专利名称：检测番茄溃疡病菌的巢式nest-pcr的扩增引物及其检测试剂盒和试剂盒使用方法
技术领域：
本发明是一种番茄细菌性溃疡病菌的基因检测扩增引物及其试剂盒，属 于植物病原菌的4企测领域，专一针对番茄细菌性溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp, michiganens is ( Cmm )的才企测。适用于番痴纟田菌'l"生 溃疡病菌的田间预防及进出口植物检疫中C隱快速片企测。
背景技术：
番茄细菌性溃疡病是番茄最重要、危害性最大的病害之一。该病害可引 起植株萎蔦、溃疡和果实斑点，严重影响果实的产量和质量。该病菌能侵染 多种茄科植物并引起蔬菜大量减产，给农业生产带来巨大的经济损失。因而， 目前欧洲、美洲、亚洲的大多数国家都将其列为重要的检疫对象。我国自从 1981年首次在北京发现以来，辽宁、山西、黑龙江、新疆等地已相继才艮道该 病的发生。甘肃省河西地区外繁种子基地是全国最大的对外制种基地，其中 番茄对外制种已经有20年历史，面积占总制种面积的10-20%，近年来，已 经在田间屡次发现番茄细菌性溃疡病，因此所有的外国司都将其列为禁止 携带的病害，由于我国目前对该病的研究很少，快速检测技术尚未建立，每
年都因为未能及时准确的对该病进行快速、准确地鉴定而造成种子退货，给 农户和制种公司带来巨大的经济损失。
该病病原属密^丸安棒形杆菌密4丸安亚种(Clavibacter michiganensis subsp， michiganensis )。种子是其远距离传播的主要途径，一4殳种传率在l%-5°/。，病菌还可存活于土^裏和植物病残体中，存活期可长达2-3年。由于 种子带菌率很低，传统的生物学方法很难快速地分离到病原，且程序烦瑣； 即使比较灵敏的酶联免疫(ELISA)法检测，也会造成漏检，且检测成本过 高，无法适应口岸检疫所要求的快速、准确、灵敏的要求。90年代初期，国 外学者将分子生物学方法用于该病的检测，检测灵敏度得到了极大的提高， 最低检测限达到了 100个细菌/反应体系。即便如此，在检测周期上却没有 大的提高，且传统的薩A抽提过程损失了太多的病原菌，因而不可避免地降 低了 PCR方法应有的灵敏度。
中国专利200410041287. 9公开了一种番茄溃疡病的4企测试剂盒，最低 检测限达到了 5 0个细菌/反应体系。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种^r测番茄溃疡病菌的 巢式Nest-PCR的扩增引物。
本发明的另一目的是^^开了一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速々企 测试剂盒及其使用方法。本发明对番茄种子进行简单快速的病原菌抽提，去 除种子杂质和影响PCR反应的成分，获得相对纯净的细菌做为PCR扩增摸板， 用两对嵌套式引物对模板DNA进行扩增，可以在12小时内完成整个PCR检 观'J,不但极大地提高了检测灵敏度，而且缩短了检测时间，且结果准确、可 靠，是一种行之有效的植物病原细菌分子生物学检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为 一种检测番茄溃疡病菌的 巢式Nest-PCR的扩增引物，其主要特点是
第一对引物上游长度为28bp，下游长度为26bp的核苷酸序列如下 C醒-A: gtgatgtcagagcttgctctggcggatc; C薩-a: gtacggctaccttgttacgacttagt;
第二对引物上游长度为23bp，下游长度为31bp的核苷酸序列如下C丽-B: ccccgactctgggataactgcta ; C醒-b: cggttaggccactggcttcgggtgttaccga; 经过两次扩增，最终可得到分子量为1297bp的DNA产物。
所述的检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其扩增条件为
第一次第一组引物，其扩增条件为PCR循环增加M分钟，94摄氏度 高温裂解细菌；释放DNA作为扩增模板；PCR反应条件为94。C变性30秒， 58。C退火30秒，72。C延伸40秒，35个循环。
第二次第二组引物，其扩增条件为94。C变性30秒，58。C退火30秒， 72。C延伸40秒，35个循环。
一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒，其主要特点是， 包括有PCR緩冲液9 x -10 x ，氯化镁25-20 mmol/L; dNTP 9-10 mmol/L， Taq酶2 IU/uL;引物C應-A和C画-a各10-15 pmol/yL，引物C薩-B和 C應-b各10-15 pmo1/ u L,双蒸水99% ~ 100°/。，检测PCR管6个，阳性对照 PCR管3个，阴性对照PCR管3个，阳性对照1管，阴性对照1管。
一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速^^测试剂盒的使用方法，其主 要特点是步骤为
(1) 植物病原细菌的收集和培养；
(2) 第一对引物PCR扩增；
(3) 以第一次扩增结果为才莫板对第二对引物PCR扩增；
(4) 1-1. 5°/。琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；
(5) 对条带进行分析得出结论。 所述的番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒的使用方法，所
述的植物病原细菌的收集和培养的具体步骤是
(a)制备抽提緩沖液:Na2SO30. 13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP ) 2g/ml， 叠氮化纳0. 02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20 (tween-20)各0. 5ml/L，调制 pH为7. 4;抽提緩沖液使用量根据需要配置，一4殳种子和緩冲液的重量比约为1: 2-10。
