专利名称：肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光rt-pcr联合检测方法及 ...的制作方法
技术领域：
本试发明属于病毒核酸检测领域，涉及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠 道病毒其它各亚型病毒RNA的检测方法，特别是涉及使用三色荧光探针定量PCR技术 (PCR-三色荧光探针法)快速准确的检测出样品(粪便、咽拭子标本、疱疹液、脑脊液或病毒 分离培养物标本等)中肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚型的方法。 本发明进一步涉及用于该病毒临床检测的试剂盒，适用于人肠道病毒感染的实验室快速检 测。
背景技术：
手足口病(Hand，foot and mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的急性传染 病，病毒以肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CAV16)多见，多发生于学龄前儿童， 尤以3岁以下年龄组发病率最高。主要症状表现为手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹，少数 重症病例可出现神经系统症状等，多由EV71感染引起，致死原因主要为重症脑干脑炎及神 经源性肺水肿。病人和隐性感染者均为传染源，主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径 传播。人类肠道病毒(Enterovirus，EV)为颗粒较小的RNA病毒，呈20面体，直径24 30nm,不合类脂体，核心有单链核糖核酸，耐乙醚和其它脂溶剂，耐酸，对各种抗生素、抗病 毒药、去污剂有抵抗作用。多数病毒在细胞培养中产生细胞病变。自1959年首次报道由人 类肠道病毒(Enterovirus, EV)导致手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD) 艮 道以来，HFMD已经在全球多次暴发。1974年美国发现肠道病毒71型(EV71)也常致HFMD 流行，同时柯萨奇A组(CAV16、CAV9、CAV5等)致HFMD也有报道。1997年马来西亚发生了 主要由EV71引起的手足口病流行，仅4 6月就有29例病人死亡。1998年EV71感染在我 国台湾省引发大量手足口病和疱疹性咽峡炎并有大量儿童因病致死。HFMD常由多种肠道病毒共同引起，而EV71和CAV16往往是手足口病暴发流行的 最主要病原，二者在遗传学上密切相关，常为混合感染和交替感染。我国手足口病流行，其 病原亦主要为EV71型和CAV16。通常情况下，EV71与CAV16引起的HFMD在临床症状上难 以区别。本病急性起病，发热，口腔粘膜出现散在疱疹，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，疱疹 周围可有炎性红晕，疱内液体较少。可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等症状。部分病例仅表现 为皮疹或疱疹性咽峡炎。预后良好。少数急性病例可出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、 循环障碍等，病情凶险，可致死亡或留有后遗症。临床诊断病例具有下列之一者即可确诊 1.肠道病毒(EV71、CAV16等)特异性核酸检测阳性；2.分离出肠道病毒，并鉴定为EV71、 CAV16或其它可引起手足口病的肠道病毒；3.急性期与恢复期血清EV71、CAV16或其它可引 起手足口病的肠道病毒中和抗体有4倍以上的升高。
发明内容
目前对于该种肠道病毒感染的实验室检查主要包括以下方面1.病毒感染常规 检查包括细胞和生化检查。2.病原学检查，肠道病毒(EV71、CAV16等)特异性核酸阳性或分 离到肠道病毒。3.血清学检查，ELISA方法检测急性期与恢复期血清EV71、CAV16或其它肠 道病毒中和抗体有4倍以上的升高。血清学检查必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗 体的基础上，而且鉴于流感病的的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性 难以保证，容易出现假阳性和假阴性，也无法进行快速检测。从标本中分离猪流感病毒，进 行鸡胚接种和细胞培养可能会比较敏感，但是这种方法需要几天的时间。肠道病毒(EV71、 CAV16等)特异性核酸检测需要进行RT-PCR试验，并需要测序证实。虽然具灵敏度比上述方 法略有提高，但是这种方法仅是基于一对核酸引物进行扩增，结果容易产生非特异性扩增， 甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝 胶电泳分析，操作繁琐。三色荧光定量PCR技术原理是基于单色荧光定量PCR技术，是指在同一个荧光定 量PCR扩增试验中同时扩增三个目的基因，探针为多种荧光标记比如FAM、VIC、JOE、NED、 HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。利用该原理发明的 试剂盒在同一个标本的检测中，可以同时检测出肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠道 病毒其它各亚型，实现了一个标本中同时检测多种肠道病毒，并对病毒进行分型的目的，应 用极为方便。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性 得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高且容易漏检的问题。