专利名称：一种制备苯丙氨酸羟化酶的技术方法
技术领域：
本发明涉及一种制备过L-苯丙氨酸脱氢酶的方法，具体而言，本发明提供了一种 采用基因工程技术克隆L-苯丙氨酸脱氢酶基因，构建其表达质粒，转化细胞获得高产量 L-苯丙氨酸脱氢酶的方法。
背景技术：
苯丙氨酸脱氢酶是Hummel等人于1984年在微生物中首次发现的，经过二十多 年，许多学者已经从一些细菌和放线菌中分离得到苯丙氨酸脱氢酶，且产苯丙氨酸脱氢 酶的微生物多属于好氧的革兰氏阳性菌，如短杆菌(Brevibacterium sp.)、高温放线菌 (Thermoactinomyce)，红线菌(Rhodocaccus sp·)、芽抱杆菌(Bacillus sp.)等。虽然苯丙酮酸是一种理想的底物，但是，PheDH与苯丙酮酸盐类似物限制了其底物 活性。苯丙酮酸的酶促还原胺化反应对于产生光学纯L-高苯丙氨酸非常有用。L-高苯丙氨 酸是一种用于治疗高血压和心力衰竭的血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂的组成成分。苯丙 氨酸脱氢酶也用来开发新生儿筛查苯丙酮尿症筛查试剂，工业上还用来生产光学纯L-苯 丙氨酸，L-苯丙氨酸是一种甜味剂阿斯巴甜的组成成分。然而，由于野生菌株产量低，从而引发研究人员寻求重组DNA技术以便获得足够 数量的PheDH。大肠杆菌天生缺乏PheDH，通常用作生产外源蛋白的寄主，包括PheDH。苯丙 氨酸脱氢酶通常也通过多级柱状层析进行纯化，但是这些纯化方法对于实验目的而言有点 繁琐费时。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备过L-苯丙氨酸脱氢酶的方法。本发明利用基因工程手段制备重组L-苯丙氨酸羧化酶，本发明所制备的L-苯丙 氨酸羧化酶产量高，高活性，生产方法简便。本发明进一步目的是提供本方法制得的重组L-苯丙氨酸羧化酶用于生产新生儿 苯丙酮尿症筛查试剂。本发明提供的利用基因工程技术制备L-苯丙氨酸羧化酶的方法，其包含下述步 骤(1)将可编码的微生物源L-苯丙氨酸羧化酶基因嵌入含合适的表达载体中构建 重组质粒；(2)将该重组质粒转化到适当的宿主细胞中；(3)于适合该细胞表达L-苯丙氨酸羧化酶的条件下培养该转化细胞；(4)纯化所表达的L-苯丙氨酸羧化酶。本发明提供一种编码微生物源L-苯丙氨酸羧化酶的分离基因，这些微生物来源 于芽孢杆菌属和芽孢八叠球菌属。本发明也提供包含上述基因的表达质粒。
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本发明也提供用上述质粒转化的微生物。为了获得高活性和高纯度的苯丙氨酸脱氢酶，本发明用于基因来源的微生物包括 可以产生L-苯丙氨酸的芽孢杆菌属和芽孢八叠球菌属。根据本发明，任何上述可以产生L-苯丙氨酸的芽孢杆菌属和芽孢八叠球菌属的 微生物都可以用于基因来源。本发明以公知的方法从上述可以产生L-苯丙氨酸的芽孢杆菌属和芽孢八叠球菌 属的微生物提取含有L-苯丙氨酸脱氢酶基因的染色体DNA，并将染色体DNA插入载体构建 重组质粒，转化宿主细胞，并令其表达而制得。将提取的球形芽孢杆菌源苯丙氨酸脱氢酶基因以公知的方法插入表达载体中，包 括任何可用于细菌、酵母、昆虫表达系统的表达载体。例如pBR、pUC、pET、pPIC等载体，可 根据需要选用。构建完成的表达载体可转化适当的宿主并进行表达。可用于本发明的宿主细胞包 括大肠杆菌，例如，来源于大肠杆菌K-12的菌株，如JM83、JM102、JM105、JM109、RR1、RB791、 W3110、C600、HB101、DH1 和同类。根据本发明，以公知的基因工程方法生产蛋白质来制备L-苯丙氨酸脱氢酶。例 如，用包含L-苯丙氨酸羧化酶基因的表达质粒转化大肠杆菌，并在合适的培养基中培养， 当细胞浓度达到预期水平时，根据所使用质粒控制区域的特性进行诱导处理，从而生成 L-苯丙氨酸羧化酶。转化的宿主细胞株于适宜该外来质粒大量表达的条件下培养，最后将产物分离纯 化。依常法采用硫酸铵沉淀，疏水层析，离子交换层析。为了获得高活性和高产率的L-苯 丙氨酸羧化酶，本发明采用了核酸位点亲和染料活性蓝4进行纯化。采用本方法制备的L-苯丙氨酸脱氢酶可用于开发新生儿苯丙酮尿症筛查试剂， 也可用来生产L-苯丙氨酸。
图1和2 质粒的构建，所有的质粒都包含L-苯丙氨酸脱氢酶基因。图3 质粒pETDH的构建。