(b)制备待检测材料按照每两克种子加入2ml提取緩冲液的比例，研 磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清液，5000rpm(转/每 分钟)离心5分钟，用100 u L重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增。
一种番茄溃疡病病菌的巢式Nest-PCR基因组DM ^是取方法如下
A. 取1. 5ml菌体培养物于灭菌Ep管中，12000rpm(转/每分钟)离心1分 钟，除去上清液，收集菌体；
B. 在A步骤中收集的菌体中加入400ul裂解液，所述的裂解液由40raM 三羟曱基氨基曱烷-醋酸(Tris-醋酸)，20幽的醋酸钠，在lmM乙二胺四乙酸
(EDTA ) ， 1%十二烷基磺酸钠(SDS ) ， pH7. 8的条件下混匀，置于37。C水浴1 小时制得；
C. 加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm(转/每分钟)离 心15分钟；
D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
E. 在上清液里，加两倍体积无水乙醇，上清液1/10体积的醋酸钾 (3M，pH8. 0), -2(TC保存1小时后,13000rpm(转/每分钟)离心15分钟， 弃上清液，沉淀用70°/。乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液 中，置4'C保存备用。
本发明的有益效果是本发明番茄细菌性溃疡病菌的检测试剂盒，涉及 一种检测危险性植物病原菌的分子技术，尤其是能快速、筒便、准确的检测 病原菌的试剂盒，在12小时内就可以完成4企测。
本发明提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服现有的植物病原菌 检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足。该试剂盒能快速、灵敏、 准确的检测到病原菌，并直接可从植物种子、组织中4企测病原菌。大大简化 了检测程序，提高了我国口岸的检疫水平，同时为病害防治策略的制定提供 了依据。通过对番茄细菌性溃疡病菌的特异性4企测，引物C顧-A，C薩-a, C醒-B, C醒-b优化的PCR条件对目标菌抹扩增得到了 一段1297bp的PCR产 物，可以特异的检测目标菌。但是对于8种非目标菌，均无扩增产物。
通过灵敏度的检测，对番茄细菌性溃疡病菌纯菌液的直接PCR和 Nest-PCR检测比较，发现直接进行PCR扩增的最低检出限为2600个细菌 /ml，而Nested-PCR的最低斗t出量是13个细菌/ml。
通过对番茄^r测，均可从带菌种子中准确稳定的4企测到1297bp的PCR 产物，和ELISA;^测符合率为99%，且有1%的ELISA未4企测到的带菌种子， 该试剂盒也可以检测到目标条带，说明该试剂盒比ELISA试剂盒更加灵敏。
对于番茄溃疡病，该试剂盒可以不经过DNA提取而以病原菌为模板直接 进行一步法PCR才企测，对纯菌液Direct-PCR最低检出限为2600个细菌/ml， 而Nested-PCR最低检出限可达到13个细菌/ml;对种子提取液,Direct-PCR 不能检出，而Nested-PCR最低4企出限可达到3xl05个细菌/ml。
图1是试剂盒使用流程图2是本试剂盒引物特异性的验证和PCR条件优化； 其中M: 200bp DNA ladder;W:水。 图3是纯菌液的Nested-PCR检测灵敏度结果；
其中1、2. 6 x I05cells/ml ; 2、 2. 6 x I04celIs/ml; 3: 2. 6 x 103cel 1 s /ml; 4、 2. 6 x 102cells/ml; 5、 26cells/ml; 6、 3cells/ml; M、 200bp DNA ladder ; W、水。
图4是种子提取液的Nested-PCR检测灵敏度结果；
其中1、 7X108cells/ml; 2、 6X 107cells/ml; 3、 3X 106cells/ml ; 4、 3X105cells/ml;5、 3X 104cells/ml;6、 3X 103cells/ml; 7、 3X102cells/ml;M、 200bp DNA ladder; W、水； T、番痴阳性质控物DM。
图5对8种类非Cmm供试菌林的验证检测；
其中M: marker 1; C薩2-8:分别为丁香假单胞杆菌丁香致病型，番 茄细菌性溃痴病，番茄细菌性叶斑病菌，番茄细菌性裔痂病，十字花科蔬菜 黑腐致病变种，大豆细菌斑疹病，丁香假单胞杆菌丁香致病型，甜瓜细菌性 叶斑病菌。
图6本发明实施例5出口番茄Cmm4企测；
其中M: marker,1-11出口番痴种子C醒的Nest-PClU企测。
图7本发明实施例6田间样品的Cmm检测。
其中M:marker,1-4进口番茄种子CMM的Nest-PCR才全测。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释 本发明，并非用于限定本发明的范围。
试验例1:见图2,用C醒-A和C画-a—对引物对四个番茄溃疡病菌基 因组DNA进行检测，以测试试剂盒的有效性，结果发现，四个菌抹均扩增到 1487bp的目标条带，但作为对照的水无条带。
番茄溃疡病病菌基因组DNA才是取方法如下
A. 取1. 5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm(转/每分钟)离心1 分钟，丟去上清夜，收集菌体。
B. 在A步骤中收集的菌体中加入400ul裂解液，所述的裂解液由40mM 三羟甲基氨基曱烷-醋酸(Tris-醋酸)，20mM的醋酸钠，在lmM乙二胺四乙酸
(EDTA) ，1%十二烷基石黄酸钠(SDS) ，pH7.8的条件下混匀，置于37。C水浴l 小时制得；
