专利名称：：利用二价金属离子制备Apo-2配体的方法
技术领域：
：本发明主要涉及使用如锌和钴等二价金属离子制备Apo-2配体和Apo-2配体的制剂的方法。也提供了这类Apo-2配体和具有改进了Apo-2L的三聚体形成和稳定性的Apo-2配体制剂的应用。本发明还涉及Apo-2配体变体，特别是丙氨酸取代型变体。
背景技术：
：对哺乳动物中细胞数量的控制被认为部分取决于细胞增殖和死亡之间的平衡。细胞死亡的形式之一，有时称坏死性细胞死亡，其典型特征为创伤或细胞损伤所致病理形式的细胞死亡。相对比，有另外一种"生理性，，的细胞死亡形式，其通常以一种有序或受控形式进展。这种有序的或受控的细胞死亡形式通常指"凋亡，，(参见，例如Barr等，Bio/Technology，12:487-493(1994);Steller等，4学，267:1445-1449(1995))。凋亡天然发生i许多生理过程中，包括胚胎发育和免疫系统中的克隆选择(Itoh等，细胞(Cell),66:233-243(1991》。多种分子，如肿瘤坏死因子-a("TNF-a，，)，肿瘤坏死因子-卩("TNF-P"或"淋巴毒素-a，，)，淋巴毒素-P("LT-P")，CD30配体，CD27配体，CD40配体，OX-40配体，4-1BB配体，Apo-l配体(也称为Fas配体或CD95配体)，Apo-2配体(也称TRAIL,AIM-1或AGP-1)，和Apo-3配体(也称为TWEAK)都被证实为细胞因子的肿瘤坏死因子家族的成员(参见例如Gruss和Dower，血液(Blood),85:3378-3404(1995);Pitti等，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.),271:12687-12690(1996);Wiley等，Immunity,3:673-682(1995);Browning等，细胞，72:847-856(1993);Armitage等,自然(Nature),357:80-82(1992)，1997年1月16日公开的WO97/01633;1997年7月17日公开的WO97/25428;1997年12月11日公开的WO97/46686;1997年9月18日公开的WO97/33899;Marster等，Curr.Biol.，8:525-528(1998);Chicheportiche等，Biol.Chem.,272:32401-32410(1997))。在这些分子中，已有报导在凋亡+涉及TNF-ot,TNF-(3，CD30配体，4-1BB配体，Apo-l配体，Apo-2配体(TRAL)和Apo-2配体(TWEAK)。相信这些TNF家族细胞因子介导的对多种细胞应答的诱导是以它们与特异性细胞受体的结合而引发的。已证实约5S-kDa(TNFRl)和7S-kDa(TNFR2)的两种不同的TNF受体(Hohman等，生物学化学杂志，264:14927-14934(1989));Brockhaus等，美国国家科学院院报(Proc.Natl,Acad.Sci.),87:3127-3131(1990);1991車3月20日公开的EP417563),已分离并鉴定了对应这两类受体的人和小鼠cDNA(Loetscher等，细胞，61:351(1990);Schall等，细胞，61:361(1990);Smith等，科学，248:1019-1023(1990);Lewis等，美国国家科学院院报，88:2830-2834(1991);Goodwin等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，11:3020-3026(1991))。这两种TNF受体基因具有广泛的多态性(参见，例如，Takao等，Immunogenetics，37:199-203(1993))。这两种TNFR具有同样的细胞表面受体的典型结构，包括胞外区，跨膜区，胞内区。已发现天然状态下这两种受体的胞外部分也可以为可溶性TNF结合蛋白(Nophar,Y等，EMBOJ,，9:3269(1990);和Kohno，T等，美国国家科学院院报，87:8331(1990))。Hale等报导了对重组可溶性TNF受，的克，(J.Cell.Biochem.增刊15F，1991,p.ll3(P424)—)。以NH2末端开始的半胱氨酸富含区域(CRD)的重复氨基酸序列形式。每一CRD约40个氨基酸长，在高度保守位置包含4到6个半胱氨酸残基(Schall等，出处同上；Loetscher等，出处同上；Smith等，出处同上；Nophar等，出处同上；Kohno等，出处同上)。在TNFR1中，4个CRD的大致边界如下CRDl-氨基酸14到约53;CRD2-约氨基酸54到约97;CRD3-约氨基酸98到约138;CRD4-约氨基酸139到约167。在TNFR2,CRD1包括氨基酸17到约54;CRD2-约氨基酸55到约97;CRD3-约氨基酸98到约140;CRD4-约氨基酸141到约179(Banner等，细胞，73:431-435(1993))。Banner等，出处同上，还记述了在配体结合中CRD的潜在作用。CRD相似的重复形式存在于几种其它的细胞表面蛋白中，包括p75神经生长因子受体(NGFR)(Johnson等,细胞,47:545(1986);Radeke等，自然,325:593(1987》，B细胞抗原CD40(Stamenkovic等,E廳OJ.，8:1403(1989》，T细胞抗原OX40(Mallet等，EMBOJ.,9:1063(1990))和Fas抗原(Yonerhara等，J.Exp.Med.，169:1747-1756(1989)和Itoh等，细胞，66:233-243(1991))CRD还可见于兔痘病毒及粘液瘤病"4的可溶性TNFR(sTNFR)样T2蛋白中(Upton等，Virology,160:20-29(1987);Smith等，Biochem.Biophys,Res.Commun"176:335(1991));Upton等,Virology,184:370(1991))。这些序列的最佳排列指示半胱氨酸残基的位置是高度保守的。有时这些受体统称TNF/NGF受体超家族成员。最近对于p75NGFR的研究i明CRD1的缺失(Welcher，A.A.等，美国国家科学院院报，88:159-163(1991))或此区域的5-氨基酸插入(Yan,H和Chao，M.V.,生物学化学杂志，266:12099-12104(1991))对NGF的结合有很少或没有影响(Yan,H.和Chao,M.V.,出处同上)。p75NGFR在它的CRD4和跨膜区之间包括一段约60个氨基酸的富含脯氨酸的序列，其并不参与NGF结合(Peetre，C等，Eur.J.Hematol.，41:414-419(1988);Seckinger，P等，生物学化学杂志，264:11966-11973(1989);Yan,H和Chao，M.V.，出处同上)。在TNFR2中发现了类似的富脯氨酸区，但在TNFRl中没有。除淋巴毒素-ot外，迄今鉴定的TNF家族配体是II型跨膜蛋白，其C-末端位于胞外。相反，在TNF受体(TNFR)家族中迄今鉴定的大多数受体是I型跨膜蛋白。然而在TNF配体和受体家族中，家族成员间的同源性主要在胞外区域("ECD")。TNF家族的几种细胞因子，包括TNF-a，Apo-l配体和CD40配体在细胞表面被蛋白水解；每一种情况下得到的蛋白通常形成同型三聚体分子，其起可溶性细胞因子的作用。TNF受体家族的蛋白也通常被蛋白水解而释放出可溶性受体ECD，其可作为同源细胞因子的抑制因子。最近，已鉴定了TNFR家族的其它成员。这些新鉴定的TNFR家族成员包括CAR1，HVEM和osteoprotegerin(OPG)(Brojatsch等，细胞，87:845-855(1996);Montgomery等，细胞，87:427-436(1996);Marsters等，生物学化学杂志，272:14029-14032(1997);Simonet等,细胞，89:309-319(1997;)。与其它已知TNFR-样分子不同，Simonet等，出处同上报导OPG不包含横跨疏水性5争膜区的序列。OPG被认为起诱何受体的作用，如下所论。TNF/NGF受体家族的另一新成员在小鼠中得到鉴定，此称为GITR的受体是'糖(肾上腺)皮质激素-诱导的胂瘤坏死因子受体家族相关基因，(Nocentini等，美国国家科学院院报，94:6216-6221(1997))。小鼠GITR受体是228个氨基酸的I型跨膜蛋白，其在正常小鼠胸腺，脾和淋巴结的T淋巴细胞中表达。小鼠GITR受体的表达通过用抗-CD3抗体，伴刀豆球蛋白A或佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯活化T淋巴细胞而诱导。在Marster等，Curr.Biol.,6:750(1996)中，研究人员描述了一种叫做Apo-3的全长天然序列人多肽，在其胞外富半胱氨酸重复处显示出与TNRF家族的相似性，象TNFR1和CD95—样，它包含一个细胞质死亡区序列(同样参见Masters等，Curr.Biol.,6:1669(1996))。其他研究人员称Apo-3为DR3，wsl國l，TRAMP，和LARD(Chinnaiyan等，科学，274:990(1996);Kitson等,自然，384:372(1996);Bodmer等，Immunity,6:79(1997);Screaton等，美国国家科学院院报，94:4615-4619(1997))。Pan等公开了称为"DR4"的另一TNF受体家族成员(Pan等，科学，276:111-113(1997))。据报导DR4包含一个能引发(engage)细胞自杀装置的细胞质死亡区域。Pan等指出DR4被认为是Apo-2配体或TRAIL配体的受体。在Sheridan等，科学，277:818-821(1997)和Pan等，科学，277:815-818(1997)中，记述了另一被认为是Apo-2配体(TRAIL)的受体的分子。这一分子被称为DR5(也可称为Apo-2;TRAIL-R2或TRICK2或KILLER(Screaton等，Curr.Biol.,7:693-696(1997);Walczak等，EMBOJ.,16:5386-5387(1997);Wu等，NatureGenetics,17:141-143(1997))。象DR4一样，有报导DR5包含一个细胞质死亡区域并且能够传递凋亡的信息。最近鉴定了另一含死亡区的受体DR6(Pan等，FEBSLetters,431:351-356(1998))。除含有4个假定的胞外区域和一个细胞质死亡区域外，DR6被认为包含一假定的亮氨酸-拉链序列，该j列与细胞质区的富含脯氨酸的基序相重叠。富含脯氨酸的基序与结合到src-同族(homology)-3区域的序列相似，其^皮发现存在于许多胞内信号转导分子中。…新近鉴定的另一组TNFR家族成员是指"诱饵受体"，据认为其起抑制因子的作用，而不是信号转导因子。该组包括DCR1(也称TRID，LIT或TRAIL-R3)(Pan等，科学，276:li1-113(1997));Sheridan等，科学，277:818-821(1997);McFarlane等，生物学化学杂志，272:25417-25420(1997);Schnerider等，FEBSLetters,416:329-334(1997);Degli-Esposti等,J.Exp.Med.，186:1165-1170(1997);和Mongkosapaya等，J.Immunol.,160:3-6(1998))和DCR2(也称为TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsters等，Curr.Biol.,7:1003-1006(1997);Pan等，FEBSLetters,424:41-45(1998);Degli-Esposti等，Immunity,7:813-820(1997)),这两者都是表面分子，还者OPG(Simonet等，出处同上)和DCR3(Pitti等，自然，396:699-703(1998))，这两者都是可溶性分泌蛋白。有关TNF家族细胞因子和它们的受体的综述，参见Ashkenazi等，科学，281:1305-1308(1998);Golstein，Curr.Biol.,7:750-753(1997);和Gruss和Dower，出处同上。锌结合位点在涉及不同界面的特定蛋白的蛋白-蛋白相互作用中显示^构上的作用(Feese等，美国国家科学院院报，91:3544-3548(1994);SomerS等，自然，372:478-481(1994);Raman等，细胞，95:939-950(1998))，但具看前述结构性特征的TNF家族成员(CD40配体，TNF-a，或TNF-(3)没者一种可结合金属。已在文献中记述了在配制各种激素，如人生长激素(hGH)时金属离子如锌的使用(参见，例如WO92/17200,1992年10月15日公开)。在WO92/03478(1992年3月15日公开)中同样记述了锌与hGH对受体的结合有关。Walter等，Structure,4:1453-1463(1996)和Karpusas等,美国国家科学院院报，94:11813-11818(1997)中分别报导了在干扰素-a二聚体和干扰素—P二聚体中锌结合的作用。本领域^综述了各种金属离子如锌的结构和生物学作用，参见如Christianson等,AdvancesinProteinChemistry,42:281-355(1991)。发明简述本发明基于以下发现在制备Apo-2配体，或含Apo-2配体的制剂的方法和过程中包含入一或多种二价金属离子会导致产量和Apo-2配体三聚体稳定性提高。现在认为这样包含一或多种二价金属离子也会通过重组细胞培养中的表达而改进Apo-2配体的折叠或Apo-2L三聚体的装配。在氧化环境下，Apo-2L单体上的自由半胱氨酸可以形成分子间二硫键，产生游离的Apo-2L二聚体以及Apo-2L三聚体形式中的二碌u4建连接型Apo-2L二聚体。Apo-2L二聚体的这种形成可能导致Apo-2L的聚结，沉淀，和/或Apo-2L失活。