专利名称：两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁新标记的开发及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于棉花育种领域，涉及两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁的新标记引物序列、特异序列和制备技术及应用。利用这些引物序列和特异序列进行棉花三系恢复基因的遗传鉴定、分子遗传连锁图构建和棉花恢复基因分子标记辅助育种，本发明公开了两个标记引物序列及扩增DNA片段序列。
背景技术：
利用棉花细胞质雄性不育生产杂交种具有省工、省时和成本低等优点，因此“三系”配套生产棉花杂交种已成为一种必然趋势。目前国内外已经选育出了哈克尼西棉、三裂棉、异常棉、亚洲棉和陆地棉等不育系，其中哈克尼西棉、三裂棉和陆地棉的不育系实现了三系配套。已有研究表明哈克尼西棉不育胞质对杂种后代的产量有不利影响，在生产应用上没有取得实质性进展。2005年，本课题组首次研究培育出了第一个国家审定的比常规抗虫棉增产沈.4%的三系杂交抗虫棉新品种，在生产上不但解决了棉铃虫的危害，而且促使棉花产量大幅度的提高。目前国内外报道了哈克尼西棉、三裂棉、 104-7A和晋A不育系恢复基因的遗传连锁的分子标记。Guo等(1998年)使用RAPD-PCR 技术分析(0-613-2RXSimiar^)的BC3回交群体中找到了一个与恢复基因紧密连锁的标记 0PV-15300，并计算出与恢复基因的重组率为13.0士2. 57%。Lan等(2001年)人同样也使用了 RAPD-PCR技术，通过分析一对近等基因系HAF277 (恢复系)和DELC0T277 (CMS)，发现了 1个与Rf连锁的RAPD标记UBC6592，其与Rf遗传距离为2. 3cM ；这个标记克隆测序后被定位到RFLP高密度图谱上，连锁分析表明这个标记与Rf基因的遗传距离为6. OcM0 Liu等 (2003年)使用BSA和GRA结合的方法，对陆地棉细胞质不育系和恢复系杂交Fl代自交后的F2代群体进行RAPD和SSR筛选，结果找到3个SSR标记和2个RAPD标记与Rf1紧密连锁，但与恢复基因Rf1没有共分离，并使用非整倍体将Rf1基因定位在第4条染色体的长臂上。^iang (2001年)使用RAPD标记和BSA分析CMS-D8恢复系，找到了与Rf2紧密连锁的标记UBCIII3qqq和UBC1885( ，遗传连锁分析UBC1885(1(1与Rf2的平均遗传距离为2. 9cM ；并同另外两个标记UBC1697Q(^nUBC65915( 共同转化为STS标记。Feng C D等^)05年)使用 RAPD和BSA技术分析(B416RXArk8518) XArk8518群体(恢复系B416R携带有D2-2染色体组上恢复基因Rf1)，发现3个RAPD标记UBC14714QQ，UBC607500和UBC679·与Rf1紧密连锁，其中 UBC169700 和 UBC16 9800 与 Rf1 的遗传距离为 4. 5cM，UBC6591500 距离 Rf1 为 2. 7cM，并将其转化为STS标记。Yin等(2006年)在三个BC1同交群体(不育系亲本的遗传来源为 104-7A)中筛选了 2250对SSR引物，找到5个新的与Rf1基因紧密连锁的SSR标记，并将前人发表的3个STS标记整合构建了包含有13个与恢复基因相关标记的高精细分辨率遗传图谱，构建了恢复系的BAC文库，使用这些标记为探针从BAC文库中筛选到50个克隆，平均每个克隆的插入片段大小为120Kb，并将遗传图谱和物理图谱紧密联系起来，最终将Rf1 基因定位在两个BAC克隆重叠区域的IOOKb之间。Wang等(2007年)人使用RAPD、AFLP, STS、CAPS和SSR标记技术分析了(D8XSG747) XSG747群体，发现了三个新的RAPD标记 UBC352900,UBC683500,UBC722750 和一个 SSR 标记 CIR17%5(I，并将 UBC72275(I 转化为 CAPS 标记， 使用PI3R基序设计的保守引物与AFLP组合测试回交群体得到一个PPR-AFLP标记与恢复基因Rf2连锁，结合9个与Rf2紧密连锁的分子标记构建了与Rf2紧密连锁的遗传图谱；由于 CIR17 9250与Rf2紧密连锁，同时又与Rf1紧密连锁，并推测Rf1和Rf2都定位与D亚染色体组的LGD08连锁群上(现命名为D5染色体)。李朋波等(2007年)人对晋A衍生的不育系和恢复系组配的分离群体进行遗传和定位分析，表明‘晋A’恢复基因在F2和BC1的分离比例分别符合3 1和1 1，证明恢复基因由1对显性基因控制，用9个SSR标记和4个 STS标记构建了长度为83. IcM的遗传图谱，将恢复基因Rf1定位于第19染色体上(LGD08) 与最近的标记CM042和CIR179分别相距5. 4cM和10. 3cM。