专利名称：非小细胞肺癌检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域中一种非小细胞肺癌的检测方法及试剂盒，可用于非小细胞 肺癌的判别及临床检测。
背景技术：
癌症是严重威胁人类生命和社会发展的重大疾病，已成为人类死亡的重要原因， 2015年全球预计有900万人死于癌症，2030年这个数字将达到1140万人。2004年-2005年 中国第三次全死因调查显示，我国城乡居民癌症死亡率为135. 88/10万，属世界较高水平， 而且仍呈持续增长的趋势。癌症死亡率比上世纪70年代增加了 83. 1%，比90年代初期增 加了 22. 5%。肺癌是发病率和死亡率最高的一种癌症，其临床上分为小细胞肺癌和非小细胞肺 癌，其中小细胞肺癌占17%，非小细胞肺癌占83%，不同的肺癌类型需要与之相适应的治 疗方法，所以肺癌的分型诊断是肺癌治疗中的关键。以往采用影像学或检测血液中的传统 标志物来检查肺癌，皆存在准确率低的问题。病理学检查虽然可以准确地确认肺癌及肺癌 的类型，但因其需要开胸手术取材而不能作为检查的常规手段。miRNA(microRNA)是一类非编码、内源性的小RNA，长约21 25核苷酸 (nucleotides，nt)。目前已经被发现并被miRBase数据库收录的人类miRNA有695种，绝大 多数miRNA可以通过与靶基因的3-UTR区互补结合，抑制靶基因翻译成蛋白质，进而在细胞 及组织水平影响生物体的发育，并参与多种疾病的发生发展过程。一系列的研究表明miRNA 在细胞成长、细胞分化及凋亡、同源异性盒基因调节、神经元极性、胰岛素分泌、胚胎发育中 的大脑形成及心脏发生、代谢等过程中都发挥着重要作用。成熟miRNA作为体液中客观存 在的标志物，其表达量的检测也将有很重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种通过特异性定量检测标本中成 熟miRNA的含量来判别非小细胞肺癌的简便、实用的方法及成套的试剂盒，可用于非小细 胞肺癌的类型分析及临床检测。本发明所涉及的非小细胞肺癌检测方法，其特征在于提取总RNA(含miRNA)，以 发卡结构引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进 行实时荧光PCR定量检测成标本中特定成熟miRNA的含量，判别非小细胞肺癌的有无和类 型。该检测方法通过以下技术方案实现(1)总RNA提取A、样品处理；B、RNA分离；C、RNA 沉淀；D、RNA洗涤；E、RNA溶解；F、RNA浓度测定；G、RNA电泳检测。(2) RNA的逆转录以一 个包含20-230nt长度的发卡序列和6-30nt特异性序列的引物进行逆转录反应，扩增相应 的成熟miRNA的第一链cDNA。(3)荧光定量PCR检测以miRNA特异性正向引物及通用反 向引物进行实时荧光PCR定量检测标本中特定成熟miRNA的含量。下面将通过一个具体实 施方式详细描述该技术方案。
该技术有以下优点高度特异性，特异的发卡反转录引物确保反应不受其前体及 基因组DNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的miRNA也可精确区分；样品消耗少，仅需 1 IOng的总RNA ；简便快捷，可同时判断非小细胞肺癌的有无及类型。
具体实施例方式实施例一非小细胞肺癌的检测1、总 RNA 提取(1)样品处理取待检患者IOOyL 500μ L血液标本，加ImL TRIzol试剂，反复 混勻；(2) RNA分离室温放置上述样品液10分钟，加入氯仿200 μ L，剧烈振荡约1分钟， 室温静置5分钟，4°C 12000g离心15分钟，小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层， 其中最上层含有RNA组份；(3) RNA沉淀小心吸取上清液约450 μ L至含有600 μ L冰冷异丙醇的新离心管 中，混勻，4°C 12000g离心10分钟；(4) RNA洗涤去上清，加入500 μ L冷冻的75%乙醇，弹起沉淀，4°C 12000g离心5 分钟，去上清，4°C 12000g再离心5分钟，吸去上清液；(5) RNA溶解风干约5 10分钟，加入DEPC处理水约30 μ L，溶解RNA ；(6) RNA浓度测定吸取1 μ L RNA用DEPC水稀释10倍后，在微量分光光度计上测 定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其0D26(1/0D28(1，按照公式计算RNA 浓度，RNA浓度=40ng/μ LXOD260 X稀释倍数；(7) RNA电泳检测Α、变性胶制备取1. 