专利名称：微生物发酵法猪血清蛋白抗氧化肽的方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种天然食品抗氧化剂的制备方法，尤其涉及一种采用微生物发酵 法制备具有抗氧化活性的猪血清蛋白多肽的方法以及由该方法制备得到的产品，属 于抗氧化多肽制品领域。
背景技术：
动物血液是屠宰加工的主要副产物，蛋白质含量约为18°/ 左右，但是在我国血 液的利用率却很低，因此造成蛋白资源的巨大的浪费并且随之带来较大的环境压 力。目前，利用不同蛋白资源开发功能多肽已经成为研究的热点。
猪血清蛋白具有良好的抗氧化作用，它保护生命的正常运行。血清蛋白是血液 循环中主要的抗氧化剂，根据文献报道，血清蛋白可以保护培养的细胞使其免受氧 自由基的伤害；血清蛋白能抑制铁离子催化的脂质氧化；体内试验研究则表明，血 清蛋白具有保护人的低密度脂蛋白(LDL)使其免受氧化和防止红细胞的溶血作用。
现有的猪血清蛋白抗氧化肽的制备方法在发酵过程中，由于微生物代谢，可产 生一系列的腥味或者腥臭味，影响了猪血清蛋白抗氧化肽的感官评定指标，因此需 要对发酵液进行脱腥脱臭处理，以增加其利用的价值和范围。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种猪血清蛋白抗氧化肽的制备 方法，该制备方法所得到的猪血清蛋白多肽在体外和体内均具有优异的抗氧化活 性；
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的
一种采用微生物发酵法制备猪血清蛋白抗氧化肽的方法，包括以下步骤
(1) 将猪血清蛋白进行微滤处理；
(2) 将微滤处理后的猪血清蛋白接种枯草芽孢杆菌菌悬液，发酵；
(3) 将发酵液经离心，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得；步骤(1 )中所述的猪血清蛋白的浓度优选为2-6% (w/w),更优选为4% (w/w); 步骤(1 )中所述的微滤处理优选为将猪血清蛋白经过0. 45 ja m的微孔率膜 过滤杀菌；
步骤(2)中所接种的枯草芽孢杆菌的接种量为1-5% (W/W),优选为4%。 枯草芽孢杆菌是一种常见的、以周生鞭毛运动的革兰氏阳性芽孢杆菌。细胞染 色均匀，很少成链。芽孢椭圆形。菌落圆形或不规则形；表面色暗，有皱褶状，不 透明。在液体培养基中不混浊或轻度混浊，表面有呈暗色、带皱褶的菌膜飘浮。具 有较强的蛋白酶活力，主要应用于蛋白质的分解，提高蛋白利用率，以及提高多肽 的含量。枯草芽孢杆菌可以通过商业途径购买得到，例如，可以购自于中国工业微 生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC10063;
步骤(2)中所述的发酵优选在以下条件下进行发酵温度为30 - 37°C,发酵 时间为24-84小时；更优选的，所述的发酵在以下条件进行发酵温度为3(TC,发 酵时间为72小时。
其中，步骤(3)中为了达到更好的分离效果，优选的，将浓缩后的发酵液采 用超滤设备进行膜分离；更优选，将浓缩后的发酵液依次通过分子量为3000Da, 6000Da和10000Da的平^反膜，可获得抗氧化活性最强的分子量在3000Da以下的肽 段，该肽段具有高的抗氧化活性和清除自由基的能力。
本发明方法所制备得到猪血清蛋白多肽主要由分子量在3000Da以下的混合猪 血清蛋白多肽组成，具有较高的抗氧化活性和清除自由基的能力，在体外和体内均 有良好的抗氧化作用以及护肝作用，可以作为抗氧化保健产品。
动物试验结果表明，本发明所制备的猪血清蛋白多肽能够显著降低CCl4诱导肝 损伤大鼠血清中的谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)水平(P < O.Ql),从生理角 度考虑对大鼠的肝脏具有很好的保护作用，对健康是有益的；而且猪血清蛋白多肽 可提高大鼠肝脏组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、 过氧化氢酶(CAT)活力(P < 0.01)，提高肝脏组织的总抗氧化能力(T-AOC) (P < 0.01)，并且降低肝脏组织中的丙二醛(MDA)含量(P < 0. 01);并且可以在一定程度 上保护肝组织结构，减轻CCl4对肝脏的损伤。说明本发明所制备的猪血清蛋白多肽 具有抗脂质氧化和清除自由基的能力，以及良好的护肝作用。