而本课题组自主选育的抗虫三系杂交棉亲本P30A细胞质雄性不育系(胞质来源于104-7A)和Y18R恢复系(恢复基因来源于0-613-2R)的遗传背景均不同于前四者，申请者首次构建了其恢复基因的遗传图谱， 从棉花微卫星数据库搜索单一 EST序列侧翼SSR引物，对棉花(P30AXY18R) XP30B回交群体进行育性分析，Mapmaker软件计算与恢复基因连锁的遗传距离，获得与恢复基因紧密连锁的新标记MGHES28 ；基于BAC克隆HZ-170-M6右末端序列设计STS引物，长度为505bp，对棉花(P30AXY18R) XP30B回交群体进行育性分析，Mapmaker软件计算与恢复基因连锁的遗传距离，获得与恢复基因紧密连锁的新标记STSHY27 ；并将两个新标记应用于恢复基因的分子鉴定。发明内容本发明的目的在于开发与抗虫三系杂交棉恢复基因紧密连锁新的分子标记，将该标记应用于构建恢复基因的遗传图谱和分子标记辅助选育优良恢复系。利用该标记有目的的发掘利用新的遗传基因资源，拓宽恢复谱，提高三系杂交棉优良基因的聚合选择效率。为实现上述目的，本发明设计以下技术措施 构建棉花(P30AXY18R) XP30B回交群体BC1F1代共369个单株。田间调查育性分离比例，其中可育株为180株，不育株为189株，卡方测验表明(X2 = 0. 11，P>0.95)，本材料育性恢复基因由一对显性基因控制。在此基础上申请者通过作图开发了两个新的与恢复基因紧密连锁的分子标记MGHES28和STSHY27，可以准确的鉴定陆地棉细胞质雄性不育恢复基因Rfl。利用这两个新标记可用于分子标记辅助选育优良恢复系。1.育性分离群体DNA混合池的构建提取棉花(P30AXY18R) XP30B回交群体BC1F1代共369个单株基因组DNA，分别构建不育DNA混合池和可育DNA混合池，每个混合池由5个单株构成。2.恢复基因分子标记的PCR引物设计申请人:发明的陆地棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记MGHES28引物序列分别为SEQ IDNO :1和SEQ ID NO :2 ;STSHY27引物序列分别为SEQ ID NO 3禾P SEQ ID NO :4。申请人所开发的MGHES28标记扩增的特异DNA片段如序列SEQ ID NO :5所述， STSHY27标记扩增的特异DNA片段如序列SEQ ID NO 6所述。
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；菌种保存名称 HZ-170-M6 ；地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所；菌株分类命名 Escherichia coli ；保藏日期2009 年 07 月 3 日；保藏编号CGMCCNo. 3160。3. PCR反应体系的建立EST-SSR 标记分析标准PCR反应体系为20 μ L，组成如下Templatel.OyL
IOXTaq buffer2. 0μ L
dNTP (2. 5mM)1. 6μ L
Forward Primer(10 μ Μ)l.OyL
Reverse Primer(10 μ Μ)l.OyL
Taq 酶(2. 5U/ μ L)0. 5μ L
(MH2O11. 9μ L
Total20 μ L
PCR反应热循环程序为
1)94°C预变性anin，
2)94°C变性 30s，
3)55°C退火30s，
4)72°C延伸30s，
5)Goto step2,35 cycle ；
6)72°C延伸 7min。
7)4°C保存 STS标记分析
标准PCR反应体系为20 μ L，组成如下 Templatel.OuL
IOXTaq buffer2. 0 μ L
dNTP(2. 5mM)1. 6μ L
Forward Primer(10 μ Μ) 1· 0 μ L Reverse Primer(IOyM) l.OyL Taq 酶(2. 5U/ μ L)0. 5 μ L
ddH2011. 9μ L
Total20 μ L
PCR反应热循环程序为
1)94°C预变性anin，
2)94°C变性 30s，
3)55°C退火30s，
4)72°C延伸60s，
5)Goto step2,35 cycle
6)72°C延伸 7min。
7)4°C保存
4.扩增产物DNA片段检测
1)分别以可育DNA混合池和不育DNA混合池为模板，MGHES28和STSHY27 行PCR扩增，产物分别在5. 0%的聚丙烯胺胶和1. 0%的琼脂糖胶上电泳。
2)聚丙烯胺胶电泳电压为2000V，预电泳30min，上样8 μ L，电泳时间lh。