具体实施例方式为使本发明的内容更为明确，以下列非限制实施例进一步详细说明。实施例1制备含有L-苯丙氨酸脱氢酶基因的染色体DNA将球形芽孢杆菌接种下列培养基2g/l L-苯丙氨酸、5g/l K2HP04、10g/l消化蛋 白、lg/lNaCl 和 0. 5g/l MgSO4 · 7Η20，ρΗ7· 0。在 30°C下振荡培养约 10 小时，直到 0D616 = 1. 1。将菌液离心得到IOg湿菌，并以公知的方法提取染色体DNA，也就是说，将细菌悬 浮在40ml 缓冲液TEN(IOmM Tris_HCl，pH 7. 6, ImM EDTA和 IOmM NaCl)中，离心、收集细胞。 然后将收集的细胞悬浮于20ml缓冲液SET (20%蔗糖，50mM Tris_HCl，pH 7. 6和50mMEDTA) 中，加入IOmg溶菌酶，37°C下温育30min。显微镜确认形成菌体后，将IOml缓冲液SET和 0. 25g SDS加入到上述悬浮液中对菌体进行裂解。用酚/氯仿提取裂解物，然后用乙醇沉淀法收集DNA。将DNA溶于IOml缓冲液TEN，加入0. 5g RNase，37°C下温育2小时。加入Img 链霉素酶，再在37°C下温育1小时。 再经酚/氯仿提取后，又用乙醇沉淀法收集DNA，真空干燥。将干燥的DNA溶于缓
冲液TEN中，4°C下保存备用。 实施例2将染色体DNA插入载体中将质粒pUC9作为载体，37°C下用Hind III消化10 μ g pUC9。然后，用小牛胸腺磷 酸酶在37°C下处理2小时，再用乙醇处理1小时。将处理后的溶液进行琼脂糖电泳(1% )，利用电洗脱方法从PUC9中分离出2.7kb DNA片段，并用酚/氯仿提取，然后再用乙醇沉淀出载体DNA，并溶于20 μ 1无菌水中。另一方面，如实施例1所述，用50u Hind III在37°C下酶切得到50 μ g染色体 DNA,并用酚/氯仿提取，然后再用乙醇沉淀16小时，将得到的DNA溶入50 μ 1无菌水中。并 将上述0. 5 μ g载体DNA和2 μ g染色体DNA混合，并在ATP和二硫苏糖醇存在下用T4DNA 连接酶在12. 5°C下处理16小时进行连接形成重组质粒。根据公知的方法用上述重组质粒转化大肠杆菌JM103。实施例3L-苯丙氨酸脱氢酶阳性菌的筛选将上述转化混合物转染到硝酸纤维膜上，待每片硝酸纤维膜达到500-1000个克 隆的重组子时，将硝酸纤维膜贴在含50 μ g/ml氨苄西林的LB平板上，37°C下培养16小时， 然后用新硝酸纤维膜在37°C下培养3小时进行复染。将硝酸纤维膜浸入裂解液(5mg/ml裂解酶、IOmM Tris-HCl, pH 8. 5，1. 5mM NAD+、 0.8mMINT和0. 32mM吩嗪二甲酯硫酸盐)中，然后，选择深红色的转化子。一个L-苯丙氨酸 脱氢酶阳性菌落大约提供2000个氨苄西林抗性转化子。从L-苯丙氨酸脱氢酶阳性菌落提 取质粒，来自于PUC9的重组质粒将作为载体，被称为pBPDHl。实施例4质粒pBPDHl的亚克隆得到质粒pBPDHlDBL本实施例中，将10 μ g质粒pBPDHl用Hind III酶切消化，然后将消化产物进行 琼脂糖凝胶电泳(0.7%)，利用电洗脱方法分离出8kb DNA片段。再将2yg pUC9依次用 Hind III酶切消化，用小牛胸腺磷酸酶处理，再用酚/氯仿提取。然后，将两种反应混合物 混合，用 Elutip-Dcolumn (Schleicher&Schuell 公司)纯化，并用乙醇沉淀 DNA。然后，将沉淀溶于T4 连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl, pH 7. 4, IOmM MgC12、10mM DTT和ImM ATP)中，并用T4连接酶连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌JM103感受态细胞，涂在含50 μ g/ml氨苄西林，0. 3mM IPTG和0. 03% IPTG的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑选白色菌落。从这些菌落中提取质粒， 并挑选已将6kb Hind III片段插入到pUC9的Hind III位点上的重组质粒。这些重组质 粒为 pBPDHl-A。按照上述方法亚克隆，依次由pBPDHl-A得到pBPDHl_BS，由pBPDHl_BS得到 pBPDHl-Dr,由pBPDHl-Dr得到质粒pBPDHlDBL和pBPDHlDBR，这两个质粒仅插入DNA片段的 方向不同。