基于三色荧光定量PCR技术原理，为了克服现有检测技术中的缺陷和不足，本发 明提供了一种使用三色荧光定量PCR技术(PCR-三色荧光探针法)快速准确检测出样品 (疑似病人粪便、咽拭子标本、疱疹液、脑脊液或病毒分离培养物标本等)中肠道病毒71型、 柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚型病毒的RNA的方法。该方法包括(1)采集和运 送感染或疑似病人样本(疑似病人粪便、咽拭子标本、疱疹液、脑脊液或病毒分离培养物标 本等)；(2)样本预处理和提取RNA ； (3) 一步PCR-三色荧光探针体外扩增法对样本进行检 测合成特定引物和荧光探针，用三色荧光定量PCR反应技术并用三色荧光PCR反应液(PCR MIX)对样本进行扩增检测；(4)扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本 进行分析，从而判断所采集的样本中道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚 型的存在并根据质控品对标本中的病毒进行精确定量。从Genbank下载所有肠道病毒的基因序列，经过生物信息学分析反复比对，选择 如下区域作为扩增肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CAV19)和肠道病毒其它各亚 型(EV-U)的特异性目标区域(1)肠道病毒71型(EV71)上游引物5，-GCGTTTTGACGCAGAGTTCA-3，(SEQ ID NO. 1)(2)肠道病毒71型(EV71)下游引物5，-GGAGCAATTGCGGGACAA-3，(SEQ ID NO. 2)(3)肠道病毒71型(EV71)荧光探针FAM-5’ CTTTGTTGCATGCACCCCTACCGG—3，TAMRA (SEQ ID NO. 3)(4)柯萨奇病毒A16型(CAV16)上游引物
5，-GGGACCGGGAATGAAAATTC-3，(SEQ ID NO. 4)(5)柯萨奇病毒A16型(CAV16)下游引物5，-ATGCGTCAGAA/GCTGCACCA/G-3，(SEQ ID NO. 5)(6)柯萨奇病毒A16型(CAV16)荧光探针J0E-5，TCCTCCCTACGCCACTACACAGCCTG-3，TAMRA (SEQ ID NO. 6)(7)肠道病毒各亚型(EV-U)上游引物5，-AGC/TGGGTA/GGIGIGICGTAACG-3，(SEQ ID NO. 7)(8)肠道病毒各亚型(EV-U)下游引物5，-TCACCATAAGCAGCCAA/GTATAA/T-3，(SEQ ID NO. 8)(9)肠道病毒各亚型(EV-U)荧光探针VIC-5，TAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTT-3，TAMRA (SEQ ID N0. 9)根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的检测肠道病毒71型、柯萨奇病毒 A16型和肠道病毒其它各亚型病毒的荧光标记分别为FAM、JOE和VIC，所以称为三色荧光检 测。根据本发明的一个优选实施方案，首先用普通RT-PCR定性扩增阳性标本，阳性样 品的PCR产物电泳结果显示，可见与目的片段一致的的特征条带，而阴性样品都无该特征 条带，图1，证明引物正确。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说试剂盒是一种用于快速实时定量检测 肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A16型以及肠道病毒各亚型的试剂盒，该试剂盒包括(1)病 毒核酸提取试剂；(2)逆转录酶系和Taq酶系；(3)三色荧光PCR反应体系(PCRMIX) ； (4)阳 性和阴性质控品等。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的检测肠道病毒71型、柯萨奇病毒 A16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光定量PCR反应体系(PCR MIX)是由肠道病毒71型 (EV-71)特异性上游和下游引物、一条特异性荧光探针(Fam荧光标记)、柯萨奇病毒A16型 (CAV-16)的特异性上游和下游引物、一条特异性荧光探针(J0E荧光标记)、肠道病毒各亚 型(EV-U)特异性上游和下游引物、一条特异性荧光探针(VIC荧光标记)、PCR反应缓冲液 (FQ-Buffer,内含镁离子、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体(dNTPs)、PCR扩增增强剂和去离 子水等成分构成的反应体系。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的PCR反应体系(PCR MIX)的按照如 下方式配制每份反应液(PCR MIX)各引物(50ρπιο1/μ1)各 0·2μ1各荧光探针(30pmol/μ 1)各 0· 1 μ 1dNTPs (各 2. 5mM)2 μ 1PCR 反应缓冲液(FQ-Buffer)16. 5 μ 1_Total20. 0μ 1以上体系配制后需要放在-20 °C保存，其中PCR反应缓冲液组成 50mMTri s-HCl (pH8. 0)、3. 5mM MgC12、50mM KCl、25mmol/L(NH4) 2S04 组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的阳性质控品是EV71的特异性目的 片段扩增后经过克隆的质粒，其精确的拷贝数为107ml，阴性质控品为经DEPC处理和高压 灭菌的PCR缓冲液。