专利名称：一种丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)基因的分析及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药用植物基因工程领域，具体地说，涉及利用cDNA芯片技术克隆一种新的 丹参乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoAacyltryansferase， AACT)基因，转化该基因以提高丹参中 二萜类次生代谢产物含量的方法。
背景技术：
药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因的产物。随 着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成 相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将破解药用植物有效成分的生物 合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成 分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。
二萜类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，在药用植物中很多活性成分如紫杉醇、 丹参酮IIA、雷公藤甲、乙素等均为二萜类化合物。药用植物丹参Sa/w'am/Wwr/n'zaBge.为一 味常用中药，素有"一味丹参，功同四物"的美称，具有活血化瘀、理气止痛的功效，是众 多复方、保健品的主要成分。丹参主要含有两类活性成分脂溶性的二萜醌类化合物和水溶 性的酚酸类化合物。
萜类生物合成由甲羟戊酸途径(MVA)和丙酮酸途径(DXP)组成。MVA途径长期以 来都被认为是萜类化合物生物合成的惟一途径。它由ConradBloch和FeodorLynen于1958年 首先在动物和酵母中发现，主要存在于细胞质中，又可称为细胞质途径(cytosolicpathway)， 通过该途径形成了植物中的倍半萜、三萜和甾醇等。乙酰CoA酰基转移酶(AACT)催化MVA 途径上第一个酶促反应，使2个分子的乙酰CoA縮合为乙酰乙酰CoA。迄今为止，已从拟南芥 (Arabodipsisthaliana)、橡胶树(pararubbertree)、水稻(rice)和胡萝卜(radish)中克隆 并鉴定了AACT基因的全长cDNA。 AACT在不同植物基因组中其拷贝数不同，在拟南芥中 AACT有一个小的基因家族，而在胡萝卜中，AACT是一个单拷贝基因，其表达受到光的调节。 本发明首次从鼠尾草属药用植物丹参中克隆得到编码^AACT的基因，在本发明被公布之前， 尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的丹参乙酰CoA酰基转移酶基因及其氨基酸序 列。
植物基因克隆的方法有很多种，如功能克隆、表型克隆、定位克隆等。近年来，国外研
3究者采用经典的功能克隆法克隆到一些药用植物的关键酶基因，如紫杉醇合酶。然而在事先 无目的蛋白或其相应基因定位的的情况下分离相关基因是相当困难的。因此，对于遗传背景 不清，相关基因产物不明的情况下，表型克隆成为基因克隆的主要方法。基因芯片技术是20 世纪80年代发展起来的一项高新技术，它可以对生物整个基因组的所有基因表达同时进行实 时监测，作为一个全新的、强有力的技术平台，巳广泛地应用于功能基因组的研究中，也成 为挖掘新基因的强有力手段。cDNA芯片已在拟南芥、水稻、番茄、棉花等多个植物中得到了 应用，但在药用植物功能基因研究中还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丹参cDNA芯片的制作、杂交、差异基因分析以及功能基因 克隆的方法，并通过过表达AACT基因，预测SmAACT基因在丹参萜类成分积累过程中的 重要作用。本发明涉及的丹参cDNA芯片克隆关键酶基因、载体构建、遗传转化、分子检测、 丹参酮类成分提取及含量测定方法用于本发明，为利用转基因丹参大规模生产有效成分奠定 了坚实的基础。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明应用cDNA基因芯片方法从丹参中克隆 AACT基因；检测茉莉酸甲酯处理后SwAACT基因的表达情况及丹参酮IIA含量的变化情况； 构建含所述DNA分子的植物过表达载体，用根癌农杆菌介导，将AACT基因导入丹参并再 生出植株；PCR检测外源目的基因AACT的整合情况；HPLC测定丹参中四种葩类成分含量， 筛选获得萜类成分含量显著提高的转基因丹参植株。
本发明包括如下具体步骤
(1) 采用cDNA芯片方法获得丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)基因；
(2) 茉莉酸甲酯处理后5> AACT基因的表达情况及丹参酮IIA含量的变化情况；
(3) 构建含AACT基因的植物过表达载体，转化根癌农杆菌，获得用于转化丹参的含 AACT基因的根癌农杆菌菌株；
