钟后，检测并与对照组(用无毒苹果经过同样处理方法)相比较各检测管发光值受抑情况，以判断样品生物毒性。检测结果见图7和8。结果表明，食品(苹果)中的有毒有害物质无论是重金属还是农药，都可以通过本发明提供的发光杆菌CCTCCM208027进行检测，与发光细菌能够在水样中响应的有毒有害物质的ICs。相比，对农药的检测具有相似的检测灵敏度，而对重金属的响应值要略低一些，可能与食品样品对重金属离子的螯合效应有关。实施例5发光杆菌CCTCCM208027在食品安全检测中的应用一青菜称取新鲜待检测的上海青菜100g(为了避免色素对检测结果的干扰，尽量选取菜梗部分)，用家用型搾汁机约可榨取70ml的青菜汁，初始pH为5.5。用重蒸水适当稀释后，用一定量的Tris缓冲液将样品的pH调至6.0-8.0。外源添加一定量的以青菜作为食品安全检测时，经常出现超标或残留的有毒有害物质(重金属Hg、有机磷类农药1605(图9))，进行拟污染青菜样品的制备。用实施例2得到的发光杆菌CCTCCM208027冻干粉和实施例4提供的方法进行检测，检测发光值受抑情况时，NaCl浓度为0.5w/v%，检测结果如图9。实施例6发光杆菌CCTCCM208027在食品安全检测中的应用一面粉称取新鲜的面粉l.OOg，溶解于10ml重蒸水中，剧烈震荡后置于室温静置30分钟，取其上清液分别于不同样品中添加一定浓度的有毒有害物质(重金属Hg(图IO)或农药1605(图ll))等，用实施例2得到的发光杆菌CCTCCM208027冻干粉和实施例4提供的方法进行检测，检测发光值受抑情况时，体系中的NaCl浓度为L5w/v%，检测结果如图10和图11。实施例7发光杆菌CCTCCM208027在食品安全检测中的应用一猪肉称取新鲜猪肉250g，置于千净托盘中，用保鲜膜包裹后，放入-2(TC速冻数小时，待样品完全结冻后再于室温下完全解冻，用肉汁浸出液(约10ml)进行拟污染样品的制备。外源添加一定量的猪肉作为食品安全检测时，经常出现超标的有毒有害物质(重金属Hg、亚硝酸盐N02—(图12))。用实施例2得到的发光杆菌CCTCCM208027冻干粉和实施例4提供的方法进行检测，检测发光值受抑情况时，体系中NaCl浓度为4.8w/W，检测结果如图12。实施例4一7的结果表明，发光杆菌CCTCCM208027可以用于检测不同食品样品中存在的毒性物质。在待检测的几种食品样品中，发光杆菌CCTCCM208027对苹果、青菜、面粉食品中存在的农药1605检测也较为敏感，与发光杆菌CCTCCM208027在水样中能够响应到的IC5。的浓度略有差别。对面粉样品的检测，发光杆菌CCTCCM208027对面粉中重金属Hg和农药1605的响应，与发光杆菌CCTCCM208027在水样中能够响应到的ICs。的浓度基15本一致。说明面粉样品的成分较果蔬类食品，微环境相对简单，用发光杆菌CCTCCM208027检测较为灵敏。而对于猪肉食品的检测结果表明，猪肉作为典型的动物源性食品，其食品的微环境比果蔬类、谷物类食品都要复杂的多，发光杆菌CCTCCM208027对该样品中有毒有害物质N02—的响应要略低一些。对比例1材料和方法T3小种，按照文献(发光细菌对化合物的致突效应与检测研究.环境科学学报，1993，13(4):435-441;发光细菌暗变种对土地处理的工业废渣的致突变效应.环境科学学报，1994，14(3):349-354))的相关报道。在其最为灵敏(一般来说，发光细菌高盐浓度比低盐浓度时检测灵敏度高)的检测体系中盐浓度为3w/vQ^，对重金属Hg、Cu、Pb响应的ICs。如表2所示。实施例2得到的发光杆菌CCTCCM208027冻干粉，按照实施例4中的检测方法，分别将检测体系中盐(NaCl)的终浓度分别为0.6和3.0w/v%。得到的发光杆菌CCTCCM208027对部分有毒有害物质的响应的IC5o结果与上述文献报道的结果相比较，结果见表2。表2发光杆菌CCTCCM208027和T3的IC5。比较<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>结果表明，3种重金属离子对发光杆菌CCTCCM208027的毒性作用顺序与对T3发光菌毒性顺序一致。除Hg以外，采用发光杆菌CCTCCM208027，对毒性测试的灵敏度有明显提高。更重要的是，对于部分对盐浓度比较敏感的样品而言，使用发光杆菌CCTCCM208027进行检测时，检测体系中对盐浓度的要求远远低于T3小种，更有利于检测的准确性；而即使在同样盐浓度下(3w/v%)，发光杆菌CCTCCM208027的检测灵敏度也更占优势。实施例8发光杆菌CCTCCM208027检测温度试验材料和方法实施例2得到的发光杆菌CCTCCM208027冻干粉，按照实施例4中的检测方法，检测体系中NaCl的终浓度为1.0w/v%，分别在10°C、20°C、25°C、30'C进行冻干粉的孵育及检测。结果见图13结果表明，虽然发光细菌的最适检测温度为15°C，但在10°C、20°C、25t:的条件下，即使其发光值均要低于15°C，但这并不影响该发光细菌对有毒有害物质响应的检测灵敏度，其在10-25°C(即室温条件)对重金属Hg响应的ICw均为0.5ppm。实施例9制备试剂盒试剂盒中提供实施例2得到的发光杆菌CCTCCM208027冻干粉;空白(阴性)对照去离子水；阳性对照(氯化汞/或其它标准品)；盐溶液0.6w/v-6.0w/v^的钠盐溶液；Tris缓冲液、测试管、产品说明书。