专利名称：利用黑曲霉液体深层发酵产纤维素酶的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种新的纤维素酶制备方法，涉及微生物发酵法生产纤维素酶。
背景技术：
纤维素酶指的是降解纤维素生成葡萄糖的一类酶的总称，它不是单种酶，而是起 协同作用的多组分酶系，主要来自于真菌和细菌。其中3种主要酶组分是内切β-1，4-葡 聚糖酶(EC3. 2. 1. 4) (Cx酶，CMC酶)；外切葡聚糖酶(EC3. 2. 1.91)(也称C1酶，微晶纤维素 酶)；β -葡萄糖甘酶(EC3. 2. 1. 21)。纤维素酶是植物细胞壁的主要成分。纤维素酶一方面将纤维素水解成葡萄糖等 有效成分，另一方面它通过提高植物细胞壁的同透性而提高细胞内含物(蛋白质、脂肪、淀 粉)的提取率。要使纤维素充分将解和利用，就酶本身而言，主要考虑2个方面提高酶的 活力和改善纤维素酶系各组分的相对含量，以充分发挥它们之间的协同作用。纤维素酶具 有补充动物内源酶；促进养分的消化吸收；消除抗营养因子的效果。它是一种高活性生物 催化剂，应用极其广泛，如酿造果汁与蔬菜加工，粮食加工、食品、饲料、造纸、中草药有效成 分的提取，以及纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等各个方面。纤维素酶广泛存 在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、动物体内等，但研究和生产中所用的纤维素酶都是 用真菌发酵得到的，菌中大多是木霉、曲霉和青霉、根霉属和漆斑霉属等。而黑曲霉是公认 安全的微生物，用其生产酶制剂安全、可靠，不产生毒素，而且生产快、发酵周期短、具有明 显的优越性，可望用于食品和医药领域。本发明用黑曲霉作为发酵菌株采用液体深层发酵 及变温控制法生产纤维素酶。生产工艺比较简单，设备要求低，产量高，可用于工业化大规 模生产。
发明内容
本发明提供了一种新的纤维素酶生产方法，其步骤包括(1)配置营养盐液准确称取2. OKH2PO4,1. 4g (NH4) 2S04，0. 3gMgS04 ·7Η2，0. 3gCaCl2，加 600ml 水使之溶 解。再称取 5. OmgFeSO4 · 7H20,1. 6mgMnS04 · H20,1. 4mgZnS04 · 7H20, 2. OCoCl2,力卩 200ml 蒸 馏水使之溶解，将2种混合液混合再用HCl调节PH至5. 5，于容量瓶中定容至1000ml.此溶 液即为mandels营养盐溶液，在此溶液中再加4gNaN03改进mandels营养盐溶液，将配置好 的营养盐溶液放于冰箱中备用.(2)配置PDA斜面培养基准确称取6g马铃薯粉，2g葡萄糖，2g琼脂再加IOOml蒸馏水使之溶解，分别倒入 5个试管中，于121°C高温灭菌锅中灭菌20min，冷却，制成斜面培养基备用。(3)黑曲霉的选育及培养将菌种保藏培养基上的黑曲霉菌在无菌操作台中接种到PDA斜面培养基上，于 下放入恒温培养箱中培养4-5d。
(4)配置液体发酵培养基用改良的Mandels氏营养盐为底物配置液体发酵培养基，加入玉米芯80g/L，蛋 白胨6g/L，麦芽糖10g/L，再加入一定量的ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04缓冲溶液调节PH于5. 8左右，配 200ml装入IL的三角摇瓶。(5)接种发酵培养将培养好的新鲜PDA斜面培养基上的菌体制成菌悬液，接种15ml到液体发酵培养 基中，于32°C、150r/min转速下放入恒温震荡培养箱中培养Mh，然后下调温度至28 V，继 续培养3^!。(6)纤维素酶提取将搅拌发酵后的发酵液通过板框压滤，滤布目数为768，压滤速率为5吨/小时。 压滤后的发酵液再经超滤浓缩，使滤液浓度浓缩为原来的15-20倍。浓缩后的滤液经喷雾 干燥后制得纤维素酶干粉。本发明生产操作工艺简单，原料来源广泛，生产成本低且无污染，适于工业化生 产，为一种理想的生产纤维素酶的方法。为研究实验中各种最优化条件设计了几个比较实验1.产纤维素酶发酵特性研究实验设计按25g/L的浓度加入麦秸粉、甘蔗渣和玉米芯等不同碳源，用营养液配 置，250ml三角瓶装液量30!111，在^°C、200r/min震荡培养，每隔24h取样测定纤维素酶活
力，测得实验数据如下
权利要求
1.利用黑曲霉液体深层发酵产纤维素酶，其特征包括以下几个步骤(1)配置营养盐液以Mandels氏营养盐为基础再加入NaNO3 4. Og/Ι，配置成一种新的营养盐备用。(2)黑曲霉的选育及培养将菌种保藏培养基上的黑曲霉菌接种到产孢子培养基上，于下放入恒温培养箱中 培养4-5d。(3)配置液体发酵培养基用改良的Mandels氏营养盐为底物配置液体发酵培养基，加入玉米芯80g/L，蛋白胨 6g/L,麦芽糖10g/L，再加入一定量的ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04缓冲溶液调节PH于5. 8左右，配200ml 装入IL的三角摇瓶。(4)接种发酵培养将培养好的新鲜产孢子斜面上的孢子制成菌悬液，接种15ml到发酵培养基中，于 320C、150r/min转速下放入恒温震荡培养箱中培养Mh，下调温度至，继续培养36h。(5)纤维素酶提取将搅拌发酵后的发酵液通过板框压滤，滤布目数为768，压滤速率为5吨/小时。压滤 后的发酵液再经超滤浓缩，使滤液浓度浓缩为原来的15-20倍。浓缩后的滤液经喷雾干燥 后制得纤维素酶干粉。
2.如权利要求( 所诉，其特征在于所用的产孢子培养基为PDA斜面培养基。
3.如权利要求(3)所诉，其特征在于以玉米芯为碳源，麦芽糖为辅助碳源，蛋白胨为氮 源时产酶效率最高。
4.如权利要求(4)所诉，其特征在于利用变温调控培养(前24h控制温度32°C，后36h 控制温度)能使发酵产率和速度达到最大化。
5.如权利要求(5)所诉，其特征在于用喷雾干燥温度为175°C，时间为3-8秒。
全文摘要
本发明提供了一种新的纤维素酶生产方法，其步骤包括将黑曲霉接种到产孢子培养基中培养4d，培养完成后制成菌悬液，取15ml接种到配有200ml液体发酵培养基的1L三角瓶中，于32℃、150r/min转速下放于恒温震荡培养箱中培养24h，然后降低温度到28℃继续培养36h。发酵液经板框过滤，超滤浓缩和喷雾干燥制得纤维素酶干粉。本发明操作工艺简单，原料易得，生产成本低，无污染，为一种理想的纤维素酶制取方法。
文档编号C12R1/685GK102071179SQ200910154638
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者史利斌, 吴菁 申请人:湖州来色生物基因工程有限公司