(4) 利用所构建的根癌农杆菌菌株转化丹参，获得经PCR检测的转基因丹参植株；
(5) 对获得的转基因丹参中萜类成分含量进行HPLC测定，筛选获得萜类成分含量显著提 高的转基因丹参植株。
结果表明，在过表达SmAACT基因的转基因发根高产株系中二氢丹参酮，隐丹参酮，丹 参酮I和丹参酮IIA含量比非转基因对照组分别提高1.1、 1.8、 1.6、2.6倍，初步证明6> AACT 基因在丹参次生代谢产物生成过程中具有重要作用。这一结果对于培育高品质的药用植物品 种特别是丹参具有重要的理论及实际意义。
4本发明所提供的丹参乙酰CoA酰基转移酶(SwAACT)首次从丹参中克隆制备，填补了 从我国药物植物丹参乙酰CoA酰基转移酶基因的空白。利用本发明可以通过基因工程技术来 提高丹参等植物中萜类活性成分萜类物质的含量。转基因结果显示，丹参乙酰CoA酰基转移 酶基因可通过转基因技术用于提高萜类成分含量的研究和产业化，尤其可用于中药材丹参的 品质改良，能缓解丹参酮、隐丹参酮等萜类药源严重匾乏问题，对提高丹参酮等物质产量具 有较好的促进作用，具有很好的应用前景。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例l、丹参cDNA芯片的制作
1、 丹参总RNA的分离和检测
取陕西商洛丹参(&/v/fl M/Wwr始a Bge)根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快 速转移至65'C预热的10mL提取缓冲液中(CTAB (W/V)2%， Tris-HCl (pH8.0) 100 mmol丄"， EDTA SSmmoll/1, NaCl 2.0 mol'L", 2%PVP40，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2%)，充分振 荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10MLiCl，混 匀后放置4。C沉淀过夜；7500 g离心20分钟，沉淀用500nLSSTE(SDS 0.5%， NaCI 1 mol'L"， Tris-HCl (pH8.0) 10mmol'U1 ， EDT A lmmol.L/1，在65"C溶解5分钟。用等体积氯仿抽提， 13000 g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70°。放置2h; 4'C 13000 g离心20分钟， 沉淀室温干燥10分钟后溶于100pL DEPC处理的水中，用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完 整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、 A280比值和浓度。置于-80'C冰箱备用。
2、 cDNA文库的构建
采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit, Pharmacia公司) 分离mRNA后，通过在cDNA分子两端加上EcoR I/Not I接头，在T4多核苷酸激酶的作 用下磷酸化，与表达载体XZAP Express Predigested Vector (ZAP Express Predigested Vector Kit, stratagene公司)连接，然后采用stratagene公司的ZAP Express Pridigested Gigapack Cloning Kits (EcoRI/CIAP-Treated)将包装蛋白在体外包装连接产物，感染E.coli XL1-Blue MRF构建 成cDNA文库。
3、 cDNA芯片的制备 3.1 PCR扩增
挑取分离良好的噬菌斑溶于lOO^L SM缓冲液(Amresco公司)中混匀后作为PCR模板。PCR扩增引物为人ZAP Express多克隆位点两侧的部分序列M13-20引物 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG隱3', BK反向引物5'-GGAAACAGCTATGACCTTG-3'。 96 孔板PCR反应体系，准备如下混合物dNTP (25mmol丄-l)， 600pL; Mg2+600nL， 10><缓 冲液100(VL; Taq (TakaraExTaq， 5UnL")， 40|iL; M13-20引物(12.5|amol.L-l )， 200^iL; BK反向引物(12.5pmol丄-l) 200nL;高纯水补足至10mL。混合均匀后，用排枪分装至96 孔PCR板。然后各加入6nLDNA模板，混合均匀。在ABI9700型基因扩增仪上进行PCR反 应，反应条件为94。C预变性3分钟，然后进行35个循环，为94。C30s， 54°C 30s， 72°C 2分 钟，循环结束后72'C后延伸5分钟。取3nL反应产物在含EB的1.5°/。的琼脂糖凝胶上电泳, 在SYNGENE型凝胶成像系统下观察、拍照。
3.2 PCR产物纯化