C. 然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm(转/每分钟) 离心15分钟。D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
E. 加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8. 0)， -20度保存1 小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟，弃上清液，沉淀用70°/。乙醇洗 2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4'C保存备用。
试验例2:见图3,纯菌液的Nest-PCR检测灵敏度结果，结果表明，该 试剂盒对于纯菌液的检测灵敏度为26cell/ml。
试验例3:见图4，对模拟种子带菌的Nest-PCR检测灵敏度，结果表明， 该试剂盒对种子提耳又液的Nest-PClU企测灵每丈度为3X105cells/ml，比酶联
免疫高一个数量级。
试验例4:见图5，对8种类非C腿供试菌抹的验证检测 供试菌抹丁香假单胞杆菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pv Syringae), 西瓜纟田菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. citrul 1 i )， 番痴纟田菌'l"生叶扭王病菌(Pseudomonas. syringae pv tomato), 番痴纟田菌4生疱 痂病(Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria )， 十字花科蔬菜黑腐致病 变种 (Xanthomonas campestris pv. campestris )， 大豆纟田菌斑渗病 (Xanthomonas campestris phaseoli), 丁香假单胞杆菌丁香致病型 (Pseudomonas syringae pv Syringae),甜瓜纟田菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv. lachrymans )。
PCR反应条件为94。C变性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸40秒， 35个循环。使用菌液为模板时，变性时间延长至20分钟。扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析。
检测结果表明，见图5，以上八种供试菌，均未检出目标条带，说明试
剂盒有比较好的专一性。
实施例1: 一种检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物， 第一对引物上游长度为28bp，下游长度为26bp的核苷酸序列如下 C薩-A: gtgatgtcagagcttgctctggcggatc;C應一a: gtacggctaccttgttacgacttagt;
第二对引物上游长度为23bp，下游长度为31bp的核苷酸序列如下 C顧一B: ccccgactctgggataactgcta ; C醒-b: cggttaggccactggcttcgggtgttaccga; 所述的检测番茄溃痴病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其扩增条件为 第一次第一组引物，其扩增条件为PCR循环增加20分钟，M摄氏度 高温裂解细菌；释放DNA作为扩增模板；PCR反应条件为94。C变性30秒， 58。C退火30秒，72。C延伸40秒，35个循环。
第二次第二组引物，其扩增条件为Mr变性30秒，WC退火30秒， 72。C延伸4G秒，35个循环。
经过两次扩增，最终可得到分子量为1297bp的DNA产物。 实施例2: —种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速一企测试剂盒，包括有 PCR緩冲液10 x ,氯化镁25 mmol/L; dNTP 10画1/L， Taq酶2 IU/ u L; 引物CMM-A和C画-a各10 pmol/y L，引物CMM-B和C醒-b各10 pmo1/u L, 双蒸水99% - 100%,检测PCR管6个，阳性对照PCR管3个，阴性对照PCR 管3个，阳性对照1管，阴性对照1管。
实施例3: —种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速^r测试剂盒，包括有 PCR緩冲液9x,氯化4美20 tnmol/L; dNTP 9 mmol/L, Taq酶2 IU/uL;引 物C画-A和C薩-a各15 pmo1/ y L，引物C應-B和C醒-b各15 pmo1/ u L， 双蒸水99% ~ 100%，检测PCR管6个，阳性对照PCR管3个，阴性对照PCR 管3个，阳性对照1管，阴性对照1管。
实施例4:所述试剂盒的使用方法，见图1，包括以下步骤 (1)待检测材料的制备；按照每两克种子加入2ml提取緩冲液的比例， 研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm(转/每 分钟)离心5分钟，用100uL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增。抽提緩冲 液配方为Na2SO30. 13g/ml, PVP2g/ml，叠氮化纳0. 02g/ml，鸡蛋清蛋白与tween-20， PH 7. 4。抽提緩冲液使用量根据需要配置， 一般种子和緩冲液的 重量比约为1: 2-10。