然后以公知的方法鉴定出pBPDHlDBL。实施例5表达质粒pETDH的构建本实施例中，将10 μ g质粒pBPDHlDBL (可以从日本富山县立大学生物技术研 究中心直接购买)用Bam HI酶切消化，然后将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳(0.7%)，利用电洗脱方法分离出1.5kb DNA片段。再将2ygpET16b依次用Bam HI酶切消化，用 小牛胸腺磷酸酶处理，再用酚/氯仿提取。然后，将两种反应混合物混合，用Elutip-D column (Schleicher&Schuell 公司)纯化，并用乙醇沉淀 DNA。然后，将沉淀溶于T4 连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl, pH 7. 4, IOmM MgC12、10mM DTT和ImM ATP)中，并用T4连接酶连接过夜。将反应混合物转化大肠杆菌JM109 (ATCC53323)感受态细胞，涂在含50 μ g/ml氨 苄西林，0. 3mM IPTG和0.03% IPTG的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑选白色菌落。从这些 菌落中提取质粒，并挑选已将1. 5kb Bam HI片段插入到pET16b的Bam HI位点上的重组质 粒。这些重组质粒为pETDH。然后用染色终止子测序试剂盒进行测序，一旦去确定序列完 整，即可选择pETDH用来表达L-苯丙氨酸羧化酶。实施例6pETDH表达质粒转化和阳性菌株筛选将上述重组质粒转染到硝酸纤维膜上，待每片硝酸纤维膜达到200-300个克隆的 重组子时，将硝酸纤维膜浸泡在Iml 10mg/ml裂解液(含IOMm EDTA, Ph6. 0)中，30°C下培 养30min，然后采用煮-冻-煮的方式裂解细胞。然后，将非变性PAGE的硝酸纤维膜浸泡在 0. IM Tris-HCl 缓冲液(pH 8. 5，含 IOMm L-Phe,0. 4mMNAD+、0. 6mM INT 和 0. 3mM 吩嗪二甲 酯硫酸盐)。数分钟后，发现非变性PAGE硝酸纤维膜上有明显的特异性条带。很显然，筛选 出阳性菌株，在标准分析条件下可以检测到无细胞抽提物中L-苯丙氨酸羧化酶活性。实施例7高表达活力的阳性重组菌的筛选和L-苯丙氨酸脱氢酶的过量表达将上述阳性重组菌与原始菌在液体LB培养基(含0. lmg/ml氨苄西林)中37°C下 培养8小时后，将IOml培养液稀释100倍后得到IL培养液，装入长颈振荡培养瓶中，37°C 下振荡温育，直到0D600 = 1.0。然后，将培养液转移到冰水浴中，不断旋转培养瓶。4分钟 后待培养液冷却到大约23°C时，加入0. 005mM无菌IPTG诱导T7启动子，并在23°C下摇菌 培养8小时。将发酵液在3，500 Xg下离心15min，弃上清，并将细胞在液态氮中迅速冷冻， 储存在_20°C的液氮中备用。实施例8用活性蓝4分离纯化表达产物将约8g湿菌体悬浮于20ml含有lmg/ml溶菌酶的缓冲液A(50mM Tris-HCl pH 8. 3,0. ImM EDTA, 5mM 2-硫基乙醇)中，然后室温放置20分钟，并用超声波振荡降解50分钟。将悬浮液12，OOOXg 4°C下冷冻离心1小时，收获上清，并在50°C温育10分钟。 用冰冷却，按照前述方法进行再次离心，收获上清。加入0.3M的(NH4)2SO4，搅拌，置4°C 放置2小时，待沉淀完全后，12，000Xg 4°C下冷冻离心1小时，收获上清。加入更多的 (NH4)2SO4得到0. 6M的饱和溶液，4°C下缓慢搅动并放置1小时，然后再次离心(12，OOOXg, 1小时，4°C )。将得到的沉淀在4°C下溶解在2ml的缓冲液B (含25mM Tris-HCl, pH 8. 3， 2. 5mM 2-巯基乙醇，0.05mM EDTA)中，然后将得到的溶液用缓冲液B进行透析，除去多余的 (NH4)2SO40将30ml预先用缓冲液B平衡的活性蓝4琼脂糖浆加入到透析液中，置4°C放置30 分钟(定期轻微晃动，以让酶吸附到细珠上)，用缓冲液B透析三次，并在5000Xg 4°C下离 心20分钟，再用20ml的缓冲液C (包含IM KCl的缓冲液B)洗脱，并用(NH4) 2S04 (0. 6M饱和 溶液)沉淀，12，OOOXg 4°C下冷冻离心1小时，收获上清，回收PheDH，并用缓冲液B溶解。