使用96孔Multiscreen filter plates (Millipore公司)纯化板进行PCR产物的纯化。将3.1 项下琼脂糖凝胶检测为单一条带的PCR产物(100pL)转入纯化板中；将纯化板放于Millipore 的真空装置上，于15mmHg真空抽滤IO分钟，直至抽干；加入lOO^L水，15mmHg真空抽 滤10分钟，直至抽干；从真空抽滤装置上取下PCR纯化板，加入40pL (pH8.0左右)的水， 将纯化板放至摇床上轻摇20 30分钟重悬DNA;将纯化产物吸出，置于酶标板上测定浓度和 纯度；取lnL纯化产物在1.5。/。的琼脂糖凝胶上电泳检测；将纯化产物真空干燥。
3.3 cDNA芯片点制
根据上述测定的浓度差异加入适量50%DMSO作为点样液，调节浓度至约250ng卞L—1后， 将样品转移至384孔板中准备芯片点制。点样仪为GeneMachine公司OmniGrid 100。点样参
数为针2x12, X: 8000 , Y: 6000;点间距300mi隱S;点阵13><14;点阵间距500
microns;矩阵模式4"2。
实施例2:丹参乙酰CoA酰基转移酶基因的克隆
1、 实验材料的准备
丹参毛状根为发根农杆菌15834直接感染的方式进行Ri-质粒转化诱导的毛状根。取6-7V 固体培养基(不含激素)暗藏保存的丹参毛状根，在无菌条件下将2g湿根接种于装有200ml 无激素的6-7V液体培养基的500mL三角瓶中进行继代培养，培养至18d后作为试验材料。 培养条件为25'C， 110 120rmin-1，黑暗条件下培养。
2、 诱导子的制备和处理
酵母提取物(yeast extract, YE)生物诱导子的制备取25g酵母提取物溶于125mL蒸 馏水中，加入lOOmL无水乙醇，置于4 'C冰箱静置4d，倾去上清液，胶状沉淀溶于125mL蒸馏水中，加入无水乙醇(乙醇含量达80%) 二次沉淀，离心，沉淀溶于100mL蒸馏水中， 120 t:灭菌20min，冷却后置于4 'C冰箱备用。
银离子(Ag+)的制备取AgNO3 5.096g溶于100mL蒸馏水中，制备得3mmol七-l的
Ag+。
诱导子处理向培养18d的丹参毛状根培养基中分别加入诱导子组合YE+Ag+(YE2ml、 Ag+66.7ul)进行诱导处理，每个处理3个重复，分别于YE+Ag+处理后不同时期收获，用吸 水纸吸干，各样本称取约2g鲜重于液氮速冻后-70。C保存(提取总RNA)或40'C干燥至恒重， 精密称量毛状根的干重用于测定毛状根中丹参酮IIA的含量。
3、 诱导子处理后丹参酮IIA的含量变化
采用高效液相色谱法测定诱导子处理后丹参酮IIA的含量。取干燥至恒重的丹参毛状根 适量，研碎过40目筛，混匀。取药材细粉约0.2g，精密称量，置20mL容量瓶中，加甲醇溶液 4mL，精密称重，超声处理40min，取出放冷，加甲醇溶液补足至原重，摇匀，静置，过0.45 pm 微孔滤膜即得。色谱条件为Waters 2695高效液相色谱仪，RP-Waters C18柱(150mmx3.9mm, 5pm)，检测波长270 nm;柱温30'C，流速1.0nrmin人流动相为0.5%醋酸甲醇(A)和0.5 0/o醋酸水(B)线性梯度洗脱0 25min， 30°/。 60%A; 25 30min， 60% 65%A; 30 50min, 65% 70%A; 50 60min， 70。/。 80%A; 60 61min， 80% 30%A。经过诱导子处理后，丹 参酮IIA含量迅速上升，处理后第48h，丹参酮IIAYE+Ag+处理组是对照组的1.7倍，处理后第 6d处理组是对照组的4.6倍，处理后第9d，处理组是对照组的5.9倍。结果表明丹参毛状根经诱 导子处理之后，丹参酮类成分在短时间内迅速积累。
4、 芯片杂交分析
根据上述诱导子处理后丹参酮IIA的变化情况，选用YE+Ag+处理后48h的毛状根及 对照组作为芯片杂交样品，以对照组(C)为参照，与YE+Ag+(YA怖材料进行杂交，重复 两次，每组均采用正反标记以消除染料的误差。
采用间接标记法进行探针标记，包括双链cDNA合成、T7介导的RNA体外转录合成 cRNA、随机引物反转录、cDNA用KLENOW酶标记等步骤。
(1 )双链cDNA合成取5吗总RNA ,以T7 — Oligo ( dT ) 15 ，
-3'， V可以是G、 C和A，上海博亚生物技术有限公司)为引物，用cDNA Synthesis Kit (TaKaRa 公司)合成双链cDNA;双链合成以后用QIAquickPCR Purification Kit (Qiagen公司)纯化。 (2)体外转录合成cRNA:用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System
7;然后用RNeasy试剂盒(Qiagen
公司)纯化。
(3) 随机引物反转录取2吗cRNA，用Superscript II反转录酶，200 U'(ii;1 (Invitrogen 公司)，9 Random Primer进行反转录，反转录产物用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen
公司)纯化。