本发明猪血清蛋白多肽可以按照口服制剂的常规方法制备成胶嚢剂、颗粒剂、 片剂或散剂等各种口服制剂，优选为胶嚢剂。
本发明制备方法操作简单，与合成抗氧化剂相比安全可靠，适合工业化生产，能够大幅度提高猪血蛋白资源的利用率，提高猪血综合利用的水平，以提高猪血资 源的附加值。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验材料
枯草芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；菌种编号 CICC10063;购买后将菌粉在培养基中连续活化传代3次。
实施例1
将浓度为6% (w/w)的猪血清蛋白经过0. 45 jum的微孔率膜过滤杀菌后接种4% (w/w)的枯草芽孢杆菌(菌种编号为CICC10063,中国工业微生物菌种保藏管理中 心)菌悬液，3(TC摇床发酵72小时得到发酵液；将发酵液经离心，取上清液，浓 缩，冷冻干燥，即得。
经检测，本实施例所制备得到猪血清蛋白多肽主要由分子量在500-65000Da之 间的混合猪血清蛋白多肽组成。
实施例2
将浓度为2% (w/w)的猪血清蛋白经过0. 45 iam的微孔率膜过滤杀菌后接种1% (w/w)的枯草芽孢杆菌(菌种编号为CICC10063,中国工业樣史生物菌种保藏管理中 心)菌悬液，37。C摇床发酵24小时得到发酵液；将发酵液经离心，取上清液，浓 缩，冷冻干燥，即得。
经检测，本实施例所制备得到猪血清蛋白多肽主要由分子量在500-65000Da之 间的混合猪血清蛋白多肽组成。
实施例3
将浓度为4% (w/w)的猪血清蛋白经过0. 45 ym的微孔率膜过滤杀菌后接种5(w/w)的枯草芽孢杆菌(菌种编号为CICC10063,中国工业4敖生物菌种保藏管理中 心)菌悬液，3(TC摇床发酵72小时得到发酵液；将发酵液经离心，取上清液，浓 缩，冷冻干燥，即得。
经检测，本实施例所制备得到猪血清蛋白多肽主要由分子量在500-65000Da之 间的混合猪血清蛋白多肽组成。
实施例4
将浓度为4% (w/w)的猪血清蛋白经过0. 45 jam的微孔率膜过滤杀菌后接种4% (w/w)的枯草芽孢杆菌(菌种编号为CICC10063,中国工业微生物菌种保藏管理中 心)菌悬液，30。C摇床发酵72小时得到发酵液；将发酵液离心，取上清液，浓缩； 将浓缩液依次通过分子量为3000Da, 6000Da和10000Da的平寿反膜后，即得。
经检测，本实施例所制备得到猪血清蛋白多肽主要由分子量在3000Da以下的 混合猪血清蛋白多肽组成。
试验例1 本发明猪血清蛋白多肽的体外抗氧化活性试验
1、 供试样品实施例1-3所制备的猪血清蛋白多肽；
2、 试—验方法及结果
体外抗氧化活性在卵磷脂脂质氧化体系(简称Lipsome氧化体系)中进行， Lipsome氧化体系配制方法为称取0. 895g氯化钾，0. 078g组氨酸，加水稀释到 100mL,调其pH值到6. 8,再取纯度20%的大豆卵磷脂lg溶于氯化钾-组氨酸缓冲 溶液中，制成2mg/mL的脂质体。进行抗氧化试验时，取稀释10倍的脂质体5mL， 加入样品1 mL,以及加入0. 1 mL 50mM FeCl3溶液和0. 1 mL lOmM抗坏血酸盐溶液， 37。C水浴lh，血清蛋白发酵液与未发酵的血清蛋白相比，其TBARS (流代巴比妥酸 值)下降35.14%,过氧化值(POV值)下降37. 26%;还原能力(FRAP值)提高2. 51倍， 对DPPH自由基(l, 1- 二苯代苦味酰基自由基)的清除率达到53. 85%,对羟基自由基 的清除率达到36. 67%;对铜离子螯合率达到46. 80%，对亚铁离子螯合率达到12. 35%。
试验例2 本发明猪血清蛋白多肽的抗氧化活性动物试验 1 、供试样品实施例4所制备的猪血清蛋白多肽； 2、试—验方法及结果 (1)、试验动物清洁级(SPF级)Wistar大鼠，雄性，购自维通利华试验动物公司(北京)，年 龄为3个月，体重为240-290g,试验地点在东北农业大学生命科学学院研究中心实 验动物房内。将大鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食和饮水。环境温度控制在 (23 ±2) 。C,湿度60%。