(2) 第一对引物PCR扩增，PCR循环预变性增加到20分钟，94摄氏度 高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模板；PCR反应条件为94。C变性30秒， 58。C退火30秒，72。C延伸40秒，35个循环。
(3) 第二对引物PCR扩增，以第一次扩增产物为模板；PCR反应条件为 预变性94。C1分钟，94。C变性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸40秒，35 个循环。
(4) 1-1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；
(5) 对条带进行分析得出结论。
实施例5:对出口的11批番茄种子进行验证;险测
随机抽取经过ELISA检测的出口番茄种子23批各30克进行检测，PCR 反应条件为94。C变性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸40秒。使用菌液 为模板时，变性时间延长至20分钟。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳及成像 系统分析。结果表明，见图6，所检测的番茄种子均不携带Cmm，和ELISA 检测结果完全符合。
实施例6:对进口的4批番茄种子进行验证4企测
随机抽取经过ELISA检测的进口番茄种子12批各30克进行检测，PCR 反应条件为94。C变性30秒，58。C退火30秒，7rc延伸^秒，35个循环。 使用菌液为模板时，变性时间延长至20分钟。扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶 电泳及成像系统分析。结果表明，见图7,所检测的番茄种子均不携带Cmm, 和ELISA检测结果完全符合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。序列表
SEQUENCE LISTING
<110〉 甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心
<120〉 检测番茄溃疡病菌的巢式NEST-PCR的扩增引物及其检测试剂盒和试剂盒使用方 法
<130> <160> 1
<170〉 Patentln version 3.5 <210〉 1 〈211〉 1297 <212> DNA
<213> 密执安棒形杆菌密执安亚种 <400〉 1
cggttaggcc汪ctggcttcg ggtgUaccg actttcatga cttgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgtattcac cgcagcgttg ctgatctgcg attactagcg actccgactt 120
catgaggtcg agttgcag汪c ctcaatccg汪atctgagaccg gctttttggg attcgctcc汪 180
ccttacggta tcgcagccct Ugtaccggc cattgtagca tgcgtg^gc ccaagacata 240
aggggc"ga tgatttgacg tcatccccac cttcctccga gttgaccccg gcagtctcct 300
atgagttccc accattacgt gctggcaaca Ugaacgagg gttgcgctcg Ugcgggact 360
taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgta taccgacctt 420
gcggggcaca caUtctgca tgUtccggt atatgtcaag ccttggtaag gUcttcgcg 480
Ugcatcgaa tUatccgca tgctccgccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540
UtUgcctt gcggccgtac tccccaggcg gggwctUa tgcgUagct gcgacacgg^ 600
gaccgtggaa tggtccccac atctagttcc caacgtUac ggcatggact accagggtat 660
ctaatcctgt tcgctcccca tgctttcgct cctcagcgtc agttacggcc cagagatctg 720
ccttcgccat cggtgUcct cctgatatct gcgcattcca ccgctacacc aggaattcca 780
atctccccU ccgcactcU gtctgcccgt acccactgca gacccggiggt tgagcctcgg 840
gatttcacag cagacgcgac saaccgccta cgagctcttt acgccc^U attccggaca 900
acgcttgcac cctacgtatt accgcggctg ctggcacgU gttagccggt gcUUtctg 960caggtaccgtcactUcgcttcttccctacta3aagaggtttacaacccgaaggccgtca1020
tccctcacgcggcgttgctgC￡LtC￡LggCtttcgcccattgtgcaatattccccactgctg1080
cctcccgtaggagtctgggcCgtgtCtC3gtcccagtgtggccggtcaccctctcaggcc1140
ggctacccgtcgUggcttggtgagcc"tacctcaccaacaacctgataggccgcgagt1200
ccatccccaaccgaaat tctttccacgaccagacc"gcggccaatcgtcatatccggta1260
Uagctaccat UcUgC3gttatcccagagtcgggg129权利要求