引物进琼脂糖胶电泳电压为120V，时间为lh。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。3)将扩增PCR产物回收测序。5.标记与恢复基因遗传距离的确定1)以构建好的同交群体不育单株DNA为模板，MGHES^和STSHY27引物检测重组体个数。2)，统计分析，Mapmaker软件计算遗传重组距离。MGHES^标记与恢复基因遗传距离为2. 4cM0 STSHY27与恢复基因遗传距离为2. IcM06.标记应用于不同恢复系、保持系和不育系的鉴定1)分别以不同恢复系、保持系和不育系DNA为模板，MGHES^和STSHY27引物进行 PCR扩增。扩增产物分别在5. 0%的聚丙烯胺胶和1. 0%的琼脂糖胶上电泳。2)聚丙烯胺胶电泳电压为2000V，预电泳30min，上样8 μ L，电泳时间lh。琼脂糖胶电泳电压为120V，时间为lh。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。
具体实施方式
实施例1 总DNA的提取参考孙鑫等报道的SDS-CTAB法提取棉花总DNA。1)提取液配制IL 提取液含Tris_HCl (PH8. 0) 0. IMEDTA (PH8. 0)0. 02MNaCl1. 5MPVP40 (w/v)2%CTAB (w/v)2%以上溶液各自溶解后混合，定容到IL ；临用前加2% β-巯基乙醇。2)称取0. 3g幼嫩棉花叶片放入2mL离心管里，加入钢珠，液氮速冻后，放置于 Genegrid研磨仪上振荡30s，加入ImL预热65°C提取缓冲液。颠倒混勻。3)将溶液置于65°C水浴中40min;加等体积氯仿异戊醇Q4 1，V/V)振荡混勻，4°C离心机12000rpm离心lOmin，将上清转移到另一离心管中，用氯仿异丙醇 (24 1，V/V)再抽提一次，离心收集上清；4)加入0. 6倍体积的冰预冷的异丙醇，缓慢颠倒离心管混勻，室温静置30min。用毛细管将絮状DNA挑出，或者直接室温12000rpm离心lOmin，用70%的酒精洗涤1_2次，再用100%酒精洗涤1次，室温干燥DNA。5)加 200 μ L TE (IOmM Tris-HCl, 1mM EDTA, ΡΗ8. 0)或者纯水(ddH20)，室温放置 1小时，或者65°C水浴使DNA完全溶解；6)加入20 μ L无DNA酶的RNA酶水(10mg/mL)，37°C保温1小时，用等体积的酚 氯仿异戊醇05 24 1, V/V)抽提1 2次，将上清转移到另一个离心管中；7)加0. 1倍体积的3M NaAc (PH5. 2)，2倍体积的冰预冷的无水乙醇，混勻后放置5 分钟。缓缓水平转离心管5分钟，此时将于界面处形成一团粘稠透明的絮状沉淀用毛细管轻轻钩出，转移到1. 5mL的离心管中；或者直接12000rpm离心lOmin，沉淀DNA。8)加lmL70%的酒精洗涤沉淀，IOOOOg离心lOmin，去掉上清，再用70%、100%的酒精各洗沉淀一次，在空气中使核酸沉淀干燥；9)用50 μ L的TE重新溶解沉淀，于_20 V或_70 V贮存。
实例2 =EST-SSR标记分析育性分离群体DNA混合池的构建田间调查棉花(P30AXY18R) XP30B回交群体BC1F1代共369个单株育性分离情况，分别挂牌标记可育株和不育株，提取单株基因组DNA，分别构建不育和可育DNA混合池， 每个混合池由5个单株构成。所构建不育和可育DNA混合池用于EST-SSR分子标记分析。PCR反应体系的建立和热循环程序主要参考Yin等方法。试验设计如下标准PCR反应体系为20 μ L，组成如下Templatel.OyLIOXTaq buffer2. 0 μ LdNTP(2. 5mM)1. 6μ LForward Primer (10 μ Μ) l.OyLReverse Primer(IOyM) l.OyLTaq 酶(2. 5U/ μ L)0. 5 μ LddH2011. 9μ L_Total20 μ LPCR反应热循环程序为1)94°C预变性 2min，2) 94 °C 变性 30s，3) 55°C退火 30s，4) 72°C 延伸 30s，5) Go to st印2, 35 cycle ；6)72°〇延伸7111土11。7)4°C 保存引物的筛选从棉花微卫星数据库下载98对名称为MGHES的EST-SSR引物，分别以棉花可育 DNA和不育DNA混合池为模板进行PCR扩增，PCR产物在5. 0%的聚丙烯胺胶上电泳。聚丙烯胺胶电泳电压为2000V，预电泳30min，上样8 μ L，电泳时间lh。琼脂糖胶电泳电压为 120V，时间为lh。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。回交群体BC1F1分离群体的EST-SSR标记分析用在可育和不育DNA混合池中表现多态性的引物进行BC1F1群体369个单株进行 PCR扩增和聚丙烯胺凝胶电泳，检测BC1F1群体多态性。EST-SSR引物扩增特异DNA片段的回收测序从聚丙酰胺胶切下PCR扩增的特异DNA片段，用无菌枪头将胶捣碎，加入50 μ L无菌ddH20溶解于室温放置1天，然后离心以沉淀胶块，吸取上清液，加入两倍体积无水乙醇沉淀过夜。15000rpm离心沉淀DNA，弃废液，晾干DNA，加10 μ L无菌ddH20溶解，取1 μ L作模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒回收DNA，送北京中国农科院重大工程开放实验室测序部测序。