(2)、 CCl4诱导肝损伤大鼠模型的建立
将大鼠适应性祠养l周后建立模型，期间有淘汰，最终每组10只。随机分为6 组(I)正常对照组；(II) CCl4模型阴性对照组；(III) CC14模型+供试样品低剂 量组；(IV) CC14模型+供试样品中剂量组；(V) CC14模型+供试样品高剂量组； (VI) CC14才莫型+VE阳性对照组。其中I 、 II两组每日分别灌胃1 mL 0. 3% CMC-Na, III、 IV、 V和VI各组每日分别灌胃低中高剂量供试样品以及VE，剂量分别为50、 100、 200mg . kg-、乂及VE 50mg . kg-1。所有处理组均连续灌胃12天；在第13天时， 除了第I組以外，其他各组均皮下注射CCl, (0. 5 ml/kg)。 (3 )大鼠的处死以及血清和肝脏组织匀浆的制备
在注射CCl4后的24h之后，将大鼠处死。摘除眼球取血后，断颈处死，立即剖 去肝脏。取出的肝脏去除脂肪和筋膜后，与冷的生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称 重，记录。肝脏贮存于液氮中，待匀浆用。
大鼠血样于4'C冰箱放置12h,以3000r/min, 4°C,离心10min,取上清，即 为血清。液氮中取出大鼠肝脏组织，4'C解冻后，取O. 5g,置于5ml小烧杯中，量 取4. 5ml的生理盐水，将1/9的生理盐水倒入烧杯中，以眼科剪迅速剪碎组织块， 再将剪碎的组织连同生理盐水一起倒入玻璃匀浆器中，然后用剩余的生理盐水冲洗 烧杯和眼科剪，并倒入匀浆器，水浴匀浆，使组织匀浆化，勻浆完全后将匀浆液以 4000rpm离心10min,上清液即为10%组织浆液。 (4 )血清中ALT和AST水平的测定
大鼠血清中ALT和AST水平的测定分别采用ALT和AST试剂盒，采用全自动生 化分析仪进行测定。
(5 )肝脏组织中抗氧化酶系和丙二醛含量以及总抗氧化能力的测定 主要包括超氧化物岐化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),过氧化物酶 (CAT)和丙二醛(MDA)含量以及总抗氧化能力(T-AOC)的测定。 (a)超氧化物岐化酶(SOD)活力
SOD酶活测定采用氯化硝基氮蓝四唑光还原法(NBT法)(Beauchamp和 Fridovich, 1971),按照试剂盒操作说明进行测定。(b) 过氧化氢酶(CAT)活力
按照Carrillo等人(1991)的方法测定。样品于37。C水浴2min, 240nm处测定 5min内OD的变化，其变化和&02的变化成比例。
(c) 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)
GSH-Px用DTNB显色法测定(Paglia和Valentine, 1967; Hafemen, 1974)。 37。C水浴10min,加入HA使之浓度为lmM。 340nm处测定OD值。NADPH氧化的速度 表示GSH-Px活性。
(d) 丙二醛(MDA)含量的测定
用硫代巴比妥酸(TBARS)方法测定(Placer et al. ， 1966 )，于试管中加入10% 的小鼠肝组织匀浆液0. 20ml及不同浓度的样品0. 10ml,对照等加等体积生理盐水。 37。C温育1小时后取出，冰浴冷却，按MDA测定试剂盒中方法操作，由于MDA与硫 代巴比妥酸缩合形成的红色产物在532nm处有最大吸收，因此在该波长下测定吸光 度，计算其MDA含量，公式如下。其中匀浆液蛋白含量测定以牛血清白蛋白为标准， 采用Lowry法。另取两组试管， 一组先加入1 Ommol/L的H202ml ，另 一組先加入lmmol/L 的FeS040. lml,然后再按前述方法，向这两组试管加入组织匀浆和样品液，温育， 冷却，测定MDA含量。
(e) 肝脏组织总抗氧化能力(T-AOC)的测定