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然后将蛋白质溶液进行透析，并上柱于同样用缓冲液B平衡的活性蓝4琼脂糖柱 (20 X lcm, 15ml柱床体积)，以缓冲液B洗脱三次(流速15ml/h)，并用15ml缓冲液C将酶 洗脱(流速5ml/h)出来。通过NAD+与L-苯丙氨酸的还原反应来确定含有高酶活性的片 段，并结合SDS-PAGE进行分析。实施例9测定L-苯丙氨酸脱氢酶的酶活性本发明通过NAD+的还原反应来检测表达的L-苯丙氨酸脱氢酶的酶活性。反应 条件为温度在25°C下，以L-苯丙氨酸作为底物，1.0ml的反应混合物包含IOOmM甘氨 酸-KCl-KOH缓冲液(pH 10. 5)，2. 5mM NAD+和IOmML-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸脱氢酶样 品。为了得到PheDHW Km值和Vmax值，本发明使用了不同浓度的L-苯丙氨酸和NAD+。还 原氨化反应条件为在25°C下，1. Oml反应混合液含有IOOmM甘氨酸-KCl-KOH缓冲液(pH 9. 0)，0. ImMNADH, 200mM NH4C1, IOmM苯丙酮酸钠和L-苯丙氨酸脱氢酶溶液。所有反应都在 340nm波长下读取吸光度。定义催化1 μ mol NADH/min所虚酶量为氧化脱氮反应的一个酶 活性单位。利用分光光度法(波长为280nm，吸收系数/lcm = 6. 3)确定蛋白质浓度。同时，本发明得到的L-苯丙氨酸脱氢酶可以通过上述原理用于新生儿苯丙酮尿 症筛查。
权利要求
重组微生物源L 苯丙氨酸脱氢酶的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1)将可编码的微生物源L 苯丙氨酸羧化酶基因嵌入含合适的表达载体中构建重组质粒；(2)将该重组质粒转化到适当的宿主细胞中；(3)于适合该细胞表达L 苯丙氨酸羧化酶的条件下培养该转化细胞；(4)纯化所表达的L 苯丙氨酸羧化酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的L-苯丙氨酸羧化酶的来源是微生 物，优选的是芽孢杆菌属和芽孢八叠球菌属，更优选的是球形芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的宿主细胞是大肠杆菌，优选的是来源于大 肠杆菌 K-12 的菌株，特别优选的是 JM83、JM102、JM105、JM109、RRl、RB791、W3110、C600、 HBlOU DHl 禾口同类。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)的纯化是以硫酸铵沉淀、疏水层析和 离子交换层析，将所表达的L-苯丙氨酸羧化酶予以纯化。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的疏水层析和离子交换层析中优选的亲和剂 是核酸位点亲和染料，更优选的是活性蓝4。
6.一种表达微生物源L-苯丙氨酸脱氢酶的重组质粒，其特征是所述重组质粒是采用 基因工程将微生物源L-苯丙氨酸脱氢酶基因嵌入表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组质粒，其基因来源为是微生物，优选的是芽孢杆菌属和 芽孢八叠球菌属，更优选的是球形芽孢杆菌。
8.根据权利要求6所述的重组质粒，其表达载体选自细菌、酵母或者昆虫表达载体。
9.根据权利要求1所述的方法制得的微生物源L-苯丙氨酸羧化酶可用于开发新生儿 苯丙酮尿症筛查试剂，也可用来生产L-苯丙氨酸。
全文摘要
本发明属生物工程技术领域，涉及制备重组L-苯丙氨酸羧化酶的方法。具体而言，本发明将可编码的微生物源L-苯丙氨酸羧化酶基因嵌入含合适的表达载体中构建重组质粒，转化细胞，并使用一种简单有效的亲和方法获得高产量L-苯丙氨酸羧化酶的方法。本发明所制得的L-苯丙氨酸羧化酶产量高，高活性，生产方法简便。本发明亦包括此方法中构建的新的重组质粒及转化细胞。本发明制备的L-苯丙氨酸脱氢酶可用于开发新生儿苯丙酮尿症筛查试剂，也可用来生产L-苯丙氨酸。
文档编号C12R1/07GK101899464SQ200910143498
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者王晓华 申请人:北京协和洛克生物技术研究开发中心