实例3 :STSHY27标记分析育性分离群体DNA混合池的构建田间 查棉花(P30AXY18R) XP30B回交群体BC1F1代共369个单株育性分离情况，分别挂牌标记可育株和不育株，提取单株基因组DNA，分别构建不育和可育DNA混合池，每个混合池由5个单株构成。所构建不育和可育DNA混合池用于EST-SSR分子标记分析。PCR反应体系的建立和热循环程序主要参考Yin等方法。试验设计如下标准PCR反应体系为20 μ L，组成如下Templatel.OyLIOXTaq buffer2. 0 μ LdNTP(2. 5mM)1. 6μ LForward Primer(IOyM) l.OyLReverse Primer(IOyM) l.OyLTaq 酶(2. 5U/μ L)0. 5 μ LddH2011. 9μ L_Total20 μ LPCR反应热循环程序为1)94°C预变性 2min，2)94°C变性 30s，3) 55°C退火 30s，4) 72°C延伸 60s，5)Go to st印2, 35 cycle ；6)721延伸7111土11。7)4°C 保存引物的筛选根据5个标记所筛选到的21个阳性BAC克隆末端序列设计32对STS引物，扩增片段大小在200 600bp，分别以棉花可育DNA和不育DNA混合池为模板进行PCR扩增，PCR 产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳。电压为100V，电泳时间lh。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果(图2)。回交群体BC1F1分离群体的STS标记分析用在可育和不育DNA混合池中表现多态性的引物进行BC1F1群体369个单株进行 PCR扩增和聚丙烯胺凝胶电泳，检测BC1F1群体多态性。 STS引物扩增特异DNA片段的回收测序从琼脂糖凝胶切下PCR扩增特异DNA片段，用DNA回收试剂盒回收DNA，送北京中国农科院重大工程开放实验室测序部测序。实例4数据分析遗传分析
共调查了配制(P30AXY18R) XP30B回交群体369个单株的育性，其中180株为可育，记为1 ;189株为不育，记为0。卡方测验分析，群体分离比符合1 1(X2 = 0. 11，P> 0. 95)，完全符合一对显性基因模型。遗传连锁分析1)将两个标记对回交群体中34个可育和不育DNA混合池进行PCR扩增，统计重组体个数。MGHES^标记分析回交群体中出现了 17个重组体，可育与不育的比例为 197 172，符合1 1的分离比例。STSHY27标记分析回交群体中出现了 13个重组体，可育与不育的比例为193 176，符合1 1的分离比例。2)将MGHES^和STSHY27标记分析回交群体中出现的特异带有无情况输入计算机，运行Mapmaker软件，计算两个标记与恢复基因的遗传距离。结果.MGHES^标记与恢复基因遗传距离为2. 4cM ；STSHY27与恢复基因遗传距离为2. IcM(图3)。实例5分子标记应用于不同恢复系、保持系和不育系的鉴定1)提取不同恢复系(R1，R2，R3，R4，R5)、保持系(B1，B2，B3，B4，B5)和不育系(Al， A2，A3，A4，A5)以及Y18恢复系(Pl)和不育系P30A(P2)的基因组DNA。2)以不同恢复系(R1, R2，R3，R4，R5)、保持系(Bi, B2，B3，B4，B5)和不育系(Al， A2，A3，A4，A5)的基因组DNA为模板，MGHES28和STSHY27引物分别进行PCR扩增。扩增产物分别在5. 0%的聚丙烯胺胶和1. 0%的琼脂糖胶上电泳。2)聚丙烯胺胶电泳电压为2000V，预电泳30min，上样8 μ L，电泳时间lh。琼脂糖胶电泳电压为120V，时间为lh。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。3) PCR鉴定结果表明MGHES^和STSHY27引物扩增出特异条带的为恢复系，未扩增出的为保持系和不育系(图4和图5)。
