专利名称：：抗hcv药物筛选方法
技术领域：
：本发明属于抗病毒药物筛选领域，具体地，涉及在2a型嵌合病毒J6/JFHl感染Huh7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCVcellculture，HCVcc)基础上，以干扰素和利巴韦林为阳性对照，建立抗HCV药物的MTT细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价方法。
背景技术：
：Chiron在长期大量的研究后，1989年将输血后非A非B型肝炎定义为丙型肝炎(h印atitisC)，并分离和确认其病原体为丙型肝炎病毒(HCV)。丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科，肝炎病毒属，为有包膜的单股正链RNA病毒，全长约9.6kb。在过去的20年中，在世界范围内，约有1.7亿人感染HCV。感染HCV的约80%的病例特点是持久性和慢性肝病疾病，20%慢性丙型肝炎患者最终发展成为肝硬化和肝癌。在工业化国家，丙型肝炎病毒相关的终末期肝病现在主要采取肝移植方法。在临床治疗中，干扰素(interferon,IFN)起到了重要的作用，1990年开始用单剂IFN进行慢性丙型肝炎治疗，在10%的病人中产生持续病毒学应答(sustainedvirologicresponse，SVR)。而经过近年用聚乙二醇(PEG)改良的聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)与利巴韦林(ribavirin)联合治疗，病毒学持续应答提高到50%，但是治疗效果仍不理想，利巴韦林在红血球中积累，会伴有溶血性贫血等不良反应，并且1型HCV感染患者SVR率仍然偏低。因此，发展新的高效的治疗具有重大意义。在干扰素治疗发展的同时，最引人注目的研究是在基础研究上建立的支持自主HCVRNA复制的细胞培养系统的发展。1999年，Lohman等人首次报道建立了能在Huh7中自主复制的亚基因组HCVRNA复制子系统，这个复制子系统的不仅应用于针对结构蛋白作为药物靶点的的筛选，同样还用于研究HCVRNA的复制机理。在此基础上，一些学者使用不同的HCV病毒株(H，N，Conl和0)建立了全基因组长度的HCVRNA复制系统。这些复制子系统促进了HCV的研究及抗HCV药物的筛选，但是其不能产生完全的病毒颗粒，所以存在缺陷。在泡疹性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)、HIV或鼠白血病病毒(mouseleukemiavirus,MLV)的基础上与HCVEl和E2蛋白嵌合得到的病毒假病毒系统(HCVpseudotyp印articles，HCV卯)，广泛应用于筛选以包膜蛋白为耙点的抗HCV化合物和免疫研究。但是由于HCVpp本身的结构和来源，HCVpp只能用于HCV感染性的研究而无法研究HCV的复制。复制子系统发展成为一个研究HCV复制和抗病毒药物筛选的重要工具，但是在药物筛选过程有局限性，所以2005年细胞培养系统的出现，无疑是一项突破性的进展。这是从一名爆发性丙型肝炎患者体内分离得到的2a型病毒株JFH1株，不需要适应性突变就能进行自主复制，并感染Huh7人肝癌细胞后，其RNA能在细胞中复制，重组病毒颗粒能分泌至培养液中，且分泌的病毒颗粒对Huh7细胞和黑猩猩具有感染性。其后Brett等人利用J6病毒株的结构蛋白区与JFH1株的非结构蛋白区嵌合产生的病毒J6/JFH1感染由Huh7.5衍生而来的对HCV更易感的Huh7.5.1的体系，对抗HCV药物进行了药效评价。HCV细胞培3养体系的建立是近年来HCV研究中的重大突破，是今后了解HCV完整增殖周期、研究抗HCV治疗方法和开发丙型肝炎疫苗的强有力技术平台。迄今，现有技术中未见有在2a型嵌合病毒J6/JFH1感染Huh7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCVcellculture,HCVcc)基础上，以干扰素和利巴韦林为阳性对照，建立抗HCV药物的MTT细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价方法。
