专利名称：棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及棉花细胞质雄性不育胞质和可育胞质的分子标记。具体地，本发明涉 及利用RFLP技术筛选棉花细胞质雄性不育胞质和可育胞质的分子标记的方法，以及公布 了所述分子标记的序列。另外，本发明公开了所述分子标记在棉花育种特别是“三系”抗虫 棉育种中的应用。
背景技术：
棉花(G. hirsutum)是我国重要的经济作物。长期以来，棉花杂交种生产需要进行 人工去雄，这项工作费时费力。利用不育系、保持系、恢复系进行“三系配套”育种可以大大 提高棉花育种的效率。2005年本课题组建成我国第一个优质、高产、抗虫棉花三系育种体 系，总体技术达到国际领先水平。利用该项技术体系，本课题组已培育了大量的优质棉花品系。细胞质雄性不育(CMS)是指植物不能产生有功能花粉的现象。1962年，美国育种 家Meyer选育出棉花两个胞质雄性不育系，但不育性不稳定，很难用于制种。1973年他又选 出一个具有哈克尼西棉胞质的雄性不育系，不育性稳定，已三系配套，但恢复系的恢复能力 弱。后来发现了加强修饰恢复基因，并将该基因转育到相应的恢复系中，提高了恢复系的恢 复能力。1985年贾占昌用海岛棉和陆地棉进行杂交，育成细胞质雄性不育系104-7A，不育 度100%，不育性稳定。本课题组所用的不育系P30A是通过保持系P30B与104-7A多代回 交后得到的高代不育系。恢复系Y18R是原不抗虫256R恢复系与sGK321A不育系杂交，从 分离的可育后代中经过多代自交，得到的具有杂交优势的恢复系，其胞质为不育胞质。迄今为止，只有水稻、玉米、小麦、高粱、矮牵牛、小萝卜、向日葵、油菜、甜菜等植物 的不育基因被克隆出来，它们均为线粒体上的嵌合基因。但棉花不育基因的成功克隆尚未 见报道，相关研究报道也较少。巩养仓等分析了哈克尼西棉不育系和保持系线粒体基因组 的差异，发现atpA，nad6，C0XIII等基因的杂交条带存在差异，并在不育系atpA基因编码序 列后发现一段486bp的特异序列。利用分子标记进行辅助选择育种，不仅减少了盲目性，而且可以减少连锁累赘， 提高选择效率。目前常用的分子标记技术依其所用的分子生物学技术，大致可以分为 以Southern杂交技术为核心的分子标记和以PCR技术为核心的分子标记。常用的标记 筛选的方法主要有分离群体分群分析法(Bulked SegregantAnalysis)和近等基因系法 (Near-isogenic Lines)0随着生物技术的发展，棉花的分子标记的研究也日渐受到关注。目前被广泛应用 于棉花的分子标记技术主要有RFLP，RAPD，AFLP, SSR, STS等，研究的领域涉及遗传图谱的 构建、基因标记和基因定位、亲缘关系分析、品种纯度鉴定、标记辅助选择等多个方面，并取 得了重要进展。
发明内容
本发明目的是以棉花同核异质系细胞质雄性不育系P30A、保持系P30B以及它们 的衍生系为基础，筛选与不育胞质和可育胞质相连锁的分子标记，以期定位棉花不育基因， 为实际生产中三系杂交棉的育种提供辅助手段，并为进一步分离、克隆不育基因奠定基础。本发明的另一个目的是提供与细胞质雄性不育(CMS)相连锁的分子标记；本发明的再一个目的是提供所述的分子标记在棉花育种中的应用。具体地，本发明利用同核异质系细胞质雄性不育系P30A、保持系P30B以及它们 的衍生系为基础，筛选与不育胞质和可育胞质相连锁的分子标记的方法包括如下步骤a).利用同核异质系细胞质雄性不育系P30A、保持系P30B与其他棉花品种进行 杂交，产生衍生系；b).用CTAB法提取不育系和保持系的叶片总DNA ；c). RFLP分析，并对RFLP片段进行克隆和测序；d).将RFLP标记向SCAR标记转化；e).数据分析。其中利用RFLP技术对细胞质雄性不育同核异质系进行筛选，获得RFLP标记，然后将 其转化为SCAR标记，并对衍生系进行分析，从而获得标记与可育胞质和不育胞质之间的关系。根据植物atpA基因的保守序列设计引物，从棉花基因组中扩增出相应条带，用 ROCHE 公司的 DIG HighPrime Labeling and Detection Starter Kit II 对 DNA 片段进行 标记做成探针，用这些探针对P30A、P30B、Y18R及其衍生系的DNA样品的EcoR I.Hind III 酶切产物进行检测，结果atpA基因在三系之间表现出多态性。atpA在不育胞质(不育系和 恢复系)和可育胞质(保持系)中各有两个拷贝，不育胞质中EcoRI限制片段大小分别是 2. 2kb，3. 3kb ；可育胞质中EcoRI限制片段大小分别是2. 3kb，5. Ikb0用atpA 探针继续对衍生系 P53A，P53B, P80A, P80B, S25-4A，S25-4B 进行 RFLP 分 析，发现结果与P30A，P30B之间的差异一致。