实施例10发光杆菌CCTCCM208027用于检测重金属阳离子检测半数效应浓度(EC50)的方法a、培养到对数生长期的发光杆菌CCTCCM208027,0D咖&1.0，发光值"2000万—3000万RLU/s/100ul，取10ml菌液，4°C，7000rpm/分钟，离心3分钟，弃去上清液，用10ml0.2。/。NaCl盐溶液溶解，并上下颠倒混匀，置于5-30。C水浴锅中，备用；b、将不同重金属盐用无菌水配置成10rag/ml母液，制备检测样品时，用无菌水稀释成不同浓度梯度的含有重金属阳离子的检测液各lml，再加入NaCl，调整其盐浓度为0.9%和2.0%，供检测用；c、用微量移液器轻柔吹打均匀菌液，以每管O.lml分装到各检测管，立即置于化学发光仪上检测各管本底发光值；d、将制备好的样品溶液0.9ml加入可检测管中，上下颠倒混匀，再置于5-30'C水浴锅中反应10-30分钟后，检测与对照组相比较各检测管发光值受抑情况，并计算与空白对照相比，使发光值抑制50%时的样品浓度，即为该发光细菌CCTCCM208027对该重金属阳离子检测的ECM(mg/L)。结果见表3。表3发光细菌CCTCCM208027对重金属阳离子检测的EC5。(mg/L)试剂0.9。/。NaCl中发光细菌CCTCCM208027的ECso2。/。NaCl中发光细菌CCTCCM208027的ECm)2%NaCl中MicrotoxTM的ECso汞0,040.0390.065a砷0.10.19NF锌2.51.072.5a,17b,2-49d铜0.652.128a铅0.60.82lla,0.6b镉7.514.3741.4d，106e钴2049.89356b，135-177eNF:无报告或汇编的ECso:aBulichandIsenberg，1981;bKahru,1993;cKaiserandPalabrica,1991;dBlondinetal.，1987;eMunkittricketal.，1991.实施例11发光杆菌CCTCCM208027用于检测有机毒物检测半数效应浓度(EC50)的方法同实施例10，其中b、检测样品制备时，各种有机试剂均直接用无菌水稀释成不同浓度梯度的待检测液；各种农药用无菌水配置成10mg/ml母液，制备检测样品时，再用无菌水稀释成不同浓度梯度的含有农药的检测液各lml，再加入NaCl，调整其盐浓度为0.9°/。和2.0%，供检测用；结果见表4。18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>报告或汇编的EC50:aBulichandIsenberg'1981;bKahru,1993;cKaiserandPalabrica,1991;dBlondinetal.,1987;eMunkittricketal.,1991.在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种微生物CCTCCM208027(Photobacteriumsp.)，它具有以下特性(i)菌体呈短杆状；(ii)菌落呈乳白色、半透明；(iii)菌落及菌液均能发出蓝绿光。2.—种如权利要求l所述的微生物的用途，其特征在于，所述的微生物用于检测食品或水样中总体生物毒性。3.—种食品或水样中总体生物毒性的检测方法，其特征在于，它包括步骤(1)将如权利要求l所述的微生物分别与待测食品和空白对照品混合，分别得到待测混合物和阴性对照混合物；(2)检测待测混合物发光值，同阴性对照混合物发光值比较，获得发光强度抑制率；(3)如果发光强度抑制率》50%，则说明待测品有毒。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的待测混合物和/或阴性对照混合物中含有盐，所述盐浓度为O.l—6.0w/v%;所述的盐优选钠盐。5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述待测混合物和/或阴性对照混合物p朋-8。6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，它还使用阳性对照混合物，所述阳性对照混合物中含有阳性对照品、如权利要求1所述的微生物和盐，所述阳性对照混合物中盐浓度为0.l—6.0w/V/。，所述阳性对照混合物的发光强度抑制率等于50%;所述的盐优选钠盐。7.如权利要求3或6所述的检测方法，其特征在于，所述的空白对照品选自去离子水或无毒食品。8.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的食品选自谷物、水果、蔬菜、肉禽类、或海产食品；所述的水样选自饮用水、污水、或灌溉水。9.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测可在1一37'C进行；优选5—30。C。10.—种食品或水样中总体生物毒性检测试剂盒，其特征在于，它包括如权利要求l所述的微生物、空白对照品、阳性对照品、盐溶液和缓冲液；所述的微生物优选发光杆菌CCTCCM208027冻干粉。全文摘要本发明公开了发光杆菌CCTCCM208027。本发明还公开了发光杆菌CCTCCM208027在食品或水样总体生物毒性检测中的应用。本发明还公开了一种含有发光杆菌CCTCCM208027的可检测食品或水样中总体生物毒性的试剂盒。文档编号C12N1/20GK101560491SQ20091013501公开日2009年10月21日申请日期2009年4月15日优先权日2008年4月15日发明者洪源范,翟琦巍,陈中建申请人:中国科学院上海生命科学研究院