(4) cDNA用KLENOW酶标记取1吗cRNA反转录产物，用随机引物进行KLENOW 标记，标记产物用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen公司)纯化，纯化后抽干。标记过程 中dATP, dGTP， dTTP使用浓度为120 ^M， dCTP使用浓度为60 pM， Cy5-dCTP， Cy3-dCTP 使用浓度为40 HM。
将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记，然后溶于30^iL杂交液中(3xSSC, 0.2%SDS, 5xDenhart，s, 25%甲酰胺)，于42。C杂交过夜。杂交结束后，先在42。C左右含0.2% SDS， 2xSSC的液体中洗5分钟，而后在0.2xSSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。 将不同样品分别用cy3、 cy5 (Amersham公司)进行标记，然后溶于30|iL杂交液中(3xSSC， 0.2%SDS, 5xDenhart's, 25%甲酰胺)，于42'C杂交过夜。杂交结束后，先在42'C左右含0.2°/。 SDS， 2xSSC的液体中洗5分钟，而后在0.2xSSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。 芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描。采用GenePix Pro 4.0 图像分析软件(Axon Instruments公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号； 然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后用Ttest方法结合两倍差异的标准来确 定差异表达基因。
5、 差异基因的获得和分析
将每组芯片两次重复的共同差异基因进行5'单向测序，获得的EST序列采用Windows 系统下的StadenPachage (gap4) (http:Wstaden.sourceforge.net)软件进行序列前处理以及拼接 聚类。去掉载体、接头以及低质量序列和较短的序列。使用BLASTX(6 December 2005: BLAST 2.2.13 released; http:〃www.ncbi.nih.gov /BLAST/)将处理后的EST序列在蛋白质水平上与 NCBI非冗余蛋白质数据库(non-redundant protein database)进行同源性比较，结果克隆号为 chip30h04的基因在YA/C杂交结果中均表现为上调基因，B1ASTX注释为硫解酶thiolase 基因，命名为丹参乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoAacyltryansferase， S附AACT)基因。
6、 cDNA末端快速扩增(5'-RACE和3'-RACE)
采用SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech公司)试剂盒进行扩增S附AACT 的5'末端和3'末端的扩增，按照说明书进行操作。总RNA用Trizol (Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。以设计的GSP1 (5'-CATCGCCGCTTGCATACAAATAACA -CCC-3')为5'RACE特异引物，进行cDNA 5'末端的扩增。PCR条件为94°C 5min， 94。C30s、 68'C30s、 72°C 2 min (35个循环)，72°C 7 min。扩增得到长约1800 bp的特异性cDNA片段。 根据 SwAACT 基因片段设计的 3'RACE 特异引物为GSP2 (5'-GGATGATTACTTGTCTGCCTCCTGGG-3')，以GSP2为扩增引物，进行S附AACT cDNA 3'末端的扩增。PCR条件为94°C 5min， 94°C 30s、 68°C 30s、 72'C 1.5 min G5个循环)，72°C 7min。扩增出约600bp的DNA片段。琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara公司)回收目的片段， 按pMD19T载体(Takara公司)试剂盒操作手册将上述片段克隆至pMD19-T载体中，鉴定 阳性克隆并测序(北京三博远志生物有限公司)。
通过cDNA杂交所得EST序列和5'-RACE获得的部分片段测序结果，可得到序列表SEQ ID NO:l所示的丹参乙酰CoA酰基转移酶基因SmAACT全长cDNA序列，其所推导的氨基 酸序列如SEQ IDNO:2所示。
7、全长cDNA的克隆和测序
根据5'RACE和3'RACE所得到的结果和芯片杂交获得的Unigene序列，从两端设计得 到钩取S附AACT全长cDNA的引物，正向引物为5、-GGGGGCAGCAGCATATTTCAGTCA-3'， 反向引物为5'-TACATGATCTGCCCTAAATAGTTG-3、；再以5'-RACE-Ready cDNA为模板， 进行LA-PCR。琼脂糖凝胶电泳表明约在1600bp处出现特异片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒 (Takara)回收目的片段，按上述方法克隆至pMD19-T载体中(Takara)，鉴定阳性克隆并进 行双向测序(北京三博远志生物有限公司)，用于原核表达载体的构建。