在此所述方法和制剂中二价金属离子的存在可以防止此类二硫键的形成。有显示表明在Apo-2L三聚体的合成和装配过程中二价金属离子的加入可以进一步改进正确折叠的，同型三聚体式Apo-2L的积累和回收。申请人发现与有二硫键连接的Apo-2L二聚体相比，Apo-2配体三聚体的活性高约10倍(在哺乳动物癌细胞+的细胞毒活性方面)。本发明说明书主要涉及Apo-2配体，也考虑了二价金属离子在制备或稳定各种其他蛋白的三聚体方面的应用。这些其它蛋白特别包括那些需要形成三聚体以获得生物活性的蛋白，例如，TNF家族的各成员。在一个实施方案中，本发明提供使用一或多种二价离子制备Apo-2配体的方法。所述方法包括的步骤为提供含有编码Apo-2配体之核酸的可复制型载体的宿主细胞，提供含有一或多种二价金属离子的培养基，在足以表达Apo-2配体的条件下在培募基中培抓宿主细胞，从宿主细胞或细胞培养液中回收Apo-2配体。可选地，在回收或纯化过程中使用一或多种二价金属离子。在另一实施方案中，本发明提供了包含Apo-2配体和一或多种二价金属离子的制剂。该组合物可以是药物学上可接受的可用于如诱导或激发哺乳动物癌细胞凋亡的有效制剂。本发明的一个进一步的实施方案提供制品和试剂盒，其中包含这类^r有一或多种二价金属离子的Apo-2配体制剂。所述制品和试剂盒包括一个容器，容器上的标记，容器中的制剂。容器上的标记指示该制剂可用于特定的治疗或非治疗用途。该制剂包含Apo-2配体和一或多种二价金属离子。在另一实施方案中，本发明提供了按照本发明所述方法制备的Apo-2配体多肽。这类Apo-2配体多肽可能包括图l(SEQIDNO:l)的氨基酸114-281，图l(SEQIDNO:l)的氨基酸1-281,以及其具有生物活性的片段或变体。在又一实施方案中，本发明提供了Apo-2配体变体。特别是，本发明提供了在Apo-2配体的天然序列(图1;SEQIDNO:l)中包含一或多个氨基酸取代的Apo-2配体变体。在下表1中提供了包含丙氨酸取代的Apo-2配体变体。本发明还提供了编码这类Apo-2L配体变体的核酸分子和包含编码Apo-2L变体的核酸分子的载体和宿主细胞。本发明更具体涉及1.一种含有Apo-2配体和一或多种二^f介金属离子的制剂，其中所述一或多种二价金属离子在制剂中的浓度与该Apo-2配体的摩尔比<2。2.项1的制剂，其中所述一或多种二^f介金属离子包括锌或钴。3.项2的制剂，其中所述一或多种二i^金属离子包括锌。4.项3的制剂，其中所述锌选自氯化锌，醋酸锌，硫酸锌，碳酸锌和柠檬酸锌<5.项1的制剂，其中所述制剂是可药用的制剂。6.项1的制剂，其中所述Apo-2配体包括图l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸。7.项1的制剂，其中所述Apo-2配体包括图l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片段或变体。8.项1的制剂，其中所述制剂的pH约为6-9。9.项8的制剂，其中所述制剂的pH约为7-7.5。10.项1的制剂，其中所述制剂是含水制剂。11.项l的制剂，其中所述制剂是冻干制剂。12.含有Apo-2配体和一或多种二价金属离子的制剂，其中所述一或多种二价金属离子在制剂中的浓度与该Apo-2配体的摩尔比22。13.促进Apo-2配体三聚体形成的方法，包括使Apo-2配体多肽暴露于有效量的一或多种二价金属离子。14.制备Apo-2配体的可药用制剂的方法，包括将Apo-2配体、有效量的一或多种二价金属离子、以及可药用的载体混合。15.减少二硫键连接的Apo-2配体二聚体形成的方法，包括使Apo-2配体多肽暴露于有效量的一或多种二价金属离子。16.制备Apo-2配体的方法，包括如下步骤(a)提供含有可复制的载体的宿主细胞，所述载体含有编码Apo-2配体多肽的核苷酸序列；(b)提供含有有效量的一或多种二价金属离子的培养基；(c)将所述宿主细胞在足以表达Apo-2配体的条件下于培养基中培养；(d)从宿主细胞或培养基中回收Apo-2配体。17.项16的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。18.项16的方法，其中所述一或多种二价金属离子包括锌。19.项18的方法，其中所述的锌包括硫酸锌。20.项16的方法，其中所述一或多种二价金属离子包括钴。21.项20的方法，其中所述的钴包括氯化钴。22.项18的方法，其中培养基中所迷锌的浓度约为50-25(Himol。23.项16的方法，其中所述可复制的载体包含编码一或多个tRNA分子的核苷酸序列。24.项23的方法，其中所述可复制的载体是pAPApo2-P2RU载体。25.项16的方法，其中所述Apo-2配体包含图l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸。26.项16的方法，其中所述Apo-2配体包含图l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片段或变体。27.制备Apo-2配体的方法，包括如下步骤提供包含含有编码Apo-2配体之核香酸序列的可复制型载体的宿主细胞；(b)提供培养基；(c)在足以表达Apo-2配体的条件下在所述培养基中培养宿主细胞；(d)从宿主细胞或培养基中回收Apo-2配体；(e)在有效量的一或多种二价金属离子存在下纯化Apo-2酉己体。28.项27的方法，其中在步骤(e)中，所述Apo-2配体在一或多种二价金属离子和一种还原剂存在下纯化。29.项27的方法，其中所述Apo-2配体包含图l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸。30.项27的方法，其中所述Apo-2配体包含图l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片^:或变体。31.从原核细胞培养中回收Apo-2配体的方法，包括如下步骤.'(a)分离已表达在培养的原核宿主细胞中的Apo-2配体；(b)将所述分离的Apo-2配体与含有一或多种二价金属离子和还原剂的緩冲液接触；(c)回收所述分离的Apo-2配体。32.项31的方法，其中在步骤(b)中，所述一或多种二^f介金属离子选自锌和钴，所述还原剂选自DTT和BME。33.项31的方法，其中在步骤(c)中，所述Apo-2配体的回收是通过将Apo-2配体依次与阳离子层析载体，羟基磷灰石载体，疏水层析载体接触而实现的。34.项33的方法，其中所述阳离子层析载体选自SP-Sepharose，CM-Sepharose，和Macro-Prep陶瓷HS树脂。35.项33的方法，其中所述疏水层析栽体选自苯基琼脂糖，丁基琼脂糖，TSK树脂和Toyopearl树脂。36.分离的Apo-2配体变体多肽，其包含与天然序列Apo-2配体不同且在图l(SEQIDNO:l)的残基位置具有如下一或多个M酸取代的氨基酸序列R130A;N134A;L136A;S138A;N140A;N143A;S153A;E155A;R158A;R170A;K179A;R191A;Q193A;E195A;K197D;K201A;N202A;D203A;Y213A;D218A;Y240A;K251A;S259A;D267A;D269A。37.分离的Apo-2配体变体多肽，其包含与天然序列Apo-2配体不离且在图l(SEQIDNO:l)的残基位置具有如下一或多个M酸取代的氨基酸序列S141A，K142A，S159A,H264A。.38.分离的Apo-2配体变体多肽，其包含与天然序列Apo-2配体不同且在图l(SEQIDNO:l)的残基位置具有如下一或多个氨基酸取代的氨基酸序列R149A;C230S;C230A;Q205A;V207A;Y216A;E236A;Y237A。39.分离的核酸，其包含编码项36所述Apo-2配体变体的核苷^列。40.包含项39的核酸的载体。41.包含项40的载体的宿主细胞。42.pAPApo2-P2RU载体。43.包含项42的载体的宿主细胞。44.项31的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。.分离的Apo-2配体，其包含图l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸并且依照项16而制备。46.分离的Apo-2配体，其包含图l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片段或变体并且依照项16而制备。47.分离的Apo-2配体，其包含图l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸并且依照项27而制备。48.分离的Apo-2配体，其包含图l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片段或变体，并且其依照项27而制备。图1表示人Apo-2配体cDNA(SEQIDNO:2)及由其衍生的氨基,列(SEQIDNO:1)。核苷酸位置447(SEQIDNO:2中)的"N"用于指示该核苷酸碱基可能是"T"或"G"。图2提供了Apo-2L的晶体结构。图2A显示了沿三重轴向的三聚体视图。每一单体都是相同的。有序的蛋白结构始于残基120，残基131-141是无序的，残基195-201也是如此(以虚线标记)。包含三个对称相关的半胱氨酸的锌结合位点和溶剂配体表示为实心图像。图2B提供了锌结合位点内斜视立体近视图；Sy-锌-Sy间的角度是112。，Sy-锌-溶剂间的角度是107°，锌-硫键距离为2.3埃，锌-溶剂键距离为2.3埃。图2(和5)用Molscript(Kraulis等，J.Appl.Cryst.，24:946-950(1991))和Raster3D(Merrit等，ActaCryst.,D50:869-873(1994))程序绘制。图2C提供了得自实施例2所述实验的结晶学的数据总结。图3显示所选TNF家族成员的序列排列，包括Apo2L(SEQIDNO:1);TNF-p(SEQIDNO:3);TNF-a(SEQIDNO:4);CD40L(SEQIDNO:5);FasL(SEQIDNO:6);RANKL(SEQIDNO:7)。这些序列上的箭头指示Apo2L中的P-链(strand)。排列的序列上的编号对应图1提供的Apo-2L序列编号(SEQIDNO:1)。图4提供的生物分析数据显示锌结合位点的功能重要性。在用各种浓度的Apo-2L(114-228位)或经螯合剂处理除去锌的Apo-2L(l14-228位)孵育过夜后，用代谢活性的荧光分析确定SK-MKS-1细胞生存力。图5显示了在Apo-2L的空间填充才莫型上对突变分析的作图。三聚体方向同图2。将突变为丙氨酸时生物活性P争低5倍以上的残基作标记并避光保存。在中度阴影区显示了其它已突变的残基，这些残基中的几个也进行了标记。图6显示了在经处理除去结合锌之前和之后Apo-2L的圆二色语(114-281位)。图7显示了在经处理除去锌之前和之后Apo-2L的热变性，其通过在225nm进行圆二色谱来监控。报导了2微摩尔Apo-2L溶液的倍增电极电压。图8显示了在使用AP启动子的大肠杆菌表达系统中添加ZnS04对可溶性Apo-2L产物积累(mg/L)的影响(时间进程)。图9显示了有或没有ZnS04时大肠杆菌表达系统(参见实施例8)所得细胞裂解液的MPHS层析的洗脱图谱。图10显示了在使用trp启动子的大肠杆菌表达系统中添加ZnSC^对可溶性Apo-2L产物积累(mg/L)的影响(时间进程)。图11显示了在使用AP启动子的大肠杆菌表达系统中添加CoC^对可溶性Apo-2L产物积累(mg/L)的影响(时间进程)。图12显示了pAPApo2-P2RU质粒的构建。图13显示了pAPOK5质粒的构建。优选实施方案详述定义在此所用术语"Apo-2配体"，"Apo-2L",和"TRAIL"是指这类多肽序列，其包含图1所示氨基酸序列(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸残基，还包括95-281位残基,92-281位残基,91-281位残基,41-281位残基,15-281位残基，1-281位残基，同样还包括上述序列的生物活性片段，以及缺失的，插入的，或取代的变体。在一个实施方案中，该多肽序列包含图l(SEQIDNO:l)的114-281残基。可选地，该多肽序列包含图l(SEQIDNO:1)的92-281位残基或91-281位残基。Apo-2L多肽可由图l(SEQIDNO:2)表示的天然核苦酸序列编码。可选地，编码Proll9残基(图1;SEQIDNO:2)的密码子可以是"CCT，，或"CCG"。在另一优选实施方案中，所述片段或变体具有生物学活性且与上述的任一序列有至少80%的氨基酸序列同一性，更优选至少90%的序列同一性，更进一步优选有至少95%,96%，97%，98%,99%的序列同一性。所述定义包含Apo-2配体的取代型变体，其中其天然氨基酸中的至少一个被丙氨酸残基取代。优选的取代型变体包括下表1中证实的一或多个残基取代。所述定义同样包括自Apo-2配体源分离的或通过重组或合成方法制备的天然序列的Apo-2配体。本发明的Apo-2配体包括在1997年1月16日Z/Hf的WO97/01633和1997年7月17日^>开的W097/25428中称为Apo-2配体或TRAIL的多肽。通常使用术语"Apo-2配体，，或"Apo-2L，，指Apo-2配体的形式，其包括所述多肽的单体，二聚体或三聚体形式。在Apo-2L序列中所用的氨基酸残基的编号，除特别声明，均依照图1中编号(SEQIDNO:1)。例如，"D203"或"Asp203"指图1(SEQIDNO:l)的序列中203位的天冬氨酸残基。术语"Apo-2配体胞外区域"或"Apo-2配体ECD"指Apo-2配体的基本上没有跨膜区和细胞质区的形式。通常，ECD含有不到1%的这类跨膜区和细胞质区，优选的，含有不到0.5%的这类.区域。术语"Apo-2配体单体，，或"Apo-2L单体，，指Apo-2L胞外区序列的共价链。术语"Apo-2配体二聚体"或"Apo-2L二聚体"指通过二硫键共价连接的两个Apo-2L单体。