专利名称：乙肝耐药突变测序试剂盒及测序方法
技术领域：
本发明涉及的是一种乙肝耐药突变测序试剂盒及乙肝耐药突变的测序方法，属于病毒耐药突变检测领域
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝脏疾病的主要致病因子，全球已有近4亿人成为慢性HBV携带者，其中75％的感染发生在亚洲并作为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因。我国是最主要的乙肝大国，2002年我国流行病学调查显示，乙肝表面抗原阳性率9.09％，约1.2亿，慢性乙型病毒性肝炎病人约3000万。目前这类人群正处在发病和治疗的高峰时期。目前公认有效的抗HBV药物主要包括核苷(酸)类似物和α干扰素。研究表明干扰素的疗效与基础核心启动子(BCP)区A1762+G1764位点的双变异密切相关。核苷(酸)类似物因具有服用方便、不良反应小、适应症广泛等特点而被广泛应用，但长期服用核苷(酸)类似物，有可能产生耐药性突变，从而导致病情反弹。在长期抗病毒治疗中，HBV出现聚合酶(P)区基因区耐药变异已经成为目前临床医师进行CHB治疗面临的主要问题。为便于临床医师在抗HBV治疗过程中监测耐药变异情况，适时选择药物及改变治疗方案，需要有方便、快速、准确的检测HBV相关耐药位点的变异发生情况的方法。
目前临床常见的HBV耐药位点的检测试剂盒大多为单一检测YMDD区的荧光定量PCR试剂，这类试剂无法同时检测多个耐药位点的突变；也可以先PCR再进行Sanger测序，可以进行HBV耐药位点突变的检测，最近几年不断改进的测序系统(如ABI公司377等)能满足较大通量的检测HBV耐药突变，但该方法并不能得出各突变位点发生变异的具体频率的精确数据，这将会影响临床医师CHB治疗方案的制定和改进；而基因芯片检测HBV耐药位点的突变也不能得到耐药突变的准确频率，另外该方法成本太高，不适宜进行临床推广。
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，是一种基于DNA合成过程中伴随着焦磷酸(PPi)的释放并进行检测的技术。在酶联反应中，掺入的核苷酸的数量比能等比的显示为不同强度的荧光信号。该技术具有快速、准确、经济、实时检测的特点，不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，有很高的可重复性、高度的并行性和高度的自动化，特别适用于已知基因的突变分析。特别是耐药突变的准确频率对指导患者选择抗病毒药物、是否继续使用该抗病毒药物、何时停用或换用何种抗病毒药物都有很现实的临床意义，对病人抗病毒治疗的疗效判断、预后评估十分重要。迄今为止国内外未见应用焦磷酸测序技术同时检测乙肝病毒多耐药位点和准确突变频率的产品和报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种乙肝耐药突变测序试剂盒及测序方法。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案 一种乙肝耐药突变测序试剂盒，该试剂盒包括 (1)特异性扩增乙肝病毒基因的引物，其碱基序列如SEQ ID NO1 SEQ ID NO2SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示； (2)乙肝病毒特异性测序引物，其碱基序列如SEQ ID NO5 SEQ ID NO6SEQ IDNO7SEQ ID NO8SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示； 上述所有序列可由其碱基互补序列替换。
所述SEQ ID NO4标记生物素。
一种利用如上所述的乙肝耐药突变测序试剂盒检测乙肝耐药突变的测序方法，该方法包括如下步骤 1)HBV DNA模板抽提； 2)以步骤1)所得DNA为模板，利用所述特异性扩增乙肝病毒基因的引物进行PCR扩增； 3)上述PCR产物以所述的标记生物素进行单链纯化； 4)以步骤3)所得单链纯化产物进行测序； 5)结果分析。
一、HBV DNA模板抽提，包括(1)、待测标本及阴性体检对照血清融化后，在0.5ml离心管中，取100μl血清，加入100μl浓缩液，剧烈振荡15s，13000rpm离心10min； (2)、吸去上清(尽量吸干净)，往沉淀中加入30μl裂解液，剧烈振荡15s； (3)、4000rpm甩一下使裂解液处于管底，金属浴101℃12min，完成后-20℃冷却1-2min，此时不能开盖，防止气溶胶污染，13000rpm离心10min，上清作为PCR模板用于检测。
二、所述的PCR扩增采用巢式PCR，即第一次用SEQ ID NO1SEQ ID NO2引物对进行扩增；第二次以第一次PCR产物为模版用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4引物对进行扩增，每一标本扩增平行的6管。PCR体系及条件如下