实施例3、 SwAACT基因的生物信息学分析
本发明涉及的丹参乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA的长度为1623bp,详细序列见序列 表中的序列l，其中开放读码框位于126-1325bp。将丹参全长cDNA序列用BLAST程序在
+PDB+Swissprot+ Superdate十PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，结果表明SmAACT与其他 植物的乙酰CoA酰基转移酶同源性介于70.6。/。(水稻，NP-001041797.1)至84.0% (胡黄连， ABC74567)之间，具有高度的同源性，丹参S/wAACT与烟草(AAU95618)、苏木(AAL 18924) 等的同源性也较高。根据蛋白质氨基酸序列多重比对结果可以看出，不同物种间氨基酸序列 具有多处保守序列区域(motif)，所有的AACT都具有通用的一致氨基酸识别模式 N-x(2)-G-G-x-(LIVM)-(SA)-x-G-H-P-x-(GA)-x-(ST)-G，这是乙酰CoA酰基转移酶的重要功能 域。根据植物乙酰CoA酰基转移酶蛋白进化树分析来看，新克隆的丹参SmAACT与拟南芥罗卡属(CAA55006)植物的亲缘关系较近，与胡黄连(ABC74567)、烟草(AAU95618)等 的植物亲缘关系较远。
实施例4、茉莉酸甲酯处理后SmAACT基因表达与丹参酮IIA含量的分析
利用茉莉酸甲酯(lOOmM)处理丹参毛状根，收集不同时间点的材料用于丹参AACT基 因表达量和丹参酮IIA的含量。AACT基因表达量采用荧光实时定量PCR。总RNA用Trizol (Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。取lpg RNA模板按RT试剂盒 (Takara公司)说明书反转录得到cDNA。 Real-time定量PCR采用ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA)禾口 SYBGREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems， UK)试剂盒，以丹参actin基因(GenBank登录号DQ243702)(引物序列actin-222: 5，- GGTGCCCTGAGGTCCTGTT -3,， actin-488: 5，- AGGAACCACCGATCCAGACA -3，)作 为对照，确证不同时间都符合要求而且cDNA的量都相差不多。AACT基因引物为SmAACT F5' GCCCTTGTCTTGAACTCGTGTAATCCTA 3' ， SmAACT R5， AATCTAATTCGCTCTGCTTCTCCATCTC 3'。按94 °C for 5 min ， (94°C for 30 sec, 55°C for 30 sec and 72°C for 1 min) 40 cycles, 72°C 7 min的PCR条件进行扩增。结果表明经过MJ 处理后，SwAACT基因表达水平于24h内迅速升高，之后逐渐降低到对照组水平。经actin 内参基因均一化之后，与对照组比较，处理后24h， MJ处理组是同时期对照组的2.3倍，说 明丹参毛状根经茉莉酸甲酯处理后，SwAACT基因表达水平内迅速升高，从而有利于其编码 的蛋白AACT催化2分子乙酰CoA发生縮合反应，推动代谢流向目的产物丹参酮类成分流动。
采用HPLC测定丹参酮IIA含量，色谱条件为Waters 2695高效液相色谱仪,Waters 2996 二极管阵列检测器，Millennium 32工作站，色谱甲醇(天津)；水为三重蒸馏水，氯仿(分析纯)， 无水乙醇(分析纯)，丹参酮IIA(购自北京市药品检定所)。RP-WatersC18(150mmx3.9mm, 5(xm) 柱，检测波长270 nm;柱温30'C，其流动相条件为流速LOmL.min"，流动相为0.5%醋 酸甲醇(A)和0.5 %醋酸水(B)线性梯度洗脱0~25min， 30% 60%A; 25 30min， 60 % 65%A; 30 50min， 65。/。 70。/。A; 50 60min， 70% 80%A; 60~61min， 80% 300/oA。 结果显示经过MJ处理后5d，丹参酮类成分含量迅速上升，处理后第5d，丹参酮IIA成分 是对照组的1.3倍，处理后第10d，丹参酮IIA成分含量是对照组的5.4倍；处理后第15d， 丹参酮IIA成分含量是对照组的6.1倍。结果表明丹参毛状根经茉莉酸甲酯处理后，丹参 AACT基因表达量能被显著的诱导表达，且伴随丹参酮IIA的迅速积累。由上推测所得到的 丹参AACT基因为丹参酮类成分生物合成途径的关键酶基因。
实施例5、根癌农杆菌介导AACT基因遗传转化丹参获得转基因丹参植株