根据本发明的一个优选实施方案，其中所采用的荧光定量PCR扩增条 件为ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)， ABIPRISM7300/7500(使用8联管)、MJ Opticon (使用8联管)等使用薄壁管的仪器，循 环条件为42 20分钟，然后93°C — 2分钟，然后93°C 30秒一55°C 45秒，40个循环； LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件为42°C— 20分钟，93°C— 2分钟，然后93°C 5 秒一550C 45秒，共40个循环。根据本发明的一个优选实施方案，反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品 Ct值在40以上，Ct值小于35个循环的为阳性；Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进 行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在35-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值 增长为阴性，扩增动力曲线见图2。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒的定量检测的上下限度测定方法如下用TE buffer制成稀释阳性标准品(107COpieS/ml)，分别作为线性及灵敏度 参考品，标准品浓度分别为为 1. OX 107/mlU. OX 106/mlU. OX 105/mlU. OX 104/ml、 1.0X107ml、1.0X107ml、1.0X107ml。每个稀释度作3份重复测定。分析|r|值， 均可达到|r|彡0.99，结果证实本试剂盒检定线性上下限度为1.0X102COpieS/ml 1. 0X107copies/ml。电泳图如图 3。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒的定量检测准确度测定方法如下用连 续生产的三批本试剂盒和对照公司的同类试剂盒在同一台PCR扩增仪上检测观察其|r|值 和检测灵敏度的变化。实验结论为Ir I彡0.97，定量准确度CV <30%。本试剂盒的定量检测下限为1. OX IO2Copies ；灵敏度为1. 0X 102copies。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒的定量检测特异性测定方法如下用本 试剂盒在对500例疑似病人进行常规检测，其中检测出EV71阳性76例，CAV1634例，肠道 病毒通用型43例，后经测序鉴定证实，吻合率为100%，未出现假阳性和假阴性。本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验验证证实，具有良好的重复性好和稳定 好的性能。在-20°C条件下试剂盒可有效期可以达12个月。针对肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚型核酸序列所设计的 引物和三色荧光探针扩增特异性基因片段，不但可以检测肠道病毒71型，同时还可以检测 柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚型核酸，从而实现了一个标本中同时检测三种病毒 的目的，应用极为方便。由于该方法引入了特异性扩增引物和三色荧光探针，使得检测具有 更好的灵敏度和特异性，从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。同时本发明引入了 阳性质控品作为实验的对照和定量标准，对感染的肠道病毒RNA进行快速检测并定量。另 外一个方面，本发明使用了一步法荧光定量PCR扩增技术，简化了试验过程提高了检测效 率。一般来说，从处理样本到结果的判断仅需要2小时左右。所以与传统方法相比，本发明 具还具有有操作简单、快速方便的优点。因此，本发明的试剂盒为临床标本的快速检测和大 样本普查提供了新的方法，并为疑似病人的筛查使用提供了可靠的方法学依据。四
图1显示根据常规的的普通RT-PCR定性扩增阳性标本，阳性样品的PCR产物 经2%琼脂糖凝胶电泳结果显示可见到与目的片段一致的的特征条带，而阴性样品都无 该特征条带，证明引物正确。其中样本编号1-3为肠道病毒71 (EV71)，4-6为柯萨奇病毒 A16(CAV16)、7-10为肠道病毒通用型(EV-U)。图2，为阳性质控品的梯度稀释的扩增结果， 显示标准的扩增结果动力学曲线，呈S型，扩增效果较好。图3试剂盒检测限度测试电泳图 谱，其中1 5为梯度稀释的质控标准品PCR反应产物，2%琼脂琼脂糖凝胶，样品浓度分别 为 1. 0X106/ml、1. OX 105/ml、l. 0 XioVml、1. 0 X103/ml、1. OX 102/ml)。