图1为M =DNA标准分子量；IF :MGHES28引物扩增可育DNA混合池；IS为MGHES28 引物扩增不育DNA混合池；箭头所指为特异带。图2为M =DNA标准分子量；F :STSHY27引物扩增可育DNA混合池；S :STSHY27引物扩增不育DNA混合池；箭头所指为特异带。图3为MGHES^和STSHY27标记与恢复基因的遗传图谱。MGHES^标记与恢复基因遗传距离为2. 4cM, STSHY27与恢复基因遗传距离为2. IcM0图4为MGHES^引物在恢复系衍生系、保持系和不育系衍生系的扩增特征。M =DNA 标准分子量；Pl 亲本恢复系Y18 ；P2 亲本不育系P30A ；Al A5 5个不育系衍生系；Bl B5 不同保持系衍生系；Rl R5 不同恢复系衍生系。箭头所指为特异带。图5为STSHY27引物在恢复系衍生系、保持系和不育系衍生系的扩增特征。M =DNA 标准分子量；Pl 亲本恢复系Y18 ；P2 亲本不育系P30A ；Al A5 5个不育系衍生系；Bl B5 不同保持系衍生系；Rl R5 不同恢复系衍生系。箭头所指为特异带。序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记MGHES^正向引物<160>6
<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1cctgcaaacg ctattgatcc<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记MGHES^反向引物<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2cccagactgg tgatgatgaa<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记STSHY27正向引物<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3tcagcttcaa gtaccgagca<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记STSHY27反向引物<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4aatagcccca tagccctagc<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>MGHES28引物扩增特异DNA片段<210>5<211>233<212>DNA<213> 陆地棉恢复系 Y18R(Gossypium hirsutum)<400>5cctgcaaacg ctattgatcc aaagcttaat atctcctgat cccgaactca attggccgag 60
11
ttcagataca acaacaagtt caggattctg gttatgtattgcagcaaccacaattcgatc120
aacagcaaca accacaacag cagcagcagcagcagcagttcttgcatgctggctggtgca180
cctaggcatt acattcatca tcaccagtctgggttcatcatcaccagtctggg233
〈110〉中国农业科学院生物技术研究所
<120>STSHY27引物扩增特异DNA片段
<210>6
<211>505
<212>DNA
〈213〉陆地棉恢复系 Y18R(Gossypium hirsutum)
〈400>6
tcagcttcaa gtaccgagca acatcccatagttctagtgtactcagacaaccacgatcca60
ttcctgtgtg tcgaagaaaa gctgtggcatcaatatggtagtgatcagacggtggacggt120
gaagatctat tgaagccttg ttcgaatctttaattttttattattgagattttgaaggct180
tattgagaaa tctgaagtga aatttgagaagaggaaaagaggagtcatttggtaatgaca240
attggccaga gaatgccatg aacgatagtgactagagttatggaaaaaaa300
aagggagaag aaaaaaaggg ataaagattcaacagatagtagcaaacttactagtggctc360
tacgttggag gaacaaaatg ttcgtagctaaggtatgtccatttcttcttcttcttcttc420
ttcttcttct tcttcttctt cttcttctctcttttttttattcttttcttcctttttgct480
gccctgctag ggctatgggg ctatt
权利要求
1.两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁新标记MGHES^*STSHY27的开发。其步骤包括a).构建(P30AXY18R)XP30B回交群体BC1F1代共369个单株，田间调查育性分离，可育株为180株，不育株为189株，卡方测验(X2 = 0. ILP >0. 95)结果表明，可育与不育分离比例为1 1，完全符合一对显性基因控制的模型。b).SDS-CTAB法提取回交群体BC1F1代共369个单株的棉花叶片基因组DNA。构建可育和不育DNA混合池，每个混合池由5个单株构成。所有构建的可育和不育DNA混合池用于 SSR和STS标记分析。c).MGHES28和STSHY27标记分析回交群体可育和不育DNA混合池，进一步分析回交群体中不育单株出现的重组体。MGHES^和STSHY27标记扩增可育DNA混合池的特异DNA片段回收测序。d).数据分析。