本发明所用此术语包括游离的二聚体以及Apo-2L三聚体形式中的Apo-2L二聚体(即与另一Apo-2单体结合)。术语"Apo-2配体三聚体"或"Apo-2L三聚体"指通过非共价键连接在一起的三个Apo-2L单体。"TNF家族成员"广义上指与肿瘤坏死因子(TNF)在结构或功能上有一些相似之处的各种多肽。本领域已知并记述了与TNF家族多肽相关的某些结构和功能特征，例如，在上述的发明背景部分。这类多肽包括，但不仅限于本领域称为TNF-a,TNF-p，CD40配体，CD30配体，CD27配体，OX-40配体，4-1BB配体，Apo-l配体(也称为Fas配体或CD95配体)，Apo-2配体(也称为TRAIL)，Apo-3配体(也称为TWEAK),APRIL,OPG配体(也称RANK配体，ODF，或TRANCE)，和TALL-1(也称BlyS,BAFF或THANK)的那些(参见例如Gruss和Dower,血液，85:3378-3404(1995);Pitti等,生物学化学杂志，271:12687-126卯(1996);Wiley等，Immunity,3:673-682(1995);Browning等，细胞，72:847-856(1993);Armitage等，自然，357:80-82(1992),1997年1月16日公开的WO97/01633;1997年7月17日公开的WO97/25428;Marster等，Curr.Biol.,8:525-528(1998);Chicheportiche等，Biol.Chem.，272:32401-32410(1997);Hahne等，J.Exp.Med,,188:1185-1190(1998);W098/28426,1998年7月2日公开；W098/46751,1998年10月22日公开；WO/98/18921,1998年5月7日公开；Moore等，科学，285:260-263(1999);Shu等,J丄eukocyteBiol.,65:680(1999);Schneider等，J.Exp.Med.,189:1747-1756(1999);Mukhopadhyay等，生物学化学杂志，274:15978-15981(1999))。在此所用术语"标记的表位，，指包含与"标记多肽"融合的Apo-2配体或其一部分的嵌合多肽。标记多肽有充足的残基以提供表位以制备抗该表位的抗体，但是它要足够短，不会干扰Apo-2配体的活性。标记多肽也优选是相当独特的，使得抗体基本上不与其它表位交叉反应。合适的标记多肽通常有至少6个氨基酸残基，且通常为约8到约50氨基酸残基(优选约10-20个残基)。术语"二价金属离子，，指具有两个正电荷的金属离子。本发明所用二价金属离子包括但不限于锌，钴，镍，镉，镁，锰。这些金属的可利用形式包括盐形式(如药物上可接受的盐形式)，如上述二价金属离子的盐酸盐，乙酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐和疏酸盐。本发明所用优选的二价金属离子是锌，更优选其盐形式，硫酸锌。本发明优选所用二价金属离子的浓度或量(如有效量)足以，例如(l)在所需时间内增强Apo-2L三聚体的保存稳定性，(2)在重组细胞培养或纯化方法中增强Apo-2L三聚体的生产量，(3)增强Apo-2L三聚体的溶解性(或減少凝聚)，(4)促进Apo-2L三聚体的形成。"分离，"当用于描述本文公开的各种蛋白时，是指从蛋白的天然环境的成分中鉴定，分离和/或回收的蛋白。其天然环境中的杂质成分是通常可以干扰对该蛋白的诊断或治疗的物质，可能包括酶，激素，及其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，蛋白可以(l)纯化至足以通过采用转杯式测序仪得到至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)纯化至在非还原或还原条件下经SDS-PAGE及考马斯兰或优选银染色证实为均质的程度。分离的蛋白包括重组细胞中的原位蛋白，因为Apo-2配体天然环境中的至少一种成分不存在。但是通常，需要通过至少一步纯化步骤制备分离的蛋白。"分离"的Apo-2配体核酸分子是从Apo-2配体的天然来源中通常与其结合的至少一种杂质核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。分离的Apo-2配体核酸分子的形式和设定不同于其在天然环境中所见。因此分离得到的Apo-2配体核酸分子不同于Apo-2配体核酸分子在其天然细胞中的状态。但是分离得到的Apo-2配体核酸分子包括通常表达Apo-2配体的细胞中的Apo-2配体核酸分子，例如在所述细胞中，核酸分子所处染色体位置不同于天然细胞中的。在此鉴定的序列的"氨基酸序列同一性百分比(％)"定义为在比对序列及必要时引入缺口以获得序列同一性的最大百分比，且不考虑作为序列同一性的部分的任何保守取代时，候选序列中与Apo-2配体序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。旨在确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术人员所知的能确定用于测定比对所需相应参数的多种途径完成，包括指定能获得对全长比对序列的最大比对所需的算法。为此目的，氨基酸序列同一性百分比可通过使用序列比对的计算机程序ALIGN-2得到，该程序由Genentech,Inc.授权，其源代码已连同用户手册提交美国版权局，华盛顿特区，20559,在美国版^又局注册号码TXU510087。该程序可从Genetech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA^HH寻到。所有序列比对参数由ALIGN-2程序设定，没有改变。术语"调控序列"指在特定宿主生物中使可操作连接的编码序列表达所必需的DNA序列。适于原核生物的调控序列可包括如启动子，任选操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核生物细胞利用启动子，聚腺苷酸化信号和增强子。当核酸与另一核酸序列所处的位置使它们功能相关时，它们是"可操纵连接的"。例如，前序列或分泌前导序列的DNA如果表达为参与其多肽分泌的前蛋白，则其与编码该多肽的DNA可操纵相连；启动子或增强子如果影响一个编码序列的转录则与该编码序列可操纵相连；或者核糖体结合位点当位于可促进翻译的位置时其与编码序列可操纵连接。通常，"可操纵连接"意指所连接的DNA序列相邻，如果是分泌前导序列，是指是相邻且在阅读状态下。但是，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制位点的连接反应来完成。如果这类位点不存在，按照传统方法使用合成的寡核苷酸衔接体或接头。本文中的"生物活性的"或"生物活性"意指(a)在体内或体外至少一种哺乳动物癌细胞或感染病毒的细胞中诱导或刺激凋亡的能力；(b)能够形成抗体，即具有免疫原性；或(c)能够结合和/或刺激Apo-2L的受体；或(d)保留天然Apo-2L多肽的活性。术语"凋亡，，和"凋亡活性，，使用其广义，指哺乳动物中有序地或受控形式的细胞死亡，通常伴随着一个或多个特征性细胞变化，包括细胞质浓缩，质膜微绒毛的缺失，细胞核的i节革殳，染色体DNA的降解或线粒体功能的丧失。这种活性可通过，例如细胞活力分析，FACS分析或DNA电13泳来确定和测定。术语"癌，，"癌性的"或"恶性的"是指或描述哺乳动物中通常以失控的细胞生长为特征的生理状态。癌的例子包括但不限于癌(carcinoma)，淋巴瘤，白血病，母细胞瘤，肉瘤。这些癌的更具体的例子包括鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，恶性胶质瘤，胃肠道癌症，肾癌(renalcancer),卵巢癌，肝癌，结直肠癌，子宫内膜癌，肾脏癌(kidneycancer),前列&，癌，曱状腺癌，成神经细胞瘤，胰腺癌，多形性成胶质细胞瘤，子宫颈癌，胃癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，头和颈部癌。术语"治疗"在此是指治愈性治疗和预防性治疗。术语"哺乳动物，，在此是指任何可归类为哺乳动物的动物，包括人，牛，马，狗和猫。在本发明优选的实施方案中，哺乳动物是人。II.本发明的组合物和方法已有文献记述了与TNF配体家族相关的新的细胞因子，本文称之为"Apo-2配体"。人Apo-2配体预计的成熟氨基酸序列包含281个氨基酸，理论分子量约为32.5kDa。缺乏信号序列和具有内部的疏水区域表明Apo-2配体是一种II型跨膜蛋白。还有文献记述了可溶性胞外区域Apo-2配体多肽。参见，例如公开于1997.7.17的W097/25428。还有文献记述了Apo-2L取代变体。利用丙氨酸扫描技术证实了多种具有生物活性的取代变体分子。特定的Apo-2配体取代变体包括其中至少一个氨基酸被丙氨酸残基取代的那些。这些取代变体祐:确定为，例如，"D203A";"D218A";"D269A"。使用此命名法确定Apo-2配体变体，它们在203,218和/或269位的天冬氨酸残基(使用图l(SEQIDNO:l)中的编号)为丙氨酸残基所取代。可选地，Apo-2配体变体可能包含下表1中引用的一个或多个丙氨酸取代。本发明也提供了Apo-2配体胞外区域的x-射线晶体结构，进行了丙氨酸扫描诱变以提供其受体接触区域的图像。所得Apo-2配体结构显示为一种同型三聚体蛋白，其包含一个新的协调Apo-2配体三聚体分子三个亚基之间相互作用的二价金属离子(锌)结合位点。借助TNF-a模型通过分子取代确定Apo-2配体的x-射线结构(Eck等，生物学化学杂志，264:17595-17605(1989))，精确到3.9埃(对于114-281位残基形式而言)和1.3埃(对于D218A变体；91-281位形式而言)。象TNF家族其它成员一样，Apo-2配体表现出包含由三个薄巻样(jellyroll)单体形成的紧凑三聚体形式，共约5100平方埃(每个单体1700平方埃)以形成^求状三聚体(参见图2A)。核心p链的位置相对于TNF家族的其它结构性特征性成员，如TNF-a(Eck等，出处同上；Jones等,自然，338:225-228(1989)),TNF-(3(Eck等，生物化学杂志，267:2119-2122(1992))，和CD40L(Karpusas等，Structure,3:1031-1039(1995))是高度保守的，与TNF國a或TNF-p的核心带相比r.m.s.d.为0.8埃。在所有现在已知的人TNF家族成员的序列之间，Apo-2配体三聚体界面中没有一个残基表现出是绝对保守的；但是，保留了这些残基的疏水性化学性质。(参见图3)。Apo-2配体三聚体界面中保守的残基集中靠近底部(三聚体的最宽部分)且沿三重轴聚集。在Cys230邻近区中靠近Apo-2配体三聚体界面的顶部的位置，结构表现出不同，在每一结构中190，s和230's环的构象是可变的。与卩-支架核心相比，TNF家族成员之间环和受体结合表面的结构显著不同。Apo-2配体和TNF-a，TNF-p,CD40L的结构间的一个不同是A和A，链间的连接。在TNF-a,TNF-P,CD40L中，A链后接一个紧密的环。在Apo-2配体中，一个15个残基的插入部分加长了此环并改变了其构象。此环的第一部分(131-141位残基)是无序的，而此环的第二部分(142-154位残基)在该分子表面从一个单体-单体界面跨到下一个界面(参见图2A)，其构象类似CD40L的C-末端部分。申请人惊讶的发现在三聚体界面的顶部附近埋藏着一个新的二价金属离子(锌)结合位点。通过序列分析根据Cys230可将TNF家族成员分为三组(l)如TNF-a和Fas配体等蛋白，它们在对应于Cys230的位置有一个半胱氨酸残基能与相邻环(Apo-2L中的194-203环)上的另一半胱氨酸形成二碗^桥，从而不与金属离子反应，(2)没有对应于Cys230的半胱氨酸的那些蛋白(如TNF-P和OPGL)，和(3)只有一个对应于Cys230的半胱氨酸残基的那些蛋白。在其它种类中Apo-2L和其ortholog符合后一标准(即只有Cys230的蛋白)，预计它们可在三聚体表面结合二价金属离子。Apo-2配体中紧接Cys230之前的主链的构象与含二硫桥的TNF家族成员如TNF-a和CD40L不同。在Apo-2配体中，Cys230的侧链指向界面而不是相反。在每一Apo-2配体单体中的Cys230残基向内指向三聚体轴并调整与内部溶剂分子相连的二价金属离子。此二价金属离子表现出稍微变形的四面体几何形状，其键和角度与锌结合位点吻合且完全不能接触溶剂(参见图2B)。使用电感耦合的等离子体原子发射光谱(ICP-AES)(参见实施例5)确认所结合的金属。在使用ICP-AES对Cd,Co,Zn，Ni,Cu的定量分析中，每摩尔Apo-2配体三聚体中检测到0.79摩尔Zn和0.06摩尔Co,这证明结构中的结合离子是锌，摩尔比例约为1:1(参见实施例5)。观察到Cys230被丙氨酸取代导致凋亡活性降低>8倍，说明此位点的重要性(参见实施例7)。而且，通过对螯合剂透析从Apo-2L中除去结合的金属会导致DR5亲和力降低7倍，凋亡活性降低>90倍(参见实施例6)。除去Zn^f吏半胱氨酸变得易于氧化，形成二硫键连接的Apo-2L二聚体，其凋亡活性会降低。由于金属结合位点显示出埋藏在Apo-2L三聚体结构中且预计不会和受体接触，该资料显示二价金属离子的结合对保持三聚体结构和Apo-2L的稳定性是重要的。为绘出Apo-2配体的受体结合位点，通过丙氨酸扫描诱变鉴定对于受体结合和生物活性有重要意义的氨基酸残基。(Cunningham等，科学，244:1081-1085(1989》。在Argl49，Gln205,Val207,Tyr216，Glu236或Tyr237处的单个丙氨酸取代导致在生物检测中凋亡活性降低5倍以上，并且对受体的亲和力也降低了(参见实施例3和4)。对Apo-2L与DR4，DR5，DcR2的结合影响最大的是在残基Gln205,Tyr216,Glu236或Tyr237处的丙氨酸取代，这会导致对全部三种受体的亲和力降低至少5倍。