专利名称：水产品中致病细菌检测基因芯片试剂盒的制作方法
水产品中致病细菌检测基因芯片试剂盒
賊綱
本发明涉及生物芯片技术检测水产品中致病细菌的装置及方法。
食源性疾病是当今世界上最广泛的公共卫生问题之一，目前已知有200多 种疾病可以通过食物传播，已报道的食源性疾病致病因子有250多种，其中大 部分为细菌、病毒和寄生虫；由致病细菌引起的疾病每年导致成千上万人的死 亡和无法估量的经济损失，因此，致病细菌的快速、准确检测与鉴定是控制细 菌性疾病发生及疾病诊断与治疗的重要手段。
传统的分离培养、形态观察、生理生化、选择培养基等检测病原菌的方法 存在灵敏度低、特异性差、工作量大、耗时长、通量低等显著缺点。目前检验 检疫工作中用于检测和鉴定食源性致病细菌的主要方法有PCR、 Southern Blot 杂交、酶联免疫吸附法(ELISA)等简单的分子生物学和免疫学方法。但是免疫 学技术(如ELISA)灵敏性高，但容易污染，经常出现假阳性；通常采用一种病原 菌一种特异性引物的特定病原体检查的引物特异性PCR技术，虽然可以达到对 单一菌的快速、准确和方便的诊断目的，但在病原菌未明时，需要多种不同引 物进行实验，这对于病原菌的复杂性和PCR程序的多样性来说显然不名够理想; 而且PCR的电泳结果不能作为最终结论，还需要其他探针杂交实验的辅助；以 上这些用于食源性微生物检测的技术和方法都存在诸多技术问题，而且在实际中由于病原微生物种类繁多，上述方法很难同时对多种病原微生物进行高效的 检测。
近年来，随着生物芯片技术的日趋成熟，高效、快速、准确、灵敏的生物 芯片被应用到越来越多的领域如基因序列分析、杂交、基因突变检测及多态性 分析、基因分型、疾病检测、食品微生物检测等；该技术可同时将大量不同的 探针固定于同一支持物上，因而可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核 酸分析；运用生物芯片技术可以克服其它常用传统技术存在的问题，满足在实 际检测工作中的快速、高通量、自动化检测的要求；鉴于生物芯片的这些优点， 国内外己经先后开发了多种生物芯片用于基因突变及多态性分析、基因插入或 缺失、临床诊断、微生物鉴别等多信领域。
发曰月内容
本发明提供水产品中致病细菌检测基因芯片试剂盒。
本发明的技术方案如下水产品中致病细菌检测基因芯片试剂盒检测食源性 致病细菌的方法，其包括以下步骤
(1) 本发明的检测芯片试剂盒由核酸提取试剂、PCR扩增试剂、芯片(附 图)、分子杂交试剂组成。
(2) 根据待测各种致病细菌的特异基因序列设计多对引物和多个改良探 针；所述待测致病菌为霍乱g菌、单核李斯特菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、志 贺氏菌、出血性大肠杆菌(0157:H7)、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、耶尔森氏菌、 溶藻弧菌、哈维氏弧菌、拟态弧菌。
(3) 上述核酸提取试剂可以提取细菌的基因组DNA 用于下一步PCR扩增实验。
(4) 上述PCR扩增试剂可以特异性扩增目标微生物的特征序列，用于分子 杂交。
(5) 上述芯片上的特异性探针通过希夫碱反应结合到醛基修饰的基片上； 各种探针组成致病菌检测阵列，其整体构成水产品中致病细菌检测基因芯片。
(6) 本发明的水产品中致病细菌捡测基因芯片与微阵列芯片扫描仪和水产 品中致病细菌检测系统配套使用。进行检测时，将扩增后的样品DNA置于芯片 上，当目标DNA和探针结合时，通过检测各检测位点的荧光情况对目标微生物 进行定性分析。
本发明与己有技术比较，具有如下优点和效果
首先，本发明针对12种致病菌设计的微阵列芯片可以同时检测12种食源性
致病细菌，达到对水产品进行快速、准确检测的目的。
其次，本发明可以同时检测8个样品，达到快速检测多个样品的目标。 再者，本发明结合PCR技术和生物芯片及分子杂交技术，可以高通量、高灵
敏度的快速进行检验检疫。
國翻
附图
为检测芯片外观；
上述附图序号为1、特异性探针，2、基片
滅雄讨
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述
1、样品DNA提取将增菌培养的菌液摇匀，以DNA提取试剂结合吸附柱法提取样品中的细菌DNA。
2、 PCR扩增细菌DNA:冰上融化PCR反应试剂，按比例与样品DNA混匀， 置于PCR仪上扩增。
3、 杂交将杂交液在42。C溶化后和PCR产物按比例混匀，95。C变性5分 钟，冰浴5分钟。把芯片放入芯片杂交盒，盖上盖片，通过加样孔注入15pl变 性后的杂交液，盖紧杂交盒盖，于杂交仪中42。C杂交2小时。
4、 清洗杂交完的芯片以42。C预热的洗液I和洗液II分别清洗4分钟，再 以42。C预热的蒸馏水清洗一次，1500rpm离心。
5、 芯片扫描及结果判读洗净的芯片使用微阵列扫描仪在水产品中致病细 菌检测分析系统下迸行扫描分析，该系统自动对结果进行判读，给出检测结果。
权利要求
1、水产品中致病细菌检测基因芯片试剂盒，该试剂盒包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、芯片和分子杂交试剂；其特征在于基因芯片基片上固定了针对霍乱弧菌、单核李斯特菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、出血性大肠杆菌(O157:H7)、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、耶尔森氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、拟态弧菌等12种致病细菌的特异性探针。
2、 根据权利要求l所述的水产品中致病细菌检测基因芯片试剂盒，其特征在于 所述芯片可以同时和8个样品的DNA杂交。
3、 根据权利要求l所述的水产品中致病细菌检测基因芯片试剂盒，其特征在于 结果由水产品中致病细菌检测基因芯片分析系统自动判读。
全文摘要
本发明涉及水产品中致病细菌检测基因芯片试剂盒，该试剂盒包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、芯片、分子杂交试剂，构成水产品中食源性致病菌检测芯片试剂盒；其特征在于基片上固定了针对霍乱弧菌、单核李斯特菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、出血性大肠杆菌(O157:H7)、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、耶尔森氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、拟态弧菌等12种致病菌的特异性探针；该试剂盒可以同时检测8个样品中的12种致病菌，检测限低至10CFU/25g样品，检测过程只需18小时；为无公害水产品致病细菌的快速检测提供了理想手段，有良好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101613762SQ20091016373
公开日2009年12月30日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者史雨红, 宋超霞, 游玉容, 范建忠, 闻伟刚, 黄宝福 申请人:宁波博奥生物工程有限公司