设计针对atpA基因的反向引物，用反向PCR(IPCR)法分别将以上所述的4条 EcoRI限制片段扩增出来，电泳检测片段大小与预期一致后，将每一条片段迅速与T载体 PMD18-T进行酶连反应，然后转化到感受态细胞(E. coli T0P10)中，在含IPTG、X_gal和氨 苄青霉素的LB培养基上进行转化子筛选，随机挑取20个白色菌落进行液体培养，然后提取 质粒DNA进行酶切鉴定及电泳检测，获得3个能酶切出与IPCR条带大小一致的克隆子，交 由上海生工生物技术公司进行测序，获得atpA基因全部EcoRI限制片段的DNA序列不育 胞质中atpA基因的两条EcoR I限制片段长度分别为2194bp、3297bp ；可育胞质中atpA基 因的两条EcoR I限制片段长度分别为2225bp、5083bp。其中不育胞质中的2194bp片段和 可育胞质中的2225bp片段包含的是全长的atpA基因拷贝；不育胞质中的3297bp片段和 可育胞质中的5083bp片段包含的是截短型的atpA基因拷贝。在不育胞质和可育胞质截短 型atpA编码序列3 ‘端下游分别存在一段555bp和515bp的差异序列，根据这两段序列设 计引物，分别获得用于鉴定不育胞质的SCAR555标记和用于鉴定可育胞质的SCAR515标记， 其扩增片段长度分别是470bp和333bp。利用上述SCAR标记，我们可以快速鉴定“三系”抗 虫棉不同品种的胞质类型。2009年7月27日将分别含有SCAR555和SCAR515DNA片段的 两个菌种保存到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，入册编号分别为=CGMCCNo.3214 禾Π CGMCCNo. 3213。表1用于鉴定可育胞质和不育胞质的SCAR标记分析表
引物名称碱基数引物序列Tm (°C )
权利要求
棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记，其特征在于扩增该分子标记的引物对分别具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于分别具有SEQID No. 1和SEQ ID No. 2 的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述的棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记在育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的分子标记具有SEQID No. 1的核 苷酸序列，可用于鉴定三系杂交棉中的不育系及其不育系的衍生系。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的分子标记具有SEQID No. 1的核 苷酸序列，可用于鉴定三系杂交棉中的恢复系及其恢复系的衍生系。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的分子标记具有SEQID No. 2的核 苷酸序列，可用于鉴定三系杂交棉中的保持系及其保持系的衍生系。
7.用于SCAR分析来获得棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记的引物对，其特征 在于分别具有SEQ IDNo. 3,SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的用于SCAR分析来获得棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子 标记的引物对，其特征在于所获得的分子标记分别具有SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的核 苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及利用RFLP技术鉴定棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记的方法，包括步骤a)利用同核异质系细胞质雄性不育系P30A、保持系P30B、恢复系Y18R与其他棉花品种进行杂交，产生衍生系；b)用CTAB法提取不育系、保持系、恢复系及衍生系的叶片总DNA；c)RFLP分析，并对RFLP片段进行克隆和测序；d)将RFLP标记向SCAR标记转化；e)数据分析。本发明公开了棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记，所述分子标记分别具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列以及棉花雄性不育胞质和可育胞质的分子标记在棉花育种特别是“三系”杂交棉育种中的应用。
文档编号C12N15/11GK101985650SQ20091015742
公开日2011年3月16日 申请日期2009年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者孟志刚, 张晓 , 张锐, 郭三堆 申请人:中国农业科学院生物技术研究所;郭三堆