所有这些显现出凋亡活性降低的变体同样显示出与DR4或DR5(或两者)的结合受到损害，这表明凋亡活性需要受体结合。残基Asp218和Asp269的丙氨酸取代产生凋亡活性提高的Apo-2配体变体。(参见实施例4)。残基Asp218靠近凋亡活性所需残基之一的Tyr216。与低解像度Apo-2L结构(114-281位的形式)的对比表明216-220环的构象没有因D218A突变的出现而显著改变。将该诱变分析的结果绘制为Apo-2L三聚体结构，发现Apo-2L上受体结合和生物活性的功能性表位位于由两个单体连接而形成的表面(参见图5),近似于TNF-P。位于单体-单体界面的浅沟形成受体结合位点，使这两种单体对该结合位点均有贡献。TNF-a中的残基Arg32,Tyr87和Aspl43(对应于Apo-2L的Argl58，Tyr216，Asp267位残基)同样对TNF受体的结合起作用。(Goh等，蛋白质工程(ProteinEngineeing),4:785-791(1991))。作为对照，TNF-a中的残基(对应于Apo-2L的Gln205，Glu236,Tyr237位残基)在TNFR结合中只起很小的作用。所以，在TNF-a中三聚体结构的底部对受体结合起最重要的作用，但在Apo-2L中，在三聚体结构顶部也有重要的受体结合残基。在已知结构的TNF家族成员中，Apo-2L的独特性表现在它与其靶受体之间具有更大和更宽的相互作用接触表面。相信优选的Apo-2L变体将在对应于Argl49，Gln205,Val207,Tyr216,Glu236和/或Tyr237的位点含有天然残基(即未突变的)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>以下说明书涉及通过培育宿主细胞来生产Apo-2配体并从细胞培养中回收多肽的方法，所述宿主细胞已用含有编码Apo-2配体的核酸的载体转化或转染。可从认为具有Apo-2配体mRNA且将其以可检测水平表达的组织中制备cDNA文库，然后从任意这样的cDNA文库中得到编码Apo-2配体的DNA。相应地，可从由人组织制备的cDNA文库中方便地得到人Apo-2配体DNA,例如W097/25428中记述的人胎盘cDNA的噬菌体文库。编码Apo-2配体的基因也可从基因组文库获得或通过寡核苷酸合成的方法得到。可使用设计为鉴定目的基因或其编码蛋白的4罙针(如Apo-2配体的抗体或至少约20-80个碱基的寡核苦S吏)来筛选文库。用所选探针筛选cDNA或基因组文库可按照标准方法进行，如Sambrook等，分子克隆实验室手册(纽约冷泉港实验室出版，1989)中的方法。分离编码Apo-2配体基因的备选方法是釆用PCR的方法(Sambrook等，出处同上；Dieffenbach等，PCR引物实验室手册(冷泉港实验室出版，1995))。Apo-2配体的氨基酸序列片段或变体的制备方法可以是在Apo-2配体DNA中引入适合的核苷酸改变，或合成所要的Apo-2配体的多肽。这类片段或变体是在胞内区域，跨膜区域，或胞外区域，或图1所示全长度Apo-2配体的氨基酸序列(SEQIDNO:l)的一或两端上或之内出现残基的插入，取代，和/或缺失。可进行插入，取代，和/或缺失的任意组合以得到最终的构建体，以使最终的构建体具有，例如，本文定义的所需生物活性或凋亡活性。在一优选的实施例中，所述片段或变体与本文鉴定为Apo-2配体的胞内区域，跨膜区域，或胞外区域，或全长的序列有至少约80。/。的M酸序列同一性，更优选至少约90%的序列同一性，更优选至少95%，96%，97%,98%或99%的同一性。氨基酸改变可能还会改变Apo-2配体的转录后加工，例如改变糖基化位点的数量或位置或改变膜锚着特征。上述的Apo-2配体序列的改变可利用美国专利5364934中提出的针对保守和非保守突变的技术和指南进行。这些包括寡核苷酸介导的(定点)诱变，丙氨酸扫描和PCR诱变。可采用扫描氨基酸分析证实沿着邻近序列的一或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对较小的，中性氨基酸。这类氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸和半胱氨酸。在此组中丙氨酸是典型的优选扫描氨基酸，这是因为它去除了(3-C外的支链，且较不可能改变变体的主链构象(Cunningham等，科学，244:1081(1989))。优选丙氨酸也是因为它是最常见的氨基酸。此夕卜，它频繁出现在埋藏和暴露位置(Creighton，蛋白质(TheProteins)，(W.H.Freeman&Co.，NY);Chothia，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，150:1(1976))。本发明特定的Apo-2L变体包括Apo-2配体多肽，所述多肽包含在下表I中列出的一或多个丙氨酸取代。这类Apo-2配体变体通常包含一个非自然产生的氨基酸序列，该序列与天然Apo-2L氨基酸序列(如图1:SEQIDNO:1所示的Apo-2L全长序列或其成熟形式或其胞外区序列)有至少一或多个氨基酸不同。任选地，Apo-2L变体中与天然Apo-2L相比不同的一或多个氨基酸将包括例如那些在表1中列出的氨基酸取代。本发明的Apo-2L变体包括可溶性变体，其含有图l(SEQIDNO:l)的91-281,92-281，95-281或114-281位残基，并且具有表1所列的一或多个氨基酸取代。优选的Apo-2L变体包括含有图l(SEQIDNO:l)中91-281,92-281,95-281或114-281位残基，并且具有表1所列增强生物活性，如受体结合之一或多个氨基酸取代的变体。同样包括在本发明范围内的Apo-2配体序列的改变涉及氨基末端衍生或修饰形式。这类Apo-2配体序列包括本发明所述在多肽序列的N-末端具有蛋氨酸或修饰过的蛋氨酸(如甲酰曱硫氨酰化或其它分段曱硫氨酰化的类另'j)的任一Apo-2配体多肽。编码天然或变体Apo-2配体的核酸(如cDNA或基因组DNA)可插入到复制载体进行进一步克隆(DNA扩增)或表达。各种载体都是公开可得的。载体组件通常包括，但不限于，下列的一或多个信号序列，复制起点，一或多个标记基因，增强子元件，启动子，转录终止序列，下面对每一个进行了记述。可采用的任选信号序列，复制起点，标记基因，增强子元件和转录终止序列为本领域所公知，详述于WO97/25428。表达和克隆载体通常包括，可被宿主有机体识别并与Apo-2配体核酸序列可操纵连接的启动子。启动子是不翻译序列，位于结构基因起始密码子的上游(5')(通常在100到1000bp以内)，可控制特定核酸序列，如与之可操纵连接的Apo-2配体核酸序列的转录和翻译。这类启动子典型地分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子响应培养环境中的一些改变，如某种营养成分的存在或缺少，或温度变化而调控DNA转录水平的提高。现在为多种潜在的宿主细胞识别的大量的启动子已熟知。通过采用限制酶消化从来源DNA取出启动子，然后将分离的启动子序列插入载体，可将这些启动子与Apo-2配体^i从连接。天然Apo-2配体启动子序列和许多异源启动子都可用于指导Apo-2配体DNA的扩增和/或表达。适合原核生物和真核生物宿主所用的启动子为本领域所熟知，W097/25428中有详述。在大肠杆菌中生产可溶性Apo-2L的优选方法采用诱导型启动子调节产物的表达。使用可控的，诱导型的启动子可以在诱导产物表达和大量产物积累(至宿主可能不能很好耐受的程度)之前使细胞培养生长到所需密度。本申请人评价了用于表达Apo-2L(114-281位)的三种诱导型启动子系统(T7聚合酶，trp和碱性磷酸酶(AP))。釆用这三种启动子中每一个都可从收获的细胞团中得到大量可溶性的，具生物活性的Apo-2L三聚体。在检测的这三种诱导型启动子系统中优选AP启动子，因为它可进行更严格地启动子控制，且在收获的细胞团中得到了更高的细胞密度和滴度。采用标准连接技术构建包含一或多个上列部件的合适载体。切割，修剪，并重新连接分离的质粒或DNA片段为所需的形式以便形成质粒。为分析确认构建质粒中的正确序列，使用连接混合物转化大肠杆菌K12菌抹294(ATCC31446)，通过氨千青霉素或四环霉素抗性挑选相应的成功的转化体。制备来自转化体的质粒，通过限制性内切酶消化分析，和/或用本领域所知的标准技术进行测序。(参见，例如Messing等，核酸研究(NucleicAcidsRes.),9:309(1981));Maxam等，酶学方法(MethodsinEnzymology)，65:499(1980》。可采用用于在哺乳动物细胞中瞬时表达Apo-2配体编码DNA的表达载体。通常，瞬时表达涉及使用可在宿主细胞中有效复制的表达载体，使宿主细胞积累该表达载体的许多拷贝，合成高水平的为该表达载体编码的所需多肽(Sambrook等，出处同上)。包含合适的表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统可以便利地对由克隆的DNA编码的多肽进行阳性鉴定，同样可以快速筛选具有所要生物或生理性质的多肽。这样，瞬时表达系统特别有用于本发明目的鉴定具有生物活性的Apo-2配体的类似物和变体。其它适于在重组脊推动物细胞珞养中合成Apo-2配体的方法，载体和宿主细胞记述于Gething等，自然，293:620-625(1981);Mantei等，自然，281:40-46(1979);EP117060和EP117058中。适于在本文所述载体中克隆或表达DNA的宿主细胞包^r原核生物，酵母，或高等真核生物细胞。适于此目的的原核生物包括，但不限于真细菌，如革兰氏阴性或阳性生物，如肠杆菌科如埃希氏菌属，如大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷伯氏菌属，变形菌属，沙门氏菌属，如鼠伤寒沙门氏菌，沙雷氏菌属，如粘质沙雷氏菌，志贺氏菌属，芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(如1989年4月12日的DD266710公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属如铜绿假单胞菌，链霉菌属。优选地，宿主细胞分泌蛋白水解酶的量应最小。本发明优选的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌特别适于Apo-2配体(114-281位)的表达，其为小于20kd且不需糖基化的多肽。作为生产宿主，大肠杆菌可培养到相对高的细胞密度，且相对M平地生产异源蛋白。除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也适于作编码Apo-2配体的载体的克隆或表达宿主。适合于糖基化Apo-2配体表达的宿主细胞得自多细胞生物。所有这些宿主细胞的例子，包括CHO细胞，如W097/25428所述。用上述生产Apo-2配体的表达载体或克隆载体转染并优选转化宿主细胞，所述细胞培养在已经修饰适于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因的培养基中。转染指表达载体被宿主细胞吸收，而无论是否实际表达了任何编码序列。多种转染方法为普通技术人员所熟知，例如，CaP04和电穿孔。通常当此载体的作用的任何指示表现在宿主细胞中时就可认定转染成功。转化意味着将DNA引入到生物中，使该DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体而复制。根据所用宿主细胞，釆用适于这类细胞的标准技术进行转化。Sambrook等(出处同上)所述利用了氯化钙的钙处理或电穿孔通常可用于原核生物或其它具有实际的细胞壁屏障的细胞。根癌农杆菌感染可用于特定植物细胞的转化，如Shaw等，基因，23:315(1983)和1989年6月29日公开的WO89/05859。此外，可如1991年1月10日公开的WO91/00358所述采用超声处理来转染植物。对于没有这类细胞壁的哺乳动物细胞，可4吏用Graham和vanderEb，Virology,52:456-457(1978)所述的磷酸钙沉淀的方法。US4399216记述了哺乳动物细胞宿主系统转化的各个方面。典型地，可按照VanSolingen等，J.Bact.，130:946(1977)和Hsiao等，美国国家科学院院才艮，76:3829(1979)转化酵母。但也可使用其它将DNA引入细胞的方法，如核显微注射，电穿孔，细菌原生质体与完整细胞融合，或聚阳离子，如polybrene，聚鸟氨酸。对于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等，酶学方法，185:527-537(1990)和Mansour等，自然，336:348-352(1998)。用于生产Apo-2配体的原核生物细胞可培养在适合的培养基中，如Sambrook等，出处同上，所述。在下面的实施例中还给出了用于培养大肠杆菌的特殊形式的培养基。用于生产Apo-2配体的哺乳动物宿主细胞可培养在多种培养基中。市售培养基有Ham，sF10(Sigma),极限必需培养基("MEM，，，Sigma)，RPMI-1640(Sigma),Dulbecco'sModifiedEagles'sMedium("DMEM，，，Sigma)。任何这类培养基可在必要时补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素，运铁蛋白或表皮生长因子)，盐(如氯化钠，钙，镁和磷酸)，緩冲液(如HEPES)，核苷(如腺噤呤和胸腺嘧啶)，抗生素(如遗传霉素TM),痕量元素(定义为无机化合物，通常最终浓度为inmol级)，以及葡萄糖或等效的能源。任何其它必需的补充物质都按照本领域技术人员所熟知的合适的浓度添加其中。培养条件，如温度，pH等等都与前面所选用于表达的宿主细胞的条件相同，且对本领域一般技术人员来说是显而易见的。通常，在哺乳动物细胞生物技术实践方法，M.Butler,编(IRL出版，1991)中可找到哺乳动物细胞培养生产能力最大化的原理，方法，和实践技术。