T-AOC的测定按照Benzie和Strain(1996)的测定方法。测定原理是肌体中的 抗氧化物质，能使Fe"还原成Fe2、后者可和菲琳类物质形成稳固的结合物，通过 闭塞测定其抗氧化能力的高低，具体操作和结果计算按照试剂盒操作说明进行。
动物试验结果表明，供试样品(猪血清蛋白多肽)能够显著降低CCl4诱导肝损伤 大鼠血清中的谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)水平(P < 0.01),从生理角度考 虑对大鼠的肝脏具有很好的保护作用，对健康是有益的；而且供试样品(猪血清蛋 白多肽)可提高大鼠肝脏组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活力(P < 0. 01),提高肝脏組织的总抗氧化能力(T-AOC) (P < 0.01),并且降低肝脏组织中的丙二醛(MDA)含量(P < 0.01);可以在一定程 度上保护肝组织结构，减轻CCl4对肝脏的损伤。说明本发明所制备的猪血清蛋白多 肽具有抗脂质氧化、清除自由基的能力和良好的护肝功效。
权利要求
1、一种猪血清蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤(1)将猪血清蛋白进行微滤处理；(2)微滤处理后的猪血清蛋白接种枯草芽孢杆菌菌悬液，发酵；(3)发酵液经离心，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得。
2、 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于按重量百分比计，步骤(l) 中所述的猪血清蛋白的浓度为2-6%,优选为4%。
3、 按照权利要求l所述的制备方法，其特征在于步骤(l)中所述的微滤处 理是将猪血清蛋白经过0. 45 mm的微孔滤膜过滤杀菌。
4、 按照权利要求l所述的制备方法，其特征在于按重量百分比计，步骤(2) 中接种的枯草芽孢杆菌的接种量为1-5%，优选为4%。
5、 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的发酵在 以下条件下进行发酵温度为30 - 37°C,发酵时间为24-84小时。
6、 按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的发酵在 以下条件下进行发酵温度为3(TC,发酵时间为72小时。
7、 按照权利要求l所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将浓缩后的发 酵液依次通过分子量为3000 Da, 6000 Da和10000 Da的平;f反膜，收集过滤液，冷 冻干燥，即得。
8、 按照权利要求1-6任何一项所述制备方法得到的猪血清蛋白抗氧化肽，其 特征在于所述猪血清蛋白多肽主要由分子量在500-65000 Da之间的混合猪血清 蛋白多肽组成。
9、 按照权利要求7所述制备方法得到的猪血清蛋白抗氧化肽，其特征在于 所述猪血清蛋白多肽主要由分子量在3000 Da以下的混合猪血清蛋白多肽组成。
10、 按照权利要求8所述的猪血清蛋白抗氧化肽，其特征在于按照口服制剂 的常规方法制备成胶嚢剂、颗粒剂、片剂或散剂。
全文摘要
本发明公开了一种微生物发酵法制备猪血清蛋白抗氧化肽的方法及其产品。其制备方法包括以下步骤(1)将猪血清蛋白进行微滤处理；(2)微滤处理后的猪血清蛋白接种枯草芽孢杆菌菌悬液，发酵；(3)发酵液经离心，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得。本发明制备方法所得到的猪血清蛋白多肽具有较高的抗氧化活性和清除自由基的能力，在体外和体内均有良好的抗氧化作用。本发明制备方法操作简单，与合成抗氧化剂的方法相比安全可靠，适合工业化生产，能够大幅度提高猪血蛋白资源的利用率，提高猪血综合利用的水平，有效提高猪血资源的附加值。
文档编号C12P21/06GK101608205SQ20091014824
公开日2009年12月23日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者刁新平, 骞 刘, 孔保华 申请人:东北农业大学