五具体实施例方式实施例1 标本的采集和运送适用标本类型包括疑似病人粪便、咽拭子标本、疱疹液、脑脊液或病毒分离培养物 标本等。咽拭子标本采集病人发病3日内的咽拭子标本，用专用采样棉签，适度用力拭 抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有1 2ml保存液(维 持液或生理盐水)的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密闭送检。疱疹液 用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液， 迅速将棉签放入内装有1 2ml保存液(维持液或生理盐水)的采样管中，在靠近顶端处 折断棉签杆，旋紧管盖并密封。脑脊液标本出现神经系统症状后3天内，采集量为1. 0 2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中。密闭送检测。粪便用灭菌捻拭子拭取粪 便或腹泻物置入无菌玻璃管(含0. 4ml灭菌生理盐水)，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送 检。上述标本短期内可保存于-20°C，长期保存可置-70°C，但不能超过6个月，标本运送应 采用0°C冰壶，采集标本应立即(12h内)送达实验室。实施例2 肠道病毒RNA的提取样品处理取500 μ 1样品液加入500 μ 1病毒浓缩液充分震荡，4 V冷冻 离心机13，OOOrpm离心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的样品液体，加入150ul Triz0lreagents(RNA提取液)充分震荡，室温放置5min。加入IOOul氯仿，用力震荡15s, 室温静置5min，4°C 13，OOOrpm离心lOmin。小心将上层水相转移到干净离心管中，加等体 积异丙醇，充分混勻，13，OOOrpm离心lOmin。弃上清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分 混勻，13，OOOrpm离心lOmin，小心吸去大部分乙醇。将提取管敞口在室温空气中干燥5min 待乙醇挥发干净，用20μ1 DEPC Η20溶解沉淀。阴性质控品取50 μ 1阴性质控品加入 150 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)充分震荡，室温放置lOmin。后按上述操作，EV71阳 性质控品直接取3 μ 1进行PCR扩增。实施例3 本检测方法和试剂盒适用的仪器适用仪器主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCRSystem7500, ABI PRISM 7300, LightCycler 等，LightCycler 等毛细管的仪器，MJOpticon 系列或取得资 格认证的定量PCR仪。实施例4 三色荧光PCR方法对肠道病毒RNA进行检测从试剂盒中取出PCRMIX、Taq酶系，逆转录酶系，室温融化并振荡混勻后， 10，OOOrpm离心10s。设所需要的PCR反应管管数为N(N =样本数+1管阴性对照+1管阳 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净0.2ml离心管中，充分混勻， 10，OOOrpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入22 μ 1，向每管中加入处理后样 品(提取RNA)或阳性质控品和阴性质控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬时离心10秒。将各反应管 放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性质控品以及未知标本，并 设置样品名称、标记荧光基团种类(报告基团FAM、猝灭基团TAMRA)和循环条件ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)、MJ Opticon (使用8联管)等使用薄壁管的仪器，循环条件 42°C— 20 分钟，然后 93°C— 2 分钟，然后 93°C 30 秒一55°C 45 秒，40 个循环。LightCycler 等使用毛细管的仪器，循环条件42°C— 20分钟，93°C— 2分钟，后93°C 5秒一55°C 45秒， 共40个循环。实施例5 结果分析和判定反应结束后，首先选择一种荧光(AM对应EV71、JOE对应CAV、16VIC对应EV-U)， 使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循环的为阳性；Ct值在 35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在35-40个 循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。需要满足阴性质控品应为全部阴性；阳 性质控品的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。以上条件应同时满足，否则此次试 验视为无效，全部试验应重新进行。本试剂盒将逆转录和定量PCR检测的过程放在一起，无需两步发来检测，大大简 化了检测流程节省了检测时间。用本试剂盒可以在2小时内快速检测某标本是否感染有肠 道病毒71型、柯萨奇病毒CAV16和肠道病毒其它各亚型，以及是哪一种型肠道病毒。也就 是说本试剂盒的每份试剂一次检测就同时具有检测三种病毒的能力。实施例6 本发明方法的临床应用使用本发明的方法和试剂盒，对大量标本进行定量PCR检测，并最终经测序实验 验证。结果显示本发明方法的试剂盒，灵敏度为102COpieS，准确性和特异性达100%，重 复性和稳定性较好，本试剂盒的保存条件和有效期为-20°C，12个月。本方法的发明为增 肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CAV19)和肠道病毒其它各亚型(EV-U)的检测 和疫情的预防控制方案的制定提供科学的、个体化的分子生物学实验数据，为病人的诊断 提供可靠的分子病毒学证据。如果病样品中出现上述病毒的存在，就提示可能为相应病毒 的感染，则需要立即采取相应措施，也避免产生不必要的后果。六、序列表SEQUENCE LISTING<110>北京索奥生物技术有限公司<120>肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光RT-PCR 联合检测方法及其试剂盒