按照本发明，用于宿主细胞培养或发酵的培养基中可加入或包括一或多种二价金属离子。存在于或加入到培养基中的二价金属离子的浓度优选足以提高保存稳定性，提高溶解性，或有助于形成稳定的受一或多个锌离子调节的Apo-2配体三聚体。加入的二价金属离子的量部分有赖于培养液中的宿主细胞密度或宿主细胞对这些二价金属离子的潜在敏感性。当培养液中宿主细胞密度较高时，提高二价金属离子的浓度较有利。如果在宿主细胞的产物表达期间或之后加入二价金属离子，可随宿主细胞产物表达的增加而调整或提高二价金属离子浓度。通常认为常用细胞培养基中的痕量的二价金属离子不足以促使稳定三聚体的形成。所以，优选如本文所述进一步添加二价金属离子。优选在宿主细胞生长阶段将二价金属离子加入到培养基中时，其浓度不会对宿主细胞生长有不利或负面影响。在摇瓶培养中，观察到ZnS04的加入浓度大于lmM时会导致宿主细胞密度低。本领域技术人员理解，细菌细胞能通过与细胞基质形成金属离子复合物有效螯合金属离子。如此，在细胞培养液中，优选在细胞生长阶段后(达到所要的宿主细胞密度后)或恰好在宿主细胞的产物表达之前加入所选的二价金属离子。为确保存在足够量的二价金属离子，可能要在产物表达阶段加入额外的二价金属离子。培养基中二价金属离子的浓度不应超过对宿主细胞有毒害作用的浓度。在本发明使用大肠杆菌为宿主细胞的方法中，优选培养基中二价金属离子浓度不超过约lmM(优选SlmM)。更优选所述浓度为约50-250|iimol。最优选这类方法中的二价金属离子是硫酸锌。二价金属离子需要加入的量应使金属离子和Apo-2配体三聚体摩尔比为1:1。二价金属离子可以任何可接受的形式加入到细胞培养液。例如，可用水配制金属离子溶液，然后将二价金属离子溶液加入或流加到培养基中。在本发明的一个实施例中，所选的Apo-2配体(114-281位)在大肠杆菌中表达，且在细胞培养或发酵期间，设定工艺参数使得在培养物约为40-50gm/L细胞干重时以约1.0-3.0mmol/L-min的氧摄入率进行细胞内各种活动。优选新合成的新生Apo-2配体多肽有足够的时间使Apo-2L单体进行正确的蛋白折叠和三聚体化。发酵培养的生长阶段优选在3CTC进行。在产物表达即将出现之前，工艺温度控制点可保持在30。C或下移到25。C以便随后的发酵。任选地，可能需要提高培养中细胞密度，上述参数也要相应调整(或22提高)。例如，提高培养中细胞密度以提高单位体积产量可能是有利的。如果需要，本领域技术人员能通过常规技术递增细胞密度并且递增上述的参数。可直接测定样品中Apo-2L的表达，例如采用合适的标记探针，根据本文提供的序列通过常规Southern印迹，定量mRNA的转录的Northern印迹(Thomas，美国国家科学院院报，77:5201-5205(1980))，斑点印迹(DNA分析)，或原位杂交等方法。可使用多种标记，最常用的是放射性同位素，具体是32P。但是也可采用其它方法，如利用生物素修饰的核苷酸以引入多核苷酸。然后生物素成为结合抗生物素蛋白或抗体的位点，后者可用多种标记，如放射性核苦酸，荧光剂或酶标记。替代地，可使用能识别特定的双链体(duplex),包括DNA双链体，RNA双链体，和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白双链体的抗体。抗体可被标记且可在所述双链体与某一表面结合处进行检测，从而根据表面双链体的形成检测到与该双链体结合的抗体。或者可通过免疫学方法检测基因表达，如通过细胞或组织切片的免疫组织化学染色，细胞培养液或体液的分析，直接定量基因产物的表达。采用免疫组织化学染色技术，制备细胞样品的典型方法为脱水和固定，然后与特异性针对所结合的基因产物的标记抗体反应，其中所述标记是通常可目测检测的，如酶标记，荧光标记，发光标记等。免疫组织化学染色和/或样品液分析所用抗体可以是单克隆的或多克隆的，可在任何哺乳动物中制备。抗体制备成针对天然Apo-2配体多肽或针对基于本文所述DNA序列的合成肽或针对与Apo-2配体DNA融合并编码特异性抗体表位的外源序列的抗体较为方便。尽管Apo-2配体当没有分泌信号而直接产生时也可从宿主细胞裂解液回收，优选从培养液作为分泌型多肽回收。如果Apo-2配体是膜结合型，可使用合适的清洗剂(如Triton-X100)从膜释放，或可通过酶解释放其胞外区。当Apo-2配体产生于重组细胞而不是一种人类细胞中时，该Apo-2配体不含人源蛋白或多肽。但是，通常从重组细胞蛋白或多肽中回收或纯化Apo-2配体以得到基本均质的Apo-2配体制品是必需的。第一步，离心培养液或裂解液以除去颗粒状细胞碎片。然后从可溶性杂质蛋白和多肽中纯化Apo-2配体，下面的步骤可作为纯化步骤举例在离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC;硅或阳离子交换树脂如DEAE或CM层析；层析聚焦；SDS-PAGE;硫酸铵沉淀；采用如SephadexG-75的凝胶过滤；渗滤和蛋白ASephrose柱除去杂质如IgG。在一优选的实施例中，可采用亲和层析分离Apo-2配体。以与天然Apo-2配体相同的方式回收发生了残基缺失，插入或取代的Apo-2配体片段或变体，并考虑由所述变异引起性质的任何实质性变化。例如，制备Apo-2配体与另一蛋白或多肽，例如细菌或病毒抗原的融合体利于纯化；可用含有所述抗原的抗体的免疫亲和柱吸附该融合多肽。蛋白酶抑制因子如苯曱基磺酰氟(PMSF)可用于纯化过程中抑制蛋白水解性降解，还可使用抗生素预防外来杂质的生长。本领域技术人员会理解适于天然Apo-2配体的纯化方法可能需要进行改动以适应重组细胞培养中表达的Apo-2配体或其变体的特性的改变。在任何这类纯化过程中，可能需要将回收的Apo-2配体暴露于二价金属离子溶液或含有一或多种二价金属离子的纯化材料(如层析介质或载体)。在一优选的实施例中，在Apo-2配体的纯化或回收过程中使用二价金属离子和/或还原试剂任选地，在Apo-2L的回收或纯化期间，二价金属离子和还原剂，如DTT或BME都可使用。认为在回收或纯化过程中使用二价金属离子有助于Apo-2L三聚体的稳定性或保持细胞培养过程中形成的Apo-2L三聚体。从原核生物宿主细胞(最优选从细菌宿主细胞)回收和纯化所表达的Apo-2L的优选方法包括如下步骤(a)从大肠杆菌细胞提取Apo-2L(胞内型)；(b)在含二价金属离子和/或还原剂的緩冲液中稳定正确折叠的Apo-2L;(c)通过依次使用阳离子交换剂，羟基磷灰石和疏水作用层析纯化Apo-2L，和(d)从每一这类层析载体上用含二价金属离子和/或还原剂的緩沖液选择性洗脱Apo-2L。此类方法中所用二价金属离子和还原剂可包括硫酸锌，氯化锌，硫酸钴，DTT和BME,更优选硫酸锌或DTT。下面的实施例8更为详尽地记述了此回收和纯化方法。如上所述，除Apo-2配体外，本发明的这类方法还适用于各种其它蛋白，所述蛋白的三聚体形式具有改进的活性或需要蛋白的三聚体化以具有活性。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>本发明也提供了含有Apo-2配体和一或多种二价金属离子的制剂。相信这类制剂特别适用于保存(和维持Apo-2配体的三聚体化)，以及用于治疗性给药。优选的制剂包含Apo-2配体和锌或钴。更优选地，制剂将包含Apo-2配体和锌或钴溶液，其中所述金属与蛋白的摩尔比小于2X。如果需要水性的悬浮液，制剂中二价金属离子对蛋白的摩尔比大于2X。采用硫酸锌，申请人发现Apo-2配体(114-281位)沉淀并在制剂中硫酸锌浓度约为100mM时形成水性悬浮液。本领域技术人员会理解摩尔比大于2X时，制剂中二价金属离子浓度会在较高范围，此时该金属会对制剂有害或不能作为治疗用制剂。可采用已知技术制备所述制剂。例如，可通过凝胶过滤柱上的緩冲液交换来制备Apo-2配体制剂。通常，在制剂中采用合适量的可药用盐以使该制剂为等渗。可药用载体的例子包括生理盐水，Ringer，s溶液和葡萄糖溶液。优选制剂的pH约为6-9，更优选约7-7.5。优选地，所选pH可确保维持锌与Apo-2配体结合。如果pH太高或太低，锌不能保持与Apo-2配体的结合，结果会形成Apo-2配体的二聚体形式。本领域技术人员知道，某些载体可能更优选依赖于，例如，给药途径以及Apo-2配体和二价金属离子的浓度。Apo-2L的药用组合物的制备可以是将具有合适纯度的所需Apo-2配体分子与任选的可药用载体，赋形剂，或稳定剂混合(Remington，s药用科学，16th版，Oslo,A编(1980))，制成冻干制剂，水溶液或水性悬浮液。可接受的载体，赋形剂或稳定剂优选在所用剂量和浓度下对接受者无毒，它们包括緩冲液如Tris，HEPES，PIPES,磷酸，柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基千基氯化铵；氯化乙烷双胺；苯扎氯胺，氯化千乙氧铵；酚，丁醇或千醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯曱酸曱酯或对羟基苯曱酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-曱酚)；低分子量(小于10个残基)多肽；蛋白如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖或糊精；糖类如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEEN,PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。其它这类载体包括离子交换剂，矾土，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，如人血清白蛋白，緩冲物质如甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，硅胶，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，和基于纤维素的物质。局部用药的载体或基于凝胶的载体包括多糖如羧甲基纤维素钠或曱基纤维素钠，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇，木蜡醇。对所有给药而言，适合用常规的延效型制剂。这类剂型包括，例如微胶嚢，纳米胶嚢(nano-capsules),脂质体，药膏，吸入剂型，喷鼻剂型(nosespray),舌下片剂和控释制剂。制剂中Apo-2配体的有效剂量可根据经-险确定，这类确定可由本领域技术人员完成。现认为Apo-2配体的有效剂量为每天约lpg/kg-100mg/kg体重或更多。剂量的种间缩》文比例可以4安本领域已知方式进行，如Mordenti等，Pharmaceut.Res.,8:1351(1991)中所述。本领域技术人员理解Apo-2配体给药剂量将根据，例如要接受Apo-2配体的哺乳动物，给药途径，和给哺乳动物的其它药物或治疗的不同而不同。用于体内给药的Apo-2L必须是无菌的。这可以在冻干和重新调配之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。全身性给药的Apo-2配体通常以冻干或溶液形式保存。冻干形式的Apo-2配体通常与其它成分一起配制，临用时再用适当稀释剂重建。Apo-2配体的液体制剂可以是无菌，澄清，无色未加防腐剂的溶液，盛放于一次剂量的小瓶中用于皮下注射。治疗用Apo-2配体制剂通常存放于有无菌出入口的容器中，例如，静脉注射液袋或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶。制剂优选通过多次的静脉(i.v.),皮下(s.c.),肌肉(i.m.)注射或输注给药，或作为适用于鼻内或肺内输送的气溶胶而给药(肺内输送参见例如EP257956)。Apo-2配体也可以以控释制剂形式给药。控释制剂的适当实例包括含有所述蛋白的固态疏水聚合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶嚢。控释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)(如Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.,12:98-105(1982)所述)或聚(乙烯醇)，聚交酯(US3，773，919,EP58481),L-谷氨酸与y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers,21547-556(1983)),不可降解的乙烯乙酸乙酯(Langer等，出处同上)，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LupronDepot(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide)组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸(EP133988)。本发明所述Apo-2配体及其制剂可用于许多治疗和非治疗用途。其中有治疗多种癌症(如上)和病毒性病症的方法。这类治疗和非治疗用途如W097/25428和WO97/01633中所述。包含可用于上述疾病的诊断或治疗的Apo-2配体的一种生产制品，如试剂盒包括至少一个容器和一个标签。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器和试管等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器可内含一种能有效诊断或治疗目标疾病的Apo-2L制剂，并具有无菌出入口(例如该容器可以是静脉注射液袋或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。容器表面的或所附的标签将指明所述制剂可用于诊断或治疗所选疾病。所述制品还可包含第二个容器，该容器中含有可药用緩冲液，如磷酸盐緩冲液，Ringer，s溶液和葡萄糖溶液。