101. Gateway过表达载体的构件 设计扩SmAACT基因全长的引物(SmAACT-Bl: TTCTAATACGACTCACTATAGGGCA; SmAACT-B2:CAATAACTCTACCTAAGGACCAAAG)。应用高保真酶进行PCR，将产物切胶 回收。
BP反应
PCR产物50-100 ng(3.5uL)
PDONR22150-100ng(0.5uL)
BP Clonase酶l.OuL(用前轻轻混合下)
A. 反应体系置25度温育12小时(PCR仪)，
B. 加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。
C. 将BP反应产物经过DH5a克隆
D. 含40ug/mkan (卡那霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证，提质粒。 LR反应
BP反应质粒50國150ng(3.5uL)
PH7WG2D载体150ng(0.5uL)
LR Clonase酶l.OuL(用前轻轻混合下)
A. 反应体系置25度温育12小时(PCR仪)，
B. 加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。
C. 将BP反应产物经过DH5a克隆
D. 含50ug/ml Spe (壮观霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证。 提质粒并通过电击转化的方法转入农杆菌中。
2、根癌农杆菌介导AACT基因转化丹参 2.1外植体预培养
选取10d的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5X0.5cir^的小i央，用刀将叶表面划伤，以背面向 上方式将叶片置于MS固体培养基上，于25'C光照16h，黑暗8h条件下预培养2d。 2.2农杆菌活化扩增
4'C保存的平板上挑取单菌落于新的含50mg/LRif和80mg/L Spe的YEB培养基上，划线， 挑取单菌落接种于15ml含50mg/L Rif和80mg/L Spe的YEB液体培养基中，于28振荡培养 至OD26。0.5左右(250rpm， 23h)，保菌，将菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10 min，
弃上清，用等体积的MS液体培养基重悬沉淀菌体，用于侵染。2.3侵染及共培养.
将预培养材料放入MS重悬液中，侵染10min，取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放 入新的MS固体培养基上，暗培养48-72h。 2.4选择培养
将共培养的外植体用无菌水清洗3次，400mg/Lcef水浸泡5min左右，无菌水清洗1次， 吸干水分后移入含2mg/LHyg和400mg/L cef的MS固体培养基上，与黑暗中进行筛选培养。 每7天更换一次培养基，选择生长迅速至2-3cm的抗性毛状根，将其切下,单独标号转入2mg/L Hyg和400mg/Lcef的MS培养基上，将除菌后的阳性根转入2mg/LHyg的MS培养基继代。
2.5进一步筛选确定
毛状根经过绿色荧光显微镜检测(GFP)，再经过特异引物PCR检测目的基因是否插入 植物基因组，选择阳性株系进行放大培养(6,7-V培养基)。 实施例6、转基因丹参植株的PCR检测
根据SEQ ID No. 1基因的ORF序列设计SmAACT基因的双向引物对目的基因进行检测。 结果表明，转AACT丹参株系在1200bp处扩增出特异DNA片段，而以非转化丹参基因组 DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化丹参的含AACT基因植 物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化丹参，获得经PCR检测的 转基因丹参植株。
实施例7、转基因丹参中丹参酮类成分含量测定
生长45d的丹参毛状根37'C干燥，硏磨成粉，100mg加4ml甲醇，4'C浸泡过夜，超声 30min，离心(3000rpm， 3min)，上清取出液氮吹干，加入lml甲醇复溶，过0.22um滤膜。 采用HPLC测定二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量，色谱条件为Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters 2996 二极管阵列检测器，Millennium 32工作站，色谱甲醇(天津)； 水为三重蒸馏水，氯仿(分析纯)，无水乙醇(分析纯)，二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I 和丹参酮IIA(购自北京市药品检定所)。RP-Waters C18(150mmX3.9mm, 5 u m)柱，检测波长 270 nm;柱温30°C，其流动相条件为流速l.OmL.min—1,流动相为0.5%醋酸甲醇(A)和 0.5 。/。醋酸水(B)线性梯度洗脱0~25min， 30% 60%A; 25 30min， 60% 65%A; 30 50min， 65% 70%A; 50 60min, 70% 80%A; 60~61min， 80% 30%A。在该色谱条件下对丹参毛