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<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7agctgggtag gtgtgtcgta acg23<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8tcaccataag cagccaagta taat24<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>9taactctgca gcggaaccga ctactt2权利要求
一种肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光RT-PCR联合检测方法及其试剂盒，从Genbank下载所有肠道病毒的基因序列，经过生物信息学分析，反复比对，选择如下区域作为扩增肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CAV19)和肠道病毒其它各亚型(EV-U)的特异性目标区域(1)肠道病毒71型(EV71)上游引物5’-GCGTTTTGACGCAGAGTTCA-3’(SEQ ID NO.1)(2)肠道病毒71型(EV71)下游引物5’-GGAGCAATTGCGGGACAA-3’(SEQ ID NO.2)(3)肠道病毒71型(EV71)荧光探针序列5’-CTTTGTTGCATGCACCCCTACCGG--3’(SEQ ID NO.3)(4)柯萨奇病毒A16型(CAV16)上游引物5’-GGGACCGGGAATGAAAATTC-3’(SEQ ID NO.4)(5)柯萨奇病毒A16型(CAV16)下游引物5’-ATGCGTCAGAA/GCTGCACCA/G-3’(SEQ ID NO.5)(6)柯萨奇病毒A16型(CAV16)荧光探针序列5’-TCCTCCCTACGCCACTACACAGCCTG-3’(SEQ ID NO.6)(7)肠道病毒各亚型(EV-U)上游引物5’-AGC/TGGGTA/GGTGTGTCGTAACG-3’(SEQ ID NO.7)(8)肠道病毒各亚型(EV-U)下游引物5’-TCACCATAAGCAGCCAA/GTATAA/T-3’(SEQ ID NO.8)(9)肠道病毒各亚型(EV-U)荧光探针序列5’-TAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTT-3’(SEQ ID NO.9)。
2.根据权利要求1所述的一种色荧光RT-PCR联合检测方法及其试剂盒，柯萨奇病毒 A16型(CAV16)下游引物(SEQ ID NO. 5)、肠道病毒各亚型(EV-U)上游引物(SEQ ID NO. 7)、 肠道病毒各亚型(EV-U)下游引物(SEQ ID NO. 8)，其中，其中A/G表示此处碱基是A或者 G，C/T表示此处碱基是C或者T，A/T表示此处碱基是A或者T。
3.根据权利要求1所述，其中所说的检测肠道病毒71型(SEQID NO. 3)、柯萨奇病毒 A16型(SEQ ID NO. 6)和肠道病毒其它各亚型病毒(SEQ ID NO. 9)的探针5，荧光标记分别 为FAM、JOE和VIC，所以称作三色荧光检测，探针3’标记为TAMRA。
4.根据权利要求1所述该试剂盒包括(1)病毒核酸提取试剂；(2)逆转录酶系和Taq 酶系；(3)三色荧光PCR反应体系(PCR MIX) ； (4)阳性和阴性质控品等，其中所说的PCR反 应体系(PCR MIX)的按照如下方式配制每份反应液(PCR MIX)各引物(50pmol/y 1)各 0·2μ1各荧光探针(30ρπιΟ1/μ 1)各0. Ιμ dNTPs (各 2. 5mM)2 μ 1PCR 反应缓冲液(FQ-Buffer)16. 5 μ 1Total20. 0μ 1其中所采用的荧光定量PCR扩增条件为ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700 、ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500 (使用 8 联管)、MJ Opticon (使用 8 联管)等使用薄壁管的仪器，循环条件为42°C— 20分钟，然后93°C— 2分钟，然后93°C 30 秒一550C 45秒，40个循环；LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件为42°C— 20分 钟，93°C — 2分钟，然后93°C 5秒一55°C 45秒，共40个循环。
全文摘要
本发明提供了肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光RT-PCR联合检测方法及其试剂盒，快速准确的检测出样品中肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚型核酸的方法。该方法包括(1)采集和运送感染或疑似病人样本；(2)样本预处理和提取RNA；(3)一步PCR-三色荧光探针体外扩增法对样本进行检测；(4)扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒其它各亚型核酸的存在，并能够对对其进行准确定量(图3)，实现了对该类病毒实时快速精确联合检测之目的。
文档编号C12Q1/68GK101886138SQ20091013661
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月11日 优先权日2009年5月11日
发明者任美峰, 刘健翊, 史成军, 徐贵峰 申请人:北京索奥生物技术有限公司