三、焦磷酸测序 四、结果分析
图1是本发明的乙肝病毒耐药突变测序结果图。
图2是本发明的另一乙肝病毒耐药突变测序结果图。
图3是本发明的又一乙肝病毒耐药突变测序结果图。
图4是本发明的又一乙肝病毒耐药突变测序结果图。
图5是本发明的又一乙肝病毒耐药突变测序结果图。
图6是本发明的又一乙肝病毒耐药突变测序结果图。
具体实施例方式 附图标号说明 编 氨基酸 氨基酸 氨基酸中文名 碱基位点 野生型 突变型 号 位点 简称 1 169I-T 异亮氨酸-苏氨 634-636 ATTB、C、D、EACA、ACT 酸 ATAA、F、G、H 2 173V-L 缬氨酸-亮氨酸 646-648 GTGTTG、CTG 3 180L-M 亮氨酸-甲硫氨 667-669 CTGC、D、E、FATG 酸 TTGA、B、G、H 4 181A-V/T 丙氨酸-苏氨酸 670-672 GCTACT、GGT /缬氨酸 5 184T-G/S/A 苏氨酸-甘氨酸 679-681 ACTGGT、CTT、 /C/L/丝氨酸/丙氨酸 TCT、AGT、/半胱氨酸/亮氨 GCTTGT酸 6 194A-T丙氨酸-苏氨酸 709-711GCTACT 7 202S-I/G 丝氨酸-异亮氨 733-735AGCA、G ATT、ATC、酸/甘氨酸GGT、GGC AGTB、C、D、E、F、H 8 204M-I/V 甲硫氨酸-异亮 739-741ATGATT、ATC、氨酸/缬氨酸 ATA、GTG、 GTC、GTA 9 236N-T天冬酰胺-苏氨 835-837AACA、B、C、D、G、H ACC、ACT酸 AATE、F 10 250 M-V甲硫氨酸-缬氨 877-879ATGGTG酸 一、HBV DNA模板抽提，包括(1)、待测标本及阴性体检对照血清融化后，在0.5ml离心管中，取100μl血清，加入100μl浓缩液，剧烈振荡15s，13000rpm离心10min； (2)、吸去上清(尽量吸干净)，往沉淀中加入30μl裂解液，剧烈振荡15s； (3)、4000rpm甩一下使裂解液处于管底，金属浴101℃12min，完成后-20℃冷却1-2min，此时不能开盖，防止气溶胶污染，13000rpm离心10min，上清作为PCR模板用于检测。
二、所述的PCR扩增采用巢式PCR，即第一次用SEQ ID NO1SEQ ID NO2引物对进行扩增；第二次以第一次PCR产物为模版用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4物对进行扩增，每一标本扩增平行的6管。PCR体系及条件如下
三、焦磷酸测序 四、结果分析 图1所示的测序结果是20090915-HBV-7-Well A1 EntryHBVP-S1 Position 1G100.0％/A0.0％(Passed) Position 2(Failed) Position 3(Failed) Position 4G85.9％/C14.0％/T0.1％(Passed) 图2所示的测序结果是20090915-HBV-7-Well B1 EntryHBVP-S2 Position 1C89.3％/A10.6％/T0.1％(Passed) Position 2G96.4％/A3.6％(Check) Position 3C100.0％/T0.0％(Passed) Position 4(Failed) Position 5(Failed) Position 6(Failed) 图3所示的测序结果是20090915-HBV-7-Well C1 EntryHBVP-S3 Position 1G100.0％/A0.0％(Passed) 图4所示的测序结果是20090915-HBV-7-Well D1 EntryHBVP-S4″ Position 1(Failed) Position 2(Failed) Position 3(Failed) Position 4T94.6％/C5.4％(Check) Position 5A82.5％/G17.5％(Passed) Position 6T41.0％/C45.9％/A12.9％/G0.2％(Passed) 图5所示的测序结果是20090915-HBV-7-Well E1 EntryHBVP-S5′ Positior 1A100.0％/C0.0％(Passed) 图6所示的测序结果是20090915-HBV-7-Well F1 EntryHBVP-S6 Position 1A100.0％/G0.0％(Passed) 1L-核苷类似物组的耐药特点与拉米夫定相似，核心突变位点为M204I/V，伴随其他位点的变异，其耐药性突变形式主要有以下3种 (1)L180M+M204V/I，(2)V173L+L180M+M204V/I，(3)M204V/I。