还可包括具有商业需要以及符合用户需要的材料，包括其它緩冲液，稀释剂，滤器，针头，注射器和用于指导使用的包装插页。所述制品还可包含带有上述另一活性制剂的第二个或第三个容器。下面的实施例只用于举例说明，不应视为对本发明的限制。本发明中引用的所有发明和文献都全文引入作为参考。实施例实施例中所指市售试剂除非特别指明，都按照生产商手册使用。按照ATCC保藏号码在下列实施例和说明书全文中定义的细胞来源是美国典型培养物保藏中心,Manassas,Wrginia。实施例1Apo-2L变体的表达和纯化通过对质粒(pAPOK5)(参见图13)进行寡核苷酸指导的诱变来构建Apo-2L的丙氨酸取代变体(Kunkel等，美国国家科学院院报，82:488-492(1985));Kunkel,酶学方法，154:367-382(1987)),所述质粒设计为可在frp启动子控制下于大肠杆菌细胞内表达Apo-2L的91-281位氨基酸。借助PCR构建pAPOK5以便将Apo-2LcDNA(编码91J81位残基)克隆进带有启动子的质粒pSl162。用该突变质粒转化的大肠杆菌菌抹294在37°C下250mlM9加100pmZnS04的培养基中培养到对数期中期，加入25|ig/mL(3-吲哚丙烯酸诱导表达，然后将培养物于30。C下培养过夜。通过离心收获细胞并冷冻。在6倍体积0.1MTris-HClpH8，0.2MNaCl,5mMDTT，lmMEDTA中匀浆上述细胞团，在加入有镍的hiTRAT螯合柱(Pharmacia)上通过IMAC从可溶性级分分离Apo-2L。Apo-2L对固定化的金属有弱亲和性，可用低浓度的咪唑洗脱。在SPhiTRAP柱(Pharmacia)上通过阳离子交换层析进行最后的纯化。测定吸光度并以e珈为1.4mg"ml.cm"来确定纯化Apo-2L变体的浓度。表1中列出了通过寡核苷酸指导的诱变证实的Apo-2L变体。表1Apo-2L变体的受体结合和凋亡活性a比例(变体/野生型)变体DR4-lgGDR5-IgGDcR2-IgG竭亡厶加cR130AN134AL136AS138AN140AS141AK142AN143AR149AS153AE155AR158AS159AR170AK179AR191AQ193AE195AK197DK201AN202AD203AQ205AV207AY213A'Y216AD218AC230SE236AY237AY240AK25IAS259AH264AD267AD269A2ri<5613od1oiL21;4!SJ4;乂1;22-Lrt53.c5Lf丄110121916785<<"刀刀27J3c.l29L22-OSGJ刀9j0,1HLOSOJ7;28a所示数值代表了变体对野生型的比例。对野生型Apo-2L(91-281位残基)而言，DR4-IgG,DR5-IgG，DcR2-IgG的Kd值是0.8土0.3nM,0.9土0.4nM，0.3士0.2nM。在凋亡试验中野生型Apo-2L(91-281位残基)的ED5Q为24±3.1ng/mL，而Apo-2L的114-281位形式的活性稍」微高一些，ED50为16.0±3.6ng/mL。只有与野生型的值相比两倍的改变才认为是显著的。实施例2Apo-2L的结晶学分析20。C下Apo-2L的晶体(l14-281位残基)在位于一孔50%peg2KMME溶液之上的70pL静止液滴(sittingdrop)中生长，该液滴中含有40pL蛋白(浓度2,6mg/mL，在20mMTris，pH8.0中)，20|aL50mMTrispH8.0，lOpL8%peg2KMME,所述晶体属于空间群P63，其中在不对称单位中具有两个单体，晶胞常数a-72.5,c-140埃并在室温下衍射为3.9埃。D218A变体的晶体(参见实施例1)4。C下在位于一孔32%MPD溶液之上的14pL静止液滴中成长，该液滴中含有4]liL4%MPD和1OpL蛋白(1.7mg/ml，在20mMTris,pH7.5中)，所述晶体属于空间群R32，其中每个不对称单位有一个单体，晶胞参数66.4，c=197.7埃，-180"€经synchrotonradiation衍射为1.3埃。在装备有MAR检测器并具有DENZO/SCALEPACK的Rigaku旋转阳极X-射线发生器上测定Apo-2L(114-281位残基)衍射为3.9埃和D218A变体衍射为1.9埃的数据组(Otwinowski等，ProceedingsoftheCCP4StudyWeekend:DataCollectionandProcessing(eds.Sawyer等),pp.56-62DaresburyLaboratory,Daresbury，England,1993)。在ArgonneNationalLabs的高级光子源(AdvancedPhotonSource)上测定D218A变体的1.3埃数据组。用HKL2000/SCALEPACK处理且Rsym为6.4%(在1.35-1.30shell中34%)，具有100%完整性和12倍冗余度，I/<I>=12.4。采用Amore程序借助基于TNF-a(pdb编码1TNTF)的模式通过分子堆放解释天然Apo-2L结构(ActaCryst.D50:760-763(1994)),并采用严4各2倍非晶体学约束使之精细化(Brunger,X-PLOR:版本3.1，YalePress，NewHaven1987),直到Rfree为35%。用Refinac和SHELXL将该结构针对1.9埃数据组精细化直到R^为25%，并最终对1.3埃数据进行精细化(Sheldrick等，酶学方法，pp.319-343，AcademicPress,SanDiego1997)直到、为22%且Rfec加为20%，其具有较好几何形状(rmsd键0.011埃，rmsd角度1.7°)。所有的残基都在Ramachandran图中允许的区域内。在精细化过程中，在三聚体轴上对称相关的Cys230之间可观察到一个28sigma的电子密度峰值。此密度以锌离子作模型，用B-系数精细化为10。据认为在三聚体轴上的氯分子作为锌的第四个配体而存在。最终的it型由带有170个溶剂分子和一个锌离子和一个氧离子的120-130，142-194，203-281位残基组成。91-119，131-141和195-202位残基为无序状态。几种晶体的N-末端测序证实N-末端是完整的，而起始物质的质谱分析表明其为全长。图2C总结了结晶学数据。实施例3Apo-2L变体的受体结合亲和性的确定通过在PharmaciaBIAcore1000上进行的表面等离子体激元共振(SPR)测量法测定Apo-2L变体(参见表l)与固相受体免疫粘附素结合的解离常数(Kd)。分别依照1998年11月19日公开的W098/51793和1999年3月9日公开的WO99/10484所述制备DR5-IgG(也称为Apo-2-IgG)和DcR2-IgG受体免疫粘附素。—如下制备DR4-IgG。将成熟DR4ECD序列(1-218位氨基酸；Pan等，出处同上)克隆至pCMV-lFlag载体(Kodak)中Flag信号序列下游，并如前所述(Aruffo等，细胞，61:1303-1313(19卯))与人免疫球蛋白Gl重链的CH1、绞链区和Fc区融合。如Ashkenazi等，美国国家科学院院4艮，88:10535-10539(1991)所述，免疫粘附素通过瞬时转染至人293细胞中而表达，然后采用蛋白A亲和层析从细胞上清中纯化。采用胺耦合化学(aminecouplingchemistry)(PharmaciaBiosensor)使受体免疫粘附素蛋白与传感器芯片表面在1000-2000共振单位的水平上耦合。记录在15.6nM到500nM的浓度范围以2倍增长的Apo-2L结合的传感图谱(Sensorgrams)。通过非线性回归分析确定动力学常数，并用于计算结合常数。所得结果显示于表l中。实施例4Apo-2L变体的体外凋亡活性变体的凋亡活性。在含有0.1%BSA的RPMI-1640培养基(Gibco)中配制Apo-2L(114-281位)或Apo-2L变体(参见表l)的2倍系列稀释液，将每种稀释液50nL移入96孑LFalcon组织培养微板的单个孔中。以2x104个细胞/孔的密度力。入50pLSKMES-1人肺癌细胞(ATCCHTB58)(在RPMI-1640，0.1。/。BSA中)。混合物37。C下孵育24小时。20小时时，加入25|liLalamarBlue(AccuMed，Inc.，Westlake,Ohio)。通it^530nm;敫发后测定590nm处的相对荧光而确定细胞数。通过使用一种4参数吻合法来分析这些数据，以便计算ED5(),它是在细胞生存力上减少了50%的Apo-2L浓度。在残基Argl49，Gln205,Val207，Tyr216，Glu236，Tyr237处的单个丙氨酸取代导致在所述生物试验中凋亡活性下降5倍以上，并且表现出对DR4,DR5，DcR2的亲和力降低(表1)。Apo-2L对这些受体的结合受Gln205，Tyr216,Glu236，Tyr237处的丙氨酸取代的影响最大，所有这些取代都会导致对所有三种受体的亲和力降低至少5倍。所有表现出凋亡活性降低的Apo-2L变体同样表现出与DR4或DR5(或两者)的结合受到损害，这表明所述生物学效应需要受体结合。Asp218或Asp269的丙氨酸取代导致凋亡活性提高2倍以上。值得注意的是大多数丙氨酸取代对DR4和DR5结合有相似的影响，唯一的例外是Glnl93,Glul95,Ser259，His264,Asp267的突变，所有这些突变都对DR4结合有大于5倍的影响(亲和力降低)，但对DR4-结合的影响却很小或几乎可以忽略。DcR2-结合的变化倾向于与DR4结合的效应平行。减小的凋亡活性显示出与降低的DR5结合最密切相关，表明SK-MES应答Apo-2L给药时死亡信号的传递需要DR5。实施例5元素分析和定量分析确定Apo-2L的金属含量采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)进行Apo-2L的元素分析。为此，使用配制在20mMTris,pH7.5中的2mg/mLApo-2L溶液(按照W097/25428公开的方法在大肠杆菌中生产的114-281位残基；按照在此所述方法在发酵或纯化过程中不加入额外量的二l介金属离子)。确定样品和制剂緩冲液的一部分中Cd，Co,Zn，Ni,Cu的含量。表n样品CdCoZnNiCu緩冲液-0.058-0.090-o細-0.098-0.082Apo-2L-0.0580.1991.712-0.108-0.075与Apo-2L结合的金属是Zn和Co(表11)。理论摩尔比为每摩尔Apo-2L三聚体0.79摩尔Zn和每摩尔Apo-2L三聚体0.06摩尔Co。这些数据表明每个Apo-2L三聚体有一个锌结合位点。此Apo-2L制品中85%的所述位点被金属占据。实施例6使用螯合剂从Apo-2L除去结合锌所造成的影响用螯合剂处理Apo-2L(114-281位)样品除去结合锌。样品首先对1000倍体积的50mMEDTA透析，换液2次，然后对1000倍体积的2mM1,10-菲罗啉透析，换液2次，最后对1000倍体积的无金属的20mMTrispH7.5透析。在样品进行螯合处理之前和之后检测其受体结合，金属含量和凋亡活性。受体结合按照实施例3所述测定，金属含量用ICP-AES测定，凋亡活性按照实施例4所述测定。ICP-AES显示，透析步骤除去了结合锌。此处理后，受体亲和力显著减少(表I)并且凋亡活性降低90倍(图4)。在AVIV仪(Lakewood，NJ)202型分光偏振仪上记录圓二色语(circulardichroicspectra)。光镨从250nm扫描到200nm,其中步长0.5nm,平均时间5秒，长方形石英比色皿光路长度lcm。含PBS的溶液中蛋白浓度为2pM。如图6所示，Apo-2L(114-281位)发出具有高含量P-折叠的蛋白的典型CD光镨。结合锌的去除导致二色峰的强度降低，这表明P-折叠的含量减少了。圆二色性用于监测锌的去除对Apo-2L(114-281位)热稳定性的影响。这些实验也采用lcm长方形石英比色皿和2jiM的蛋白浓度。当样品从30。C加热到100。C时监测225nm处圓二色性。每增长2。C,後_样品在该温度下平衡1分钟后测定一次。记录椭圆率(CD)和倍增电极电压，随倍增电极电压的温度依赖性在图7中绘出。倍增电极电压正比于样品吸收度。通过加热样品导致的倍增电极电压的增长反应出蛋白的聚集。倍增电极电压的增长伴随着225nm处椭圆率的减少指示的二极结构的丧失。这些数据表明Apo-2L(114-281位)通过热变性聚集，此转化的中点(Tm)在约75。C处。结合阵的去除导致热变性的Tm大大降低到约54°C。这些数据表明结合锌是维持Apo-2L同型三聚体的结构和稳定性必需的。实施例7通过突变去除Apo-2L的锌结合位点所造成的影响如实施例1所述通过寡核苷酸定点诱变将Apo-2L(91-281位)的Cys230用Ala或Ser取代。然后按照实施例1所述使该变体蛋白表达并纯化。如表1所示，Apo-2L(91-281位)的C230A和C230S突变体的受体结合亲和力减小，凋亡活性大大降低。由于Apo-2L的x-射线结构表明Cys230是一个被掩盖的残基，不太可能在复合体形成中直接接触受体，这些数据提示Cys230的突变通过改变Apo-2L同型三聚体的结构或稳定性而间接影响其活性。实施例8添加Zn改进了可溶性Apo-2L产物的积累和回收A.受碱性磷酸酶启动子调控的Apo-2U114-281位残基〗表达pAPApo2-P2RU(参见图12)编码Apo-2L(114-281位残基)以及由pra2和编码的tRNA的共表达。基于pBR322的质粒(Sutcliffe,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.，43:77-90(1978))pAPApo2-P2RU用于在大肠杆菌中生产Apo-2L。Apo-2L表达所需的转录和翻译序列由石威性磷酸酶启动子和所述^rpShine-Dalgarno提供，如对质粒phGHl所述(Chang等，基因，55:189-196(1987))。ApoJL(114-281位残基)的编码序列位于启动子和Shine-Dalgarno序列的下游，它前面有起始蛋氨酸。