2.两个新标记MGHES^和STSHY27应用于棉花恢复系的分子鉴定。a)提取不同棉花恢复系0 1，1 2，1 3，1 4和1 5)、保持系(Bi，B2，B3，B4和B5)和不育系 (Al, A2, A3, A4 和 A5)叶片基因组 DNA0b)以不同棉花恢复系(R1,R2，R3，R4和R5)、保持系(Bi, B2，B3，B4和B5)和不育系 (Al, A2, A3, A4和A5)叶片基因组DNA为模板，MGHES28和STSHY27标记进行PCR扩增，产物分别在5. 0%聚丙烯胺和1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测。c)MGHES28和STSHY27标记在恢复系中扩增的特异DNA片段可明显的区分恢复系、保持系和不育系。
3.根据权利要求1的分子标记MGHES28引物，其特征在于具有SEQID No. 1和SEQ ID No. 2的核苷酸序列。
4.根据权利要求1的分子标记STSHY^引物，其特征在于具有SEQID No. 3和SEQ ID No. 4的核苷酸序列。
5.根据权利要求1或2或3的分子标记MGHES28，其特征在于具有SEQID No. 5的核苷酸序列。
6.根据权利要求1或2或4的分子标记STSHY27，其特征在于具有SEQID No. 6的核苷酸序列。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述分子标记具有SEQID No. 5的核苷酸序列。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述分子标记具有SEQID No. 6的核苷酸序列。
9.用于SSR分析来获得与棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记MGHES28引物对， 其特征在于具有SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的核苷酸序列。用于STS分析来获得与棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记STSHY27引物对，其特征在于具有SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述用来SSR分析获得棉花细胞质雄性不育恢复基因分子标记 MGHES28引物对扩增的特异DNA片段。其特征在于所获得的分子标记引物对扩增的特异 DNA片段具有SEQ ID No. 5的核苷酸序列。
11.根据权利要求9所述用来STS分析获得棉花细胞质雄性不育恢复基因分子标记 STSHY27引物对扩增的特异DNA片段。其特征在于所获得的分子标记引物对扩增的特异 DNA片段具有SEQ ID No. 6的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种利用SSR和STS技术筛选棉花细胞质雄性不育恢复基因连锁的分子标记的方法和应用。包括步骤a)构建(P30A×Y18R)×P30B回交群体BC1F1代共369个单株。育性分离比符合1∶1，由一对显性基因控制。b)SDS-CTAB法提取(P30A×Y18R)×P30B回交群体BC1F1代共369个单株叶片基因组DNA。分别构建可育和不育DNA混合池，每个DNA混合池由5个单株构成。c)SSR分析或STS分析，并同收SSR或STS标记扩增的特异DNA片段测序。d)数据分析。本发明公开了两个与棉花细胞质雄性不育恢复基因连锁的新标记，所述分子标记具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的核苷酸序列；所述分子标记的引物对具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2或SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。另外，本发明也公开了所述棉花细胞质雄性不育恢复基因连锁分子标记在恢复系分子鉴定中的应用。
文档编号C12P19/34GK102154413SQ20091015726
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月6日 优先权日2009年7月6日
发明者侯思宇, 张锐, 郭三堆 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 郭三堆