发明内容本发明目的是提供在2a型嵌合病毒J6/JFH1感染Huh7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCVcellculture,HCVcc)基础上，以干扰素和利巴韦林为阳性对照，建立抗HCV药物的MTT细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价方法。利用HCV细胞培养系统对抗HCV药物进行TMTT法细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的抗HCV药物筛选方法，包括下述步骤(1)细胞生长曲线制作，确定最适Huh7.5.1细胞浓度；(2)确定最适感染复数MOI;(3)以IFNE及RBV为阳性对照，建立HCV药物筛选方法(3-1)最佳干扰素(IFN)和利巴韦林(RBV)给药方式选择；(3-2)MTT法检测IFNE及RBV细胞毒性，通过细胞生长抑制率，以Gr即hpadPrism5计算IQ值。(1(:5。半数抑制浓度，将细胞生长抑制50%所需的浓度)；(3-3)HCVPCR荧光定量法检测RNA载量，通过IFN、RBV对HCV复制抑制率，以GraphpadPrism5计算ECs。值。(EC50:半数效应浓度，引起受试对象50%个体产生一种特定效应的药物剂量)(3-4)IFN、RBV抗HCV药效评价，以药物对细胞毒性IC5。和半数致死浓度EC5。，通过计算两者比值得到该药物的治疗指数TI。用MTT法测定细胞生长曲线，确定最佳实验细胞密度。确定最适感染复数MOI是用病毒基因组载量与细胞数量之比计算最适感染复数MOI。对于体外抗HCV药物的筛选，主要从两个方面进行药物的药效评价药物细胞毒性、抗病毒效果。以MTT法检测药物对细胞的毒性得到IC5。，HCVT叫man探针的荧光定量PCR检测方法检测HCV病毒载量得到EC5。，最后计算TI=IC5。/EC5。，进行抗病毒药效评价。对抗HCV药物阳性对照IFN和RBV采用不同给药方式，以达到药物抗HCV的最佳效果，得出结论IFN以先预处理细胞18h后加入病毒、RBV和病毒同时加入可达到最佳抗病毒效果。本发明依靠HCV细胞培养系统，利用2a型嵌合病毒株J6/JFH1感染Huh7.5.1产生有感染性的病毒颗粒这一特点上，对药物进行MTT细胞毒性检测及抗HCV药效评价。下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。图1为Huh7.5.1细胞生长曲线图；图2为感染复数确定图；图3为利巴韦林细胞毒性图；图4为IFNa-lb给药方式图；图5为利巴韦林给药方式图；图6为IFNa-lb抗HCV活性图;图7为利巴韦林抗HCV活性图。具体实施方式实施例1:1、细胞及病毒人肝癌细胞株Huh7.5.1用含15%新生牛血清的DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle，smedium,DMEM)于37。C5%0)2培养箱中培养。病毒J6/JFH1由Huh7.5.1细胞培养培养后，保存于-80°C。2、Huh7.5.1细胞生长曲线采用MTT法测定细胞生长曲线。MTT全称为3-(4，5_二甲基噻唑_2)_2，5_二苯基四氮唑溴盐，以PBS配制，过滤除菌保存。MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，但不能测定细胞绝对数。其原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。以二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10Wls/ml，铺于96孔板(lOOiU/well)。(2)补加培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养，每三天补充50-1001新鲜培养基。设3个重复孔，同时设空白调零组。(3)每天于实验孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培养箱孵育4h后，吸弃上清，加入1501DMSO，震荡溶解10min，用酶标仪测各孔0D49。值。从图可知从3-7天细胞处于指数生长期，并在第3天细胞占板底约80-90%，为药物筛选的最佳密度，因此选择为实验最佳细胞密度。3、最适感染复数(Multiplicityofinfection,MOI)感染复数为感染病毒与细胞数量的比值，可用病毒颗粒(viralparticles，v.p.)或基因组载量(vectorgenome,v.g.)来表示病毒数量。本发明采用病毒基因组载量与细胞数量之比(v.g.number/cell)计算MOI。(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为5X10、ells/ml，铺于24孔板(lml/well)于37°C5%C02培养，贴壁5h。(2)加入感染复数分别为0.5、1、1.5的病毒，感染5小时。(3)用PBS(pH7.4)洗去未吸附的病毒，加入新鲜培养基。(4)于ld、3d、5d、7d、9d分别收集上清，以3000rpm/min离心10min，取澄清上清进行HCVPCR荧光定量检测RNA载量。从图2得出在三个感染复数中，感染复数为1时病毒感染性载量较高，因此选择MOIl为最适感染复数。4、以IFN和RBV为阳性对照，建立抗HCV药物筛选方法利用IFNa-lb与RBV进行阳性对照的选择，主要对两种药物采用MTT法检测细胞毒性与抗HCV药效评价，同时为体外抗HCV药物筛选建立方法。