2无环磷酸酯组包括阿德福韦和替诺福韦，阿德福韦耐药性突变位点N236T和A181V/T，而替诺福韦的耐药突变位点为A194T。
3环戊烯组代表药物为恩替卡韦，它具有很高的耐药基因屏障，需要3个或3个以上位点同时突变才能产生耐药性，包括2个拉米夫定耐药位点(L180M+M204V/I)，另外的突变位点还包括I169T、T184G、S202I和M250V，其耐药突变主要有2种形式 (1)L180M+M204V/I+M250V+I169T，(2)L180M+M204V/I+T184G+S202I
具体实施例方式 实施例1 一、材料 1.浓缩液 PEG600016％ NaCl 3M Triton 0.1％(可选) 2.裂解液 Chelex 5％ Tricine30mM，(母液1M，pH9.0) 辛酸钠 150mM 盐酸胍 150mM Triton 0.1％ 3.2*PCR Buffer(不含MgCl2)，0.1％NP-40，0.02％明胶，0.06％BSA，0.1％Tween-20，0.06M Tricine pH8.9。
4.MgCl2(25mM) 5.dNTPs(10mM) 6.PCR仪、焦磷酸测序仪、离心机 二、方法 1、HBV DNA模板抽提， 1)待测标本及阴性体检对照血清融化后，在0.5ml离心管中，取100μl血清，加入100μl浓缩液，剧烈振荡15s，13000rpm离心10min； 2)吸去上清(尽量吸干净)，往沉淀中加入30μl裂解液，剧烈振荡15s； 3)4000rpm甩一下使裂解液处于管底，金属浴101℃12min，完成后-20℃冷却1-2min(此时不能开盖，防止气溶胶污染)，13000rpm离心10min，上清作为PCR模板用于检测。
2、PCR扩增 PCR扩增采用巢式PCR，即第一次用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2引物对进行扩增；第二次以第一次PCR产物为模版用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4引物对进行扩增，每一标本扩增平行的6管；PCR体系及条件如下
3、焦磷酸测序 1).打开仪器，预热90分钟。
2).试样预处理，单链分离纯化 ●在使用前，保证所有溶液都达到室温； ●在PSQ 96板中加入45μl annealing buffer，每个标本加6孔，每孔分别加入S1-S6测序引物(10uM)2ul，； ●使用Vertex混匀Sepharose beads，将需要使用的sepharoe beads总量(每样本3μl)转移到一个Eppendorf管中，在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀； ●将以上混合物加入PCR产物(50μl反应体积)中，每样本50μl，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合； ●在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer； ●打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒，然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads，将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureation buffer中5秒，再移到washing buffer中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads)， ●使用高纯水清洗vacuum prep tool。
●将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80-90℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。
3).软件的使用 ■打开电脑和相应操控软件； ■选择SNP，SNP Runs，进行碱基加入顺序的设定 ■选择New SNP Run，填入Run name，选择Instrument parameters； ■选择需要使用的样品孔，并点击Activate； ■在Entry中填入设置好的entry； ■点击View下拉菜单中的Run，记下仪器自动计算出的各种试剂的量； 4).试剂舱及试剂准备 ■用高纯度的水(18.2MΩ)溶解酶和底物，轻轻摇动试剂瓶使酶和底物溶解； ■用加样枪将试剂贴壁缓慢加入试剂舱； ■将所有试剂在室温下放置10分钟让温度平衡到室温； ■将试剂舱的标签面对自己，并按照试剂舱说明中标识的位置加入各种试剂； ■将试剂舱上的标签面向自己放入仪器； 5).运行pyrosequencing程序 点击Run，进行焦磷酸测序。