状根丹参酮类成分进行含量测定。
结果表明，在过表达SwAACT基因的转基因发根高产株系中二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量比非转基因对照组分别提高1.1、 1.8、 L6、2.6倍。检测结果证明， 丹参SmAACT基因对促进丹参酮类含量的提高有明显作用，SmAACT基因可用于利用转基因 技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中，具有很好的应用前景。序列表
〈110〉中国中医科学院中药研究所
〈120〉 一种丹参乙酰CoA酰基转移酶(5iff AACT)
<腸 2
〈170〉 Patentln version 3. 5 〈210〉 1 〈211〉 1623 〈212〉 画
〈213〉 丹参(5^f_z's肌7"'orr/^s Bge.) 〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (126).. (1325)
〈400〉 1
ttctaatacg actcactata gggcaagcag tggtatcaac gcttaatata ttctttattg gctgctccat ttttatcagg tgatcatggc accagaagct gcttcaatca acccaaaaga ctcggacacc tatgggtggt tttctcggtt cactctcatc gatccgtagc tattcag已gt gctttgaaga gagca犯tat aagttttctt cgggaatgta ctcagcgcaa acttaggaca cgttgggtgc cgggatcccg aattcagtag tctgtacaac ctggaatgaa agc￡l￡ictatg ctagcagcgc aaagtatcca tagtggccgg tggcatggag agcatgtct3 atgtcccaaa aaggatctcg acttggacac gactctcttg ttgatggaat atgtttacaa cgatgttggc atgggtgtct gtgctgaatt ttacgagaga gcagcaggac gattttgctg tccaaagttt a卿tgtcgg tgcctttgcg tgggagatta ctccagtcga gaccatccac cattgttgac已aggatgaag gtcttgga犯 gg已agcta已g已ccgagtttc aaggei已accg gtggsactgt gcataagcga tggtgccgct gctcttgtU tagtaagcgg ggcttacggt cattggaaag atctccggat atgctgatgc
基因的分析及应用
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3gt3CCggC3
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60 120 180 240 300 360 420 ■ 540 600 660 720 780 840 900 960 1020ttacgactgccccggctcttgcaattccca3ggcactcaag犯tgctggtttgg犯gcat蘭
ctaaagtggact3ttacgaaatcaatgaagcttttgcggtcgtggctcttgctaatcaga1140
agctattggatcttagtccgacgtacacggtggagctgtgtctctagggc1200
atcctctcggttgcagtggcgctcgtatxttggtcactctcttgggggttttg已ggcaas1260
agaacgcaagtatggcgttggtggcgUtgcaacggagga卿ggcgcctcggcccttgt1320
cttg已已ctcgtgtaatcctaccttgtttgtgatttcgttgggacgacgcgactggcagcg1380
gagcagcctttgaag卿tgg卿agc卿gcgaattagstt犯tctgtacatcttcagt1440
cttagatgagttttactgtgttattttcttttcttcagcata已tttgacttagatagata1500
gt3g卿卿tggtgtttctgatcatatgctggtgtactttatctccataatgtaccggc1560
gcgaatcctg犯tccttsgtcactgcaggcgcgatcagctttggtccttaggt卿gtta翻
ttg1623
〈210> 2 〈211〉 399 〈212〉 PRT <213〉 丹参 〈400〉 2 Met Ala Pro 1
Gly Val Ala
Val Pro Ala 35
Arg Ala Asn 50
Val Leu Ser 65
Gly Ala Gly Cys Ala Ser
(5"aJi/7's /w7 ^z'orr/w'z3 Bge.)