1.一种检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其特征是第一对引物上游长度为28bp，下游长度为26bp的核苷酸序列如下CMM-Agtgatgtcagagcttgctctggcggatc；CMM-agtacggctaccttgttacgacttagt；第二对引物上游长度为23bp，下游长度为31bp的核苷酸序列如下CMM-Bccccgactctgggataactgcta；CMM-bcggttaggccactggcttcgggtgttaccga；经过两次扩增，最终可得到分子量为1297bp的DNA产物。
2. 如权利要求1所述的检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其特征是扩增条件为 第一次第一组引物，其扩增条件为PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌；释放DNA作为扩增模板；PCR反应条件为94。C变性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸4G秒，35个循环； 第二次第二组引物，其扩增条件为9VC变性30秒，S8。C退火^秒，72 。C延伸40秒，35个循环。
3. —种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒，其特征是，包括有 PCR缓沖液9 x-10 x ，氯化镁25—20 mmol/L; dNTP 9—10 mmol/L, Taq酶 2 IU/ ii L;引4勿CMM—A禾口 CMM—a各10—15 pmo1/ p L,引净勿CMM—B详口 CMM—b 各10-15 pmo1/ p L，双蒸水99°/。 ~ 100%,才金测PCR管6个，阳性对照PCR 管3个，阴性对照PCR管3个，阳性对照1管，阴性对照1管。
4. 一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为(1) 植物病原细菌的收集和培养；(2) 第一对引物PCR扩增；(3) 以第一次扩增结果为才莫;tl对第二对引物PCR扩增；(4) 1%-1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；(5) 对条带进行分析得出结论。
5. 如权利要求4所述的番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速^r测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的植物病原细菌的收集和培养的具体步骤是(a) 制备抽提緩沖液:Na2SO30. 13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP ) 2g/ml， 叠氮化纳0. 02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20 (tween-20)各0. 5ml/L， pH为7. 4;(b) 制备待检测材料按照每两克种子加入2ml提取緩沖液的比例， 研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清液，5000rpm(转 /每分钟)(转/每分钟)离心5分钟，用lOOu L重悬沉淀直接作模板进行 PCR扩增。
6. —种番茄溃疡病病菌的巢式Nest-PCR基因組DNA ^是:取方法如下A. 取1. 5ml菌体培养物于灭菌Ep管中，12000rpm离心1分钟，除去上 清液，收集菌体；B. 在A步骤中收集的菌体中加入400ul裂解液，所述的裂解液由40mM 三羟曱基氨基曱烷-醋酸，20mM的醋酸钠，在lmM乙二胺四乙酸(EDTA) ， ly。十二烷基石黄酸钠，pH7. 8的条件下混匀，置于37。C水浴1小 时制得；C. 加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分4中；D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；E. 在上清液里，加两倍体积无水乙醇，上清液1/10体积的醋酸钾 (3M,pH8. 0), -20。C保存l小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟, 弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液 中，置4。C保存备用。
全文摘要
本发明番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp，michiganensis，Cmm)Nest-PCR检测扩增引物及其试剂盒，属于农作物病害防治和植物检疫范畴，一种检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其主要特点是第一对引物上游长度为28bp，下游长度为26bp的核苷酸序列为CMM-Agtgatgtcagagcttgctctggcggatc；CMM-agtacggctaccttgttacgacttagt；第二对引物上游长度为23bp，下游长度为31bp的核苷酸序列为CMM-Bccccgactctgggataactgcta；CMM-bcggttaggccactggcttcgggtgttaccga；经过两次扩增，最终可得到分子量为1297bp的DNA产物。试剂盒主要以两次PCR放大病原菌基因信号，是一种灵敏度极高、检测速度快、结果准确、使用方便的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101560570SQ20091014189
公开日2009年10月21日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者箐 刘 申请人:甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心