6)分析结果 SEQUENCE LISTING SEQ ID NO1 AGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTC SEQ ID NO2 GGCCTTGTAAGTTGGCGAG SEQ ID NO3 CACYTGTATTCCCATCCCATC SEQ ID NO4 AATTCTTTGACATACTTTCCAATCAAT SEQ ID NO5 CCTGGGCTTTCGCAA SEQ ID NO6 GCCTCAGTCCGTTTCTC SEQ ID NO7 GTTCAGTGGTTCGTAGG SEQ ID NO8 CCCACTGTYTGGCTT SEQ ID DNO9 TTTTGTCTTTGGGTATACAT SEQ ID NO10 TAYTCCCTTAACTTC 本发明所述的试剂盒含有以下成分DNA抽提试剂，Taq DNA聚合酶，4条特异性扩增乙肝病毒基因的引物，6条检测乙肝病毒基因耐药突变的测序引物，应用此试剂盒能同时检测拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦和替诺福韦耐药突变以及病毒突变株的比例，为临床诊疗提供了更全面的参考信息。
权利要求
1.一种乙肝耐药突变测序试剂盒，其特征在于该试剂盒包括
1)特异性扩增乙肝病毒基因的引物，其碱基序列如SEQ ID NO1 SEQ ID NO2 SEQID NO3和SEQ ID NO4所示；
2)乙肝病毒特异性测序引物，其碱基序列如SEQ ID NO5 SEQ ID NO6 SEQ ID NO7 SEQ ID NO8 SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；
上述所有序列可由其碱基互补序列替换。
2.根据权利要求1所述的乙肝耐药突变测序试剂盒，其特征在于所述SEQ ID NO4标记生物素。
3.一种利用如权利要求1或2所述的乙肝耐药突变测序试剂盒检测乙肝耐药突变的测序方法，该方法包括如下步骤
1)HBV DNA模板抽提；
2)以步骤1)所得DNA为模板，利用所述特异性扩增乙肝病毒基因的引物进行PCR扩增；
3)上述PCR产物以所述的标记生物素进行单链纯化；
4)以步骤3)所得单链纯化产物进行测序；
5)结果分析。
4.根据权利要求3所述的利用乙肝耐药突变测序试剂盒检测乙肝耐药突变的测序方法，其特征在于所述的HBV DNA模板抽提，包括(1)、待测标本及阴性体检对照血清融化后，在0.5ml离心管中，取100μl血清，加入100μl浓缩液，剧烈振荡15s，13000rpm离心10min；
(2)、吸去上清(尽量吸干净)，往沉淀中加入30μl裂解液，剧烈振荡15s；
(3)、4000rpm甩一下使裂解液处于管底，金属浴101℃12min，完成后-20℃冷却1-2min，此时不能开盖，防止气溶胶污染，13000rpm离心10min，上清作为PCR模板用于检测。
5.根据权利要求3所述的利用乙肝耐药突变测序试剂盒检测乙肝耐药突变的测序方法，其特征在于所述的PCR扩增采用巢式PCR，即第一次用SEQ ID NO1 SEQ IDNO2引物对进行扩增；第二次以第一次PCR产物为模版用SEQ ID NO3和SEQ IDNO4引物对进行扩增，每一标本扩增平行的6管；取5μl第二次PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度1.5％。
全文摘要
一种乙肝耐药突变测序试剂盒及测序方法，所述的试剂盒包括1)特异性扩增乙肝病毒基因的引物，其碱基序列如SEQ ID NO1 SEQ ID NO2 SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；2)乙肝病毒特异性测序引物，其碱基序列如SEQ ID NO5 SEQ ID NO6SEQ IDNO7SEQ ID NO8SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；上述所有序列可由其碱基互补序列替换；所述的测序方法，包括1)HBV DNA模板抽提；2)以步骤1)所得DNA为模板，利用所述特异性扩增乙肝病毒基因的引物进行PCR扩增；3)上述PCR产物以所述的标记生物素进行单链纯化；4)以步骤3)所得单链纯化产物进行测序；5)结果分析；本发明能同时检测拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦和替诺福韦耐药突变以及病毒突变株的比例，为临床诊疗提供了更全面的参考信息。
文档编号C12Q1/70GK101705308SQ20091015419
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月12日 优先权日2009年11月12日
发明者任绪义 申请人:温州迪安医学检验所有限公司