该编码序列包含编码Apo-2L(图l)中114-281位残基的核苷酸(见图1),但其中编码Pro119残基的密码子已由"CCT，，变为"CCG，，，从而能消除潜在的二级结构。编码从入到转录终止子的序列(Scholtissek等，核酸研究，15:3185(1987》接在Apo-2L编码序列之后。此质粒还包括用于表达pra2(Komine等，分子生物学杂志，212:579-598(19卯))和argL%/"ay(Garcia等，细胞，45:453-459(1986))的tRNA的序列。这些基因可从大肠杆菌w3110通过PCR克隆并置于所述从A到转录终止子的序列的下游。此质粒赋予生产宿主以四环素抗性和氨千青霉素抗性。菌抹43E7(大肠杆菌W3110fhuA(tonA)p/2a4zlf^gF-Zac^frJAg尸ihawSom;r//vGM")用作共表达Apo-2L和tRNA的生产宿主。采用标准方法制备43E7感受态细胞并用pAPApo2-P2RU转化。从含20|ng/ml四环素的LB板(LB+Tet20)上挑出转化体，划线纯化，在含20pg/ml四环素的LB肉汤中，在30°C的摇床/培养箱中生长，然后-8(TC下保藏在DMSO中。将新鲜解冻的培养原液d、瓶接种在无菌培养基上，制备摇瓶接种物。培养基中包含相应抗生素，以便提供选择性压力来确保质粒的维持。摇瓶培养基组成见表III。使瓶中培养物在约30。C(28。C-32。C)振荡培养14-18小时。然后用该培养物接种生产发酵罐。接种量为培养基起始体积的0.1%-10%。表m摇瓶培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>采用表IV中给出的生产培养基进行Apo-2L的生产。在约30°C(28°C-32。C)下进行发酵过程，pH控制在约7.0(6.5-7.5)。设置通气速率和搅拌速度使得培养基中通有足够的氧。在磷酸盐耗场所诱发的产物表达开始时，工艺温度从30。C变为25°C。在整个发酵过程中，根据计算机的运算向细胞培养物中补加葡萄糖以便在保证通气条件的同时满足对碳源的需求。在发酵过程中分两批添加ZnS04。一批恰好在诱导产物表达之前加入。第二批约在生产期中点加入。在此实施例中，所述添加发生在培养物的光学密度OD浏约为80-120和接种后约28小时时。加入足够量的100mMZnSO4以使每批加入金属离子的浓度为约50-1OOiimol(终浓度)。发酵可以进行约34-45小时，然后从培养液中回收细胞团用于随后的产物回收分析。表IVAP启动子表达系统的生产培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a这些成分的一部分可在发酵过程中补加至培养物中。可才艮据需要添加氨水以控制pH。在发酵的不同时间对培养液取样。将1ml培养液样品稀释到细胞密度为20OD55()，离心收集细胞，所得细胞沉淀于-20。C保存以备分析。将细胞沉淀解冻并重悬在0.5ml提取緩沖液(50mMHEPES,pH8.0，50mMEDTA和0.2mg/ml鸡蛋白溶菌酶)中，通过机械破碎从细胞质中释放产物。离心去除细胞裂解液中的固体，然后将澄清的裂解液上样至DionexProPacIEXHPLC柱以便定量三聚体。HPLC分析通过以25mM磷酸緩冲液(pH7.5)中1MNaCl的5。/。-22。/。梯度按0.5ml/min的流速洗脱25分钟，而将产物与大肠杆菌杂质蛋白分开。使冻存的细胞团解冻并重悬在提取緩沖液(100mMHepes緩沖液，pH8.0,50mMEDTA,5mMDTT)中。使该细胞悬液多次通过才;i^成匀浆器而从胞质空间释放出Apo-2L产物，添加0.2%PEI(终浓度)并离心除去固体。用HP将澄清的裂解液1:l稀释，pH调为7.2，然后上样至已用3-4倍柱体积的50mMHepes/0.05%TritonAmMDTTpH7.2预平衡的MPHS柱(BioRad)。用2-3倍柱体积的平衡缓冲液洗一次，再用含0.1MNaCl的平衡緩沖液洗第二次，然后用平衡緩沖液中0.1M-0.8M的NaCl梯度以6倍柱体积将Apo-2L蛋白从MPHS柱上洗脱。收集洗脱级分，分析，汇集有关级分并保存在4-8°C。对发酵过程中Apo-2L积累的分析表明，ZnS04的加入不会显著影响细胞生长。培养液中磷酸盐耗竭时Apo-2L开始产生，这一^:在接种的约15-25小时后。图8显示了可溶性Apo-2L三聚体的积累经IEXHPLC方法测得的时间变化图谱。添加了ZnS04的培养液与无ZnSCXt的对照培养液相比，其细胞裂解液样品中产物浓度较高。对最初捕获步骤(涉及IEX层析)(图9)中产物回收的分析显示了，在添加或不添加ZnS04的发酵条件下所得细胞裂解液经MPHS层析的洗脱图谦。在最初的过柱和洗柱步骤后，分出了A和B两个主要峰。通过SDS-PAGE分析，这两个峰主要由Apo-2L组成。从这两个峰制备纯化物质并分析其生物活性和稳定性。研究结果表明，峰A汇集的Apo-2L产物更为稳定，峰B的产物时间长了会凝聚。为使不稳定性最小，不再对峰B的产物进行回收。通过对每个峰以下代表积分面积的轮廓的计量来估计峰A对峰B的比例。表V所列结果显示，当峰A从无ZnS04的情况下平均约为45%到添加ZnS04的情况下达到约80%时Apo-2L的百分比变化，即在可回收的集合中Apo-2L产量显著提高。表V<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>B.trp启动子调控的Apo-2U氨基酸残基114-280表达PS1346.Apo2L.0质粒的构建:将编码Apo-2L中114-281位残基的DNA(前面有一个起始蛋氨酸密码子)插入到pS1346质粒载体。pS1346质粒衍生自pHGH207-l(DeBoer等，启动子结构和功能，Praeger,纽约，pp.462國481(1982))并且在Apo-2L编码序列的下游含有从入到转录终止子(lambda-totranscriptionalterminator)的序列(Scholtissek等，核酸研究，15:3185(1987))。采用菌抹54C2(大肠杆菌W3110fhuA(tonA)/o"^0/^s(72炉i^)c/;尸/flc/g)作为表达Apo-2L(氨基酸残基114-281)的生产宿主，其中该配体的表达受trp启动子调控。采用标准方法制备54C2的感受态细胞并用pS1346.Apo2L.0转化。从含20吗/ml四环素的LB平板(LB+Tet20)挑出转化体，划线纯化，在30。C的摇床/培养箱中含20pg/ml四环素的LB培养基上生长，然后-8(TC下保藏在DMSO中。用生产菌抹54C2/pS1346.Apo2L.O在类似于上述AP启动子表达系统的发酵参数下进行实验，不同在于培养基组成略有调整(表VI)、添加诱导物吲哚3-丙烯酸(IAA)、和工艺的耗时不同。在最初的培养基中加入色氨酸以便在生长的最初阶段抑制启动子的活性。当培养液的细胞密度达到约30OD柳时使温度从3(TC变为25°C。当培养液的细胞密度达到约55OD55。时加入诱导物。在添加了ZnS04的实验中，于细胞密度达25ODss。和接种后24小时时添加ZnS04至终浓度约50-100|iM。在添加i秀导物的6小时后收获细胞并保存在-20。C到-80°C。表VI在AP启动子表达系统的生产培养基中应trp启动子表达系统的需要进行的添加<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>trp启动子系统的细胞达到40-60OD^后生长放緩。在添加IAA进行诱导之前有显著的Apo-2配体渗漏表达，这可能导致细胞生长出现问题。对添加或不添加ZnS04的情况下的细胞生长图i普进行比较。图10显示了可溶性Apo-2L三聚体的积累经IEXHPLC方法测得的时间变化图镨。在添加了ZnS04的试验中，可溶性Apo-2L的积累持续增加，并在细胞裂解物样品中获得较高产物浓度。C.采用二价金属离子/DTT从大肠杆菌中回收和纯化Apo-2U氨基酸残基114-281)可采用下列方法,人大肠杆菌中回收和纯化Apo-2L。首先，如下进行细胞的匀浆和提取。将冷冻收获的大肠杆菌细胞悬浮在6倍体积的提取液中(100mMHEPES/5mMDTT(或5mMZnS04而不是DTT)，pH8.0)，或将整个细胞培养液用5mMDTT(或5mMZnS04而不是DTT),pH8.0调整。悬浮液2-8。C下充分混合1小时，然后在匀浆器(Gaulincorporation,Everett,MA)中匀浆。破碎细胞的悬浮液在0.2%PEI中絮凝l-2小时，用BTPX205(AlfaLavalSeparationAB,瑞典)连续加料离心机离心，深层过滤澄清。提取fe,如下纯化Apo-2L。澄清的细胞悬浮液(提取液)用等体积H20/0.1%Triton-100调理，使pH达到7.2，然后进行Macro-PrepceramicHighS(MP-HS)层析。将调整好的提取液上柱至已用50mMHEPES/0.05%Triton-100/lmMDTT(或100)imZnS04)，pH7.2平衡的MP-HS阳离子交换柱(Bio-Rad,Hercules,CA)(前两个步骤可用SP-SepharoseFastFlow(AmershamPharmacia,瑞典)代替)。未结合的蛋白流过层析柱，被平衡緩冲液洗出，直至达到A280的基线水平。用3倍柱体积的0.1MNaCl/平衡緩沖液洗柱。用8倍体积的平衡緩沖液中0.1-0.8M的NaCl线性梯度洗脱Apo-2L。收集级分，并将那些经SDS-PAGE或SEC-HPLC测定含有正确4斤叠的Apo-2L的级分汇集在一起。将从MP-HS柱汇集的Apo-2L上样至已在50mMHEPES/lmMDTT(或100jnmZnS04),pH7.2中平衡的Macro-Prep羟基磷灰石层析柱(Bio-Rad，Hercules,CA)(可用SP-S印haroseFastFlow代替Macro画Prep羟基石粦灰石层析柱)。上样后，用平衡緩冲液洗柱以达到A280的基线水平。用平衡緩冲液中0.15M磷酸钠的等梯度从层析柱中洗脱Apo-2L。MP-HA汇集液用等体积的1.0M硫酸铵/50mMTris/lmMDTT(或lOOnM碌u酸锌)，pH7.5配制，上样至已在0.5M硫酸铵/50mMTris/lmMDTT(或lOOiuM碌u酸锌)，pH7.5中平衡的Phenyl誦SepharoseFF(AmershamPharmacia,瑞典)(可使用0.6M石克酸钠代替0.5M辟u酸铵)。用平衡緩冲液洗柱，从洗脱液中收集Apo-2L。然后通过超滤和G25凝胶过滤(AmershamPharmacia,瑞典)层析来配制Apo-2L。将来自phenyl-Sepharose的汇集液用TFF超滤膜(Millipore,Bedford,MA)浓缩，并在G25凝胶过滤柱上用20mMTris/8%海藻糖，pH7.5配制。(或者，所述物质可通过渗滤配制)。通过SDS-PAGE，SEC-HPLC和氨基酸序列分析确定Apo-2L的最终纯度。实施例9添加氯化钴改善了可溶性Apo-2配体的产物积累和回收碱性磷酸酶启动子调控的Apo-2L(氨基酸残基114-281)表达采用与实施例8中所用相同的生产菌林，培养基组成，发酵条件和样品分析来研究添加非锌的金属离子，即氯化钴，对Apo-2L(氨基酸残基114-281)产物积累的影响。用lOOmMCoCl2水溶液替代100mMZnS04，添加足够量使两次添加的终浓度达到50-100|uM。图11显示了添加CoCl2对发酵过程中可溶性Apo-2L产物积累的好处。如ZnS04添加实验一样，用IEXHPLC分析方法检测到了可溶性Apo-2L产物的较高积累率，但显著程度不及。此数据说明，添加某些金属离子通常可改进可溶性Apo-2L的积累，还可使已装配好的Apo-2L三聚体保持稳定。实施例10各种金属离子对Apo-2L制剂的影响进行体外试验，即将SO^ilApoJL(114-281位)与5mM金属盐(见表VII;金属对蛋白的摩尔比为100:l)在20mMTris,8%海藻糖，0.01%Tween20，pH7.5的制剂中5。C保温24小时。然后用实施例4所述SK-MES试-睑评价样品的凋亡活性。EC50(或导致细胞50%死亡的Apo-2L浓度)见表VII(单位ng/ml)。如表VII所示，向培养液中添加乙酸锌和碌b酸锌可增强Apo-2L活性。表VII所添加的金属生物试-验中的EC50对照19.0±1.9(n=3)醋酸锰19.8氯化锰19.9醋酸铁32.5醋酸钴25.9氯化钴17.9硫酸钴16.7醋酸镍18.7醋酸铜844氯化铜984硫酸铜774醋酸银20醋酸锌12.3氯化锌17.2硫酸锌(100:1)9.3±1.2(n=3;>(10:1)10,0±0(n=2)(1:1)11.5±0.7(n=2)实施例11锌离子对Apo-2配体制剂稳定性的影响如实施例8B所述，纯化步骤中第一步使用MPHS阳离子交换柱产生两个峰，A和B。为检查这两个峰的保存稳定性，将Apo-2L(114-281位)从大肠杆菌表达产物(采用带有trp启动子的pS1346.ApoL.0质粒)中提取，并通过MPHS阳离子交换柱纯化。MPHS峰A进一步通过MP-羟基磷灰石和Phenyl-SepharoseFF纯化，然后用G-25凝胶过滤柱配制。MPHS峰B通过MP-羟基磷灰石、Phenyl-SepharoseFF、和Ni-NTASuperflow纯化，然后在G-25凝胶过滤柱上用20mMTris,8%海藻糖，0.01%Tween20，pH7.5配制。将样品无菌灌入3cc玻璃小瓶中，并用聚四氟乙烯(Teflon)涂布的greybutyl塞子密封。纯化并配制好的峰A和峰B的保存稳定性在表VIII所列的时间(周("wk")或月("mo"))和温度(。C)下评价。表vm<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表VIII显示了单体的百分比(。/。M)和二聚体的百分比(y。D);"ND"指未测的数值。在第0天时，峰A所含二聚体和其它杂质比峰B略少。如表VIII所示，峰B更为热不稳定，因为在30。C的沉淀更多(比在2个月的时间点多约40%)。即使在5。C,峰B形成二聚体的倾向性约为峰A的2倍。