4.1MTT法检测IFNa-lb及利巴韦林细胞毒性(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10、ells/ml，铺于96孔板(lOOiU/well)于37°C5%C02培养，贴壁5h。(2)加入用无血清培养基梯度稀释的药物，8个稀释度，每个梯度设三个重复孔，同时设置空白对照(只含培养基)、细胞对照及药物颜色对照，使培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养箱进行培养。(3)第三天于实验孔加入20ill的5mg/mlMTT溶液，37°C5%C02孵育4小时后，弃去上清，加入150ii1/well的DMSO，振荡溶解lOmin后，于酶标仪上测定0D49。的值，并计算细胞生长抑制率及药物IC5。(IC5。半数抑制浓度，将细胞生长抑制50%所需的浓度)的细胞生长抑制率(％)=a-S，，)xioo对照孔OD值4.2IFNa-lb与RBV给药方式(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10、ells/ml，铺于96孔板(lOOiU/well)于37°C5%C02培养，贴壁5h。(2)加入用无血清培养基梯度稀释的药物，3个稀释度，每个梯度设三个重复孔。对IFNa-lb和RBV两种药各采取三种给药方式加病毒5h时后加入药物、病毒和药物同时加入、药物预处理18h后加入病毒。同时设正常病毒对照组和细胞对照组，使培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养箱进行培养。(3)3d后收集上清3000rpm/min离心10min，取澄清上清进行HCVPCR荧光定量检测RNA载量。计算HCV复制抑制率，并对三种给药方式进行比较。i^复制抑制率(％)=(1_，CV腿S)xlO。对照孔HCVRNA载量4.3IFNa-lb与RBV抗HCV药效评价(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10、ells/ml，铺于96孔板(lOOiU/well)于37°C5%C02培养，贴壁5h。(2)加入用无血清培养基梯度稀释的药物，8个稀释度，每个梯度设三个重复孔。对IFNa-lb和RBV两种药采取选定给药方式，同时设正常病毒对照组和细胞对照组，使培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养箱进行培养。(3)3d后收集上清3000rpm/min离心10min，取澄清上清进行HCVPCR荧光定量检测RNA载量。计算HCV复制抑制率及EC5。(EC5。半数效应浓度，引起受试对象50%个体产生一种特定效应的药物剂量)。表1表示IFNa-lb与利巴韦林抗HCV药效评价数据。表1:IFNa-lb与利巴韦林抗HCV药效评价<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求抗HCV药物筛选方法，包括下述步骤(1)细胞生长曲线制作，确定最适Huh7.5.1细胞浓度；(2)确定最适感染复数MOI；(3)以IFNE及RBV为阳性对照，建立HCV药物筛选方法(3-1)选择最佳干扰素IFN和利巴韦林RBV给药方式；(3-2)MTT法检测IFNE及RBV细胞毒性，通过细胞生长抑制率，以GraphpadPrism5计算IC50值；(3-3)HCVPCR荧光定量法检测RNA载量，通过IFN、RBV对HCV复制抑制率，以GraphpadPrism5计算EC50值；(3-4)IFN、RBV抗HCV药效评价，以药物对细胞毒性IC50和半数致死浓度EC50，通过计算两者比值得到该药物的治疗指数TI。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于用病毒基因组载量与细胞数量之比确定最适感染复数MOI。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于用MTT法测定细胞生长曲线。全文摘要本发明提供了一种以干扰素和利巴韦林为阳性对照，利用2a型嵌合病毒J6/JFH1转染Huh7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCVcellculture，HCVcc)进行体外抗HCV药物筛选的方法。该方法包括确定最适Huh7.5.1细胞浓度、最适感染复数以及最佳干扰素和利巴韦林给药方式；在此基础上分别计算药物对细胞毒性(IC50)和半数致死浓度(EC50)，通过计算两者比值得到该药物的治疗指数(TI)。该方法的建立可以准确、快速、便捷的在体外进行抗HCV药物的筛选，为我国天然药物，化学合成药物等提供了体外抗HCV药物筛选的良好技术平台。文档编号C12Q1/68GK101748219SQ20091016325公开日2010年6月23日申请日期2009年12月29日优先权日2009年12月29日发明者冯悦,刘丽,唐颖蕾,夏雪山,魏大巧申请人:昆明理工大学