Glu Ala 5
Arg Thr 20
Thr Lys
lie Asp
Ala Asn
lie Pro
85 Gly Met
Ala Ser lie
Pro Met Gly
Leu Gly
Pro Ser
55 Leu Gly 70
Asn Ser
Ser
40
Leu
Asn Pro
10 Gly Phe 25
Val Ala
Val
Lys Ala Thr
Val Cys 90 Met Leu
Lys Asp Val
Leu Gly Ser
lie Gin
Val Gin Glu
Gin Ala Pro
Ala
75
Thr
Val
60
Arg
Ser
45
Phe
Gin
Thr lie
Ala Ala Gin
Cys lie Val 15
Leu Ser Ser 30
Ala Leu Lys
Phe Gly Asn
Ala Ala Leu 80
Asn Lys Val 95
Ser lie Gin100
Leu Gly Leu Asn Asp Val Val 115
Pro Lys Tyr lie
105
Ala Gly Gly Met
Asn Val 130
His Asp Ser Leu Val 145
Tyr Asn Asp Val
Val 120
Glu Ala Arg Lys
Ala 135
Gly Met Leu Lys
110
Glu Ser Met Ser 125
Ser Arg Leu Gly
Asp 150
Met Gly Val Cys
Gly 140
Gly Leu Trp Asp
Gly 165
His Ser lie Thr Arg Glu Gin Gin 180
Glu Arg Gly lie Ala Ala Gin Asp 195 200 Val Glu Val Ser Gly Gly
Asp 155
Glu Leu Cys Ala
Asp 185 Val
Ala 170
Asp Phe Ala Val
Glu 175
Ser
Val 160 His
Phe
Thr Pro 210
Asp Lys Asp Glu Gly 225
Leu Arg Pro Ser
Gly 215
Gly Lys Phe Asp
Gly Ala Phe Arg Gly Arg
Gin 190
Trp Glu lie
Ala 205
Ser Thr lie Val
Leu 230
Lys Glu Thr Gly
Ala Ser Ser lie 260 Leu
Gin Lys Ala 275
Tyr Ala Asp Ala Ala His 290
Leu Ala lie Pro丄ys 305
Val Asp Tyr Tyr
Phe 245
Ser Asp Gly Ala Glu Leu Gly
Pro 220
Ala Ala Lys Leu Arg 235
Thr Val Thr Ala
Gly 250
Ala Leu Val Leu
Ala 265
Thr Val lie Gly
Gly 255 Ser
Lys 240 Asn
Gly
Leu 280
Ala Pro Glu Uu Phe 295
Leu Lys Asn Ala
Val 270
lie Ser Gly
Ala 310
lie Asn Glu Ala
Lys 285
Thr Thr Ala Pro Ala 300
Leu Glu Ala Ser
Gly Leu Glu Ala Ser Lys 315 320 Ala Val Val Ala Uu Ala
Glu lie Asn Glu Ala Phe Ala Val Val Ala Uu 325 330 335
Asn Gin Lys Leu Leu Asp Leu Ser Pro Glu Arg Val Asn Val His Gly
16Gly Ala Val Ser Leu Gly His Pro Leu Gly Cys Ser Gly Ala Arg lie
355 360 365
Leu Val Thr Leu Leu Gly Val Leu Arg Gin Lys Asn Ala Ser Met Ala
370 375 380
Leu Val Ala Phe Ala Thr Glu Glu Glu Ala Pro Arg Pro Leu Ser 385 390 39权利要求
1、一种与丹参二萜醌类化合物合成有关的基因SmAACT(Salvia Miltiorrhiza Bge.Acetoacetyl-CoA Thiolase)，它是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1的DNA序列；2)由SEQ ID No.1通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列，其编码与SEQ ID No.2相同功能的蛋白质。
2、 根据权利要求1所述的基因，其特征在于所述丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT) 基因为SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
3、 根据权利要求2所述的基因，其特征在于该基因的读码框位于126-1325位核苷酸。
4、 一种由权利要求1所述的基因SwAACT编码的蛋白质。
5、 根据权利要求4所述蛋白质，其特征在于它的氨基酸残基序列为SEQ ID No. 2。
6、 含有权利要求1所述基因全序列或部分片段的重组载体。
7、 含有权利要求1所述基因全序列或部分片段的宿主细胞。
8、 含有权利要求l所述基因的转基因细胞系。
9、 权利要求l所述基因在丹参药材鉴定及育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT)基因及其编码的蛋白酶与用途，该基因为首次利用cDNA芯片技术从丹参中克隆而得，填补了从我国传统名贵中药材丹参中分离克隆出乙酰CoA酰基转移酶基因的空白。本发明所提供的SmAACT基因具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。丹参乙酰CoA酰基转移酶基因催化MVA途径上第一个酶促反应，使2分子的乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA，是丹参二萜醌类化合物生物合成途径上的第一个关键酶，推测该基因的表达量与丹参酮类成分的含量密切相关。本发明提供的SmAACT基因可以通过生物技术提高丹参中二萜类活性成分丹参酮类的含量，可用于利用生物技术来提高丹参酮类物质含量的研究和产业化，有助于丹参药材的品质改良及选育，具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/54GK101613704SQ200910148599
公开日2009年12月30日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者崔光红, 张夏楠, 戴住波, 王学勇, 黄璐琦 申请人:中国中医科学院中药研究所