对峰A和B的生物分析指示这两种物质除了稳定性不同，其它生物化学特性相同。据认为峰B稳定性较低可能与不当的(三聚体)装配或较低的锌含量有关(峰A中锌对蛋白的摩尔比为0.83,峰B的为0.7)。序列表<110>杰南才支术7>司(Genentech，Inc.)<120〉利用二价金属离子制备Apo-2配体的方法<130>P1761R1PCT<140〉PCT/US00/17579<141>2000-06-26<150>US60/141'342<151〉1999-06-28<160>7<210>1<211〉281<212〉PRT<213〉人(Homosapiens)<400〉1MetAlaMetMetGluValGinGlyGlyPro10SerLeuGlyGinThr15CysValLeulieVal20liePheThrValLeu25LeuGinSerLeuCys30ValAlaValThrTyr35ValTyrPheThrAsn40GluLeuLysGinMet45GinAspILysTyrSer50LysSerGlylieAla55CysPheLeuLysGlu60AspAspSerTyrTrp65AspProAsnAspGlu70GluSerMetAsnSer75ProCysTrpGinVal80LysTrpGinLeuArg85GinLeuValArgLys90MetlieLeuArgThr95SerGluGluThrlie100SerThrValGinGlu105LysGinGinAsnlie110SerProlxuValArg115GluArgGlyProGin120iVrgValAlaAlaHis125lieThrGlyThrArg130GlyArgSerAsnThr135LeuSerSerProAsn140SerLysAsnGluLys145AlaLeuGlyArgLys150lieAsnSerTrpGlu155SerSerArgSerGly160HisSerPheLeuSer165AsnLeuHisLeuArg170AsnGlyGluLeuVal175lieHisGluLysGly180PheTyrTyrlieTyr185SerGinThrTyrPhe190ArgPheGinGluGlu195lieLysGluAsnThr200LysAsnAspLysGin205MetValGinTyrlie210TyrLysTyrThrSerTyrProAspProlieLeu215220AlaArgAsnSerCysTrpSerLysAspAlaGlu230235SerlieTyrGinGlyGlyliePheGluLeuLys245250liePheValSerValThrAsnGluHisLeulie260265GluAlaSerPhePheGlyAlaPheLeuValGly275<210〉2<211〉1042<212〉腿<213〉人(Homosapiens)<220><221〉变异<222〉447<223〉N可以是T或G280<400>2UtcctcactctgcctggcttggaggtccaatcttcacagctttaccaacttgcttgUtgagagUtgacgtUgaaagaagaaaagcaagagtagcagttctccaaacgggaatcatc汪"ggtgaacaacatactttaacaaatggtttgttg"gatggactctatacagaattUgactataaaagaaUgagaagactUcagcagtcagactcggggggacccagcctgggactgctcctgcagtctctctgtgagctgaagc柳tgcaggacttaaaagaagatgacagttacagcccctgctggc^gtcatgattttgagaacctctgaacaaaatatttctcccctagctcacataactgggaccagatccaaga"gaaaaggctctaaggagtgggcattcattcctggtcatccatgaaa,ggcgatttcaggaggaaaUaaccaatatatttacaaatacaaaagtgctagaaatagttgttcc"cUtcaagggggaattgUtctgtaacaaatgagcggaagggctttgacaggatcagacctgcgtgtggctgtaacaagUctcc"tgggacccaagtggcaacggaaaccattgg^gaagcagggccgc謹tgagcaacttttttactacaagaaaacacacaagttatcctggtct謹gatttgagcttacUgatagaLeuMetLysSer225TyrGlyLeuTyr240GluAsnAspArg255AspMetAspHis270cagtgaccgg50atggcUtga100gctgatcgtg150ctUcgtgta200aaaagtggca250caatgacgaa300tccgtcagct350tcUcagttc400aggtccncag450acacattgtc500ataaactcct550gcacttgagg600tct汪Uccca650aagaacgaca700tgaccctata750atgcagaata800aaggaaaatg850catggaccat900gaagccagttUUcggggcctttUagttggctaactgacctggaaaga950aaaagcaataacctcaaagtgactattcagttttcaggatgatacactat1000gaagatgtUcaaaaaatctgaccaaaacaaacaaacagaaa1042<210>3<211>144<212>PRT<213〉人(Homosapiens)<400>3LysProAlaAlaHisLeulieGlyAspProSerLysGinAsnSer151015LeuLeuTrpArgAlaAsnThrAspArgAlaPheLeuGinAspGly202530PheSerLeuSerAsnAsnSerLeuLeuValProThrSerGlylie354045TyrPheValTyrSerGinValValPheSerGlyLysAlaTyrSer505560ProLysAlaThrSerSerProUuTyrLeuAlaHisGluValGin657075LeuPheSerSerGinTyrProPheHisValProLeuLeuSerSer808590GinLysMetValTyrProGlyLeuGinGluProTrpLeuHisSer95100105MetTyrHisGlyAlaAlaPheGinLeuThrGinGlyAspGinLeu110115120SerThrHisThrAspGlylieProHisLeuValLeuSerProSer125130135ThrValPhePheGlyAlaPheAlaLeu140<210>4<211〉147<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>4LysProValAlaHisValValAlaAsnProGinAlaGluGlyGin151015LeuGinTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly202530ValGluLeuArgAspAsnGinLeuValValProSerGluGlyLeu354045TyrLeulieTyrSerGinValLeuPheLysGlyGinGlyCysPro505560SerThrHisValLeuLeuThrHisThrlieSerArglieAlaVal657075SerTyrGinThrLys80ValAsnLeuLeuSer85CysGinArgGluThr95ProGluGlyAlaGlu100GluProlieTyrLeu110GlyGlyValPheGin115ArgLeuSerAlaGlu125lieAsnArgProAsp130GluSerGlyGinVal140TyrPheGlylielie145<210>5<211〉141<212〉PRT<213>人(Homosapiens)<400>5GinlieAlaAla1HisVallieSerGluAla10SerValLeuGinTrp20AlaGluLysGlyTyr25AsnLeuValThrLeu35GluAsnGlyLysGin40GinGlyLeuTyrTyr50lieTyrAlaGinVal55ArgGluAlaSerSer65GinAlaProPhelie70LysSerProGlyArg80PheGluArglieLeu85ThrHisSerSerAla95LysProCysGlyGin100GlyGlyValPheGlu110LeuGinProGlyAla115ValThrAspProSer125GinValSerHisGly130PheGlyLeuLeuLys140Leu<210>6<211>137<212〉PRT<213>人(Homosapiens)<400〉6ArgLysValAla1His5LeuThrGlyLysSer10ProLeuGluTrpGluAsp20ThrTyrGlylie25AlalieLysSerPro90AlaI>ysProTrpTyr105LeuGluLysGlyAsp120TyrLeuAspPheAla135AlaLeuSerTyrLeuThrAlaLeuGinSerThrSerLysThrThr15ThrMetSerAsn30ThrValLysArg45PheCysSerAsn60SerLeuCysLeu75ArgAlaAlaAsn90SerlieHisLeu105ValPheValAsn120GlyPheThrSer135AsnValSerArgSerMet15LeuLeuSerGly30ValLysTyrTyrPheValAsnLeuProProGinAspThrThrGlyPheAsnLeuLeuSerLeuTyrLysLysTyrLeuLeuGinThrValLys35Ser50Ser65Val80Met95Ser110Asn125GlyGlyLeuValLysValTyrPheHisLysValTyrMetMetGluGlyTrpAlaArgSerAlaAspHisLeuPheGluGluSer<210>7<211>152<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400〉7GinPro1GlySerTrpAlaValAsnArgHisLeuMetHisThrPheAlaHisLysGinHisValLeuLyslieAspGluTyrMetSerGluPheHisLeuArgLeuLeuValArgSerAspGlyProHis5Val20Ser35Gly50Thr65Val80Lys95Phe110Glu125Asp140lie40Arg55Met70Lys85Ser100Tyr115Gin130IxuThrlieAsnSerLeuSerSerAsnMetThrPhePheTyrTyrLeuSerGlyAspLeuThrLysThrSerGlyGlySerThrTyrSerlieAsnGlulieSerlieGinAspAlaThrAsnGlyArgMetTyrValThrAla10Trp25Ser40Tyr55Ala70lie85Lys100Val115Glu130Tyr145ThrTyrAsnAlaThrLysTyrGlyValPheGluThrGlyGinSerCysAsnSerLysMetSerTyrLeuGlyAlaAsnValSerPhePheGlyLeu45Asn60Tyr75Cys90Val105Glu120Leu13AsplieProHisAspArgGlyLysLeuAsnlieCysGluTyrLeulieProSerTrpSerGlyGlyPhePheSerAsnProGlyAlaPheSer15Gly30lie45Phe60Gin75Ser90Asn105Lys120Ser135Lys150权利要求1.分离的Apo-2配体变体多肽，包含与天然序列Apo-2配体不同且在图1(SEQIDNO1)的残基位置具有如下一或多个氨基酸取代的氨基酸序列R130A；N134A；L136A；S138A；N140A；N143A；S153A；E155A；R158A；R170A；K179A；R191A；Q193A；E195A；K197D；K201A；N202A；D203A；Y213A；D218A；Y240A；K251A；S259A；D267A；D269A。2.分离的Apo-2配体变体多肽，包含与天然序列Apo-2配体不同且在图l(SEQIDNO:l)的残基位置具有如下一或多个氨基酸取代的氨基酸序列S141A,K142A,S159A，H264A。3.分离的Apo-2配体变体多肽，包含与天然序列Apo-2配体不同且在图l(SEQIDNO:l)的残基位置具有如下一或多个氨基酸取代的氨基酸序列R149A;C230S;C230A;Q205A;V207A;Y216A;E236A;Y237A。4.分离的核苷酸，包含编码权利要求1的Apo-2配体变体的核苷酸序列。5.载体，包含权利要求4的核酸。6.宿主细胞，包含权利要求5的载体。7.pAPApo2-P2RU载体。8.宿主细胞，包含权利要求7的载体。9.制品或试剂盒，在容器中包含具有一或多种二Y介金属离子的Apo-2配体制剂，容器上有标记指示该制剂的用途。全文摘要本发明提供了使用二价金属离子制备Apo-2配体和Apo-2配体的制剂的方法。这类二价金属离子包括锌和钴，它们改进了Apo-2配体的三聚体形成和稳定性。还提供了Apo-2配体的晶体结构，以及采用寡核苷酸定向诱变鉴定的Apo-2配体变体多肽。文档编号C12R1/19GK101633692SQ200910145880公开日2010年1月27日申请日期2000年6月26日优先权日1999年6月28日发明者伊菲吉妮亚·库米尼斯,劳拉·西蒙斯,扎拉·沙罗克,罗伯特·F·凯利,罗杰·佩,苏珊·勒恩格,萨拉·希莫威茨,阿维·J·阿什克纳兹,马克·奥康奈尔申请人:杰南技术公司