2g琼脂糖加75mL去离子水煮沸，冷却至 70°C左右加入IOmL 10XMops和15mL甲醛及适量溴化乙锭，倒胶至插有梳子的胶板上；B、 电泳缓冲液配制(IXMops)取50mL 10 XMops，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中； C、RNA样品处理取RNA样品约9 μ L，65°C变性IOmin后立即冷却，加入1 μ LlO X RNA上样 缓冲液；D、RNA电泳把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处 理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶观察；(8)所得总RNA可立即使用或放-80°C保存；2、检测用相关引物设计根据非小细胞肺癌标志物的一个序列ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG设计实验所需的 引物如下(1)发卡结构逆转录引物为5 ’ GACCGACATCACGTACACTCCGAGGTACTTACGTGATGTC GGTCCTGAAC 3 ’，前面 55nt 的序 列是发卡结构区，后面6nt的序列是针对miRNAhsa-miR-29am的特异性序列；(2)正向引物为5，ACTGATTTCTTTTGGTGTTCAG 3，；(3)反向引物为5，GACCGACATCACGTACACTCC 3，；3、RNA的逆转录(1)在冰上按如下比例配制RNA及引物混合液上述所得总RNA2 μ L，10 μ M逆转 录引物1 μ L，去RNA酶超纯水7 μ L，总体积为10 μ L ；
(2)混勻上述RNA及引物混合液，短暂离心，放65°C变性10分钟，置冰上2分钟；(3)按如下比例配制反转录反应液RNA及引物混合液10μ L，5X逆转录反应缓冲 液 5 μ L，IOmM dNTPs 4 μ L，25U/ μ L RNA 酶抑制剂 1 μ L, 200U/ μ L M-MLV 逆转录酶 1 μ L，去 RNA酶超纯水4 μ L，总体积为25 μ L ；(4)混勻上述反应混合物，短暂离心，置42°C反应60分钟，95°C 5分钟灭活处理；(5)所得产物是单链cDNA，可立即使用或放置于_20°C保存。4、荧光定量PCR检测反应(1)在冰上按如下比例配制荧光定量PCR的反应液10X荧光定量PCR缓冲液 2 μ L, 5U/ μ L DNA 聚合酶 0. 5 μ L，40 X 荧光定量染料 0. 5 μ L，IOmM dNTPs 2μ ，2μΜ 正向 弓丨物2 μ L，2 μ M反向弓丨物2 μ L，单链cDNA 2 μ L，去RNA酶超纯水9 μ L，总体积为20 μ L ；(2)混勻上述荧光定量PCR的反应液，移至PCR反应管，短暂离心使所有试剂到反 应管底部；(3)荧光定量PCR反应使用标准的三步法进行检测，反应循环设定如下95°C预 变性10分钟；95°C变性10秒钟，57°C退火20秒钟，72°C延伸10秒钟；40个循环；(4)扩增分析按照所用仪器的软件分析扩增曲线及溶解曲线，确定标本中的标 志物的量，判断是否为非小细胞肺癌及小细胞肺癌的种类。
权利要求
1.一种基于miRNA的非小细胞肺癌的检测方法，其特征在于，提取标本中总RNA(含 miRNA)，以发卡结构引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用 反向引物进行实时荧光PCR定量检测标本中特定成熟miRNA的含量，判别是否患有非小细 胞肺癌及种类。
2.根据权利要求1所述的方法，所采用的检测标本包含全血、血清、血浆、唾液、尿液、 组织液原液。
3.根据权利要求1所述的方法，反转录引物采用的是发卡式结构设计，包含发卡互补 区、发卡环状区和特异性序列区，发卡序列的总长度为20-230nt，其中发卡互补区序列长 度为lO-lOOnt，发卡环状区序列长度为lO-lOOnt，成熟miRNA特异性序列区的序列长度为 6-30nto
4.一种基于miRNA的非小细胞肺癌检测试剂盒，其特征在于，包含以下组份⑴发卡 结构逆转录引物；(2)逆转录反应混合物；(3)荧光定量PCR反应混合物；(4)无RNA酶超纯 水。
5.如权利要求4所述的逆转录反应混合物，其特征在于，含有以下任何一种或多种组 份的组合(1)逆转录反应缓冲液，(2)dNTPs, (3)RNA酶抑制剂，(4)逆转录酶，(5)超纯水。
6.如权利要求4所述的荧光定量PCR反应混合物，其特征在于，含有以下任何一种或多 种组份的组合(1)荧光定量PCR缓冲液，(2)DNA聚合酶，(3)荧光染料，(4)dNTPs，(5)正 向引物，(6)反向引物，(7)超纯水。
全文摘要
本发明涉及一种通过血液标本检测非小细胞肺癌的方法及试剂盒。其主要步骤为提取血液中的总RNA(含miRNA)，以发卡结构式引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测标本中特定成熟miRNA的含量，通过特定miRNA的含量来判别是否患有非小细胞肺癌及非小细胞肺癌的类型。本发明具有高特异性、高灵敏度等优点。该方法简便快速，可广泛用于非小细胞肺癌的判别及临床检验。
文档编号C12Q1/68GK101993951SQ20091016306
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者冯长访, 王保君, 赵冬燕 申请人:冯长访;赵冬燕;王保君