在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法

专利名称：在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法
在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法
技术领域：
本发明申请是基于申请日为2004年3月31日，申请号为200480015112.9 (国际申请号为PCT/US2004/010126),发明名称为"在缺乏酶的黑曲霉突变 体中生产生物物质的方法"的专利申请的分案申请。
背景技术：
发明领域
本发明涉及在缺乏酶的黑曲霉G^pwgz7/w m'gw)突变菌株中生产异源 生物物质的方法、获得缺乏酶的黑曲霉突变菌株的方法、以及缺乏酶的黑 曲霉突变菌抹。
相关技术的说明
黑曲霉分泌大量的葡糖淀粉酶。然而，具有蛋白表达和分泌增加的所 需要性状的黑曲霉宿主未必具有用于成功发酵的最合乎需要的特性。由于 需要在回收和纯化令人感兴趣的生物物质期间移出分泌的多重酶或可能伴 随生物物质共同纯化该酶，因此发酵未必是最佳的。
Boel等，1984，五M50J 3: 1097-1102， 1581-1585，公开了对黑曲霉葡糖 淀粉酶(g/d)基因的克隆。Fowler等，1990， Cwt C7e"". 18: 537-545公开了 黑曲霉葡糖淀粉酶(g/a^)基因的缺失。
Korman等，1990， Cwr 17: 203-!217公开了来自黑曲霉泡盛变种
(^sperg7'〃wsvar. mvamoW)的2个a-;定粉酶基因(amyj和awy^)的克隆、 表征鉴定和表达。美国专利号5,252,726公开了来自黑曲霉的2个全长中性 a-淀粉酶基因的克隆。
美国专利号5,252,726公开了来自黑曲霉的部分酸稳定的a-淀粉酶基因 (wa)的克隆。
Pedersen等，2000， Meto6o"c五"g/"een'"g 2: 34-4l，和WO 00/50576 7> 开了在生产葡糖淀粉酶的黑曲霉菌林中编码草酰乙酸水解酶(EC 3.7丄1)的 草酰乙酸水解酶(o^)基因的断裂，其中所得到的菌抹不能生产草酸。
WO 01/68864公开了 pwr-断裂的黑曲霉菌抹缺乏蛋白酶，表明宿主菌抹中z wr表达的缺失可能导致对蛋白水解敏感的可回收蛋白的水平增加。
本发明的目的是提供改善的黑曲霉宿主，其兼备表达商品化的大量生 物物质的能力而缺乏生产可能使令人感兴趣的生物物质的回收和下游加工 过程复杂化的酶。
发明概述
本发明涉及生产异源生物物质的方法，包括
(a) 在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌抹的突变 抹，其中(i)该突变菌林包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括 gAx4和至少一个选自"ra、 awy」、"wy^、 / r T和。fl/ 的基因变体的一种或 多种第二核苷酸序列，以及(ii)当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相
比，该突变菌抹缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、和中性a-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生产；以及
(b) 从培养基回收异源的生物物质。
本发明也涉及缺乏酶的黑曲霉突变菌林和生产缺乏酶的黑曲霉突变菌 泮朱的方法。
具体地，本发明涉及如下方面
1. 一种生产异源生物物质的方法，包括
(a) 在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌抹的突变 体，其中(i)该突变菌抹包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括 g/a4和至少一个选自asa、 am;^4、 amy5、 p吋r或oa/2的基因变体的一种或 多种第二核苷酸序列，以及(ii)当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌抹相
比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、或中性a-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生产；以及
(b) 从培养基回收异源的生物物质。
2. 项1的方法，其中至少一个基因是w"。
3. 项1的方法，其中至少一个基因是amy丄
4. 项1的方法，其中至少一个基因是amy5。
5. 项1的方法，其中至少一个基因是； wr。
6. 项1的方法，其中至少一个基因是oa/z。
7. 项1-6中任何的方法，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是生物聚合物。8. 项7的方法，其中生物聚合物选自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。9. 项8的方法，其中多肽选自抗原、酶、生长因子、激素、免疫扩张 剂、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。10. 项9的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异 构酶、或连4妾酶。11. 项8的方法，其中多糖是壳多糖、肝素、或透明质酸。12. 项l-6中任何的方法，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是代 谢产物。13. 项1的方法，其中第一核苷酸序列包括生物合成或代谢途径。14. 项1-13中任何的方法，其中突变菌株包括至少2个拷贝的编码生 物物质的第 一核苷酸序列。15. 项1-14中任何的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉 菌抹相比，突变菌抹生产至少减少25%的葡糖淀粉酶和选自酸稳定的a-淀 粉酶、中性a-淀粉酶A、或中性a-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一 种或多种酶。16. 项1-14中任何的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉 菌抹相比，该突变菌林完全缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的a-淀 粉酶、中性a-淀粉酶A、或中性a-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶。17. 项1-16中任何的方法，其中该突变菌抹进一步包括编码蛋白质分 解活性的一种或多种基因的变体。18. 项17的方法，其中蛋白质分解活性选自氨肽酶、二肽基氨肽酶、 三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半 胱氨酸蛋白酶、或液泡蛋白酶。19. 项1-17中任何的方法，其中突变菌株进一步包括编码选自糖酶、 羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、 脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖香酶、p-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖 苷酶、卣素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、 脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇 六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、a-l，6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一种或多种基因的变体。20. —种亲本黑曲霉菌抹的突变抹，包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包4舌g/flv4和至少一个选自wa、 flwy^、 am>^、 / wr和oa/z的基因 变体的一种或多种第二核苷酸序列，其中当在相同条件下培养时与亲本黑 曲霉菌抹相比，该突变菌抹缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的oc-淀 粉酶、中性a-淀粉酶A、或中性a-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶。21. 项20的突变菌株，其中至少一个基因是wa。22. 项20的突变菌株，其中至少一个基因是"^y丄23. 项20的突变菌4朱，其中至少一个基因是awjW。24. 项20的突变菌株，其中至少一个基因是pwr。25. 项20的突变菌抹，其中至少一个基因是o"A。26. 项20-25中任何的突变菌林，其中由第一核苷酸序列编码的生物物 质是生物聚合物。27. 项26的突变菌抹，其中生物聚合物选自核酸、聚酰胺、多胺、多 元醇、多肽或多糖。28. 项27的突变菌抹，其中多肽选自抗原、酶、生长因子、激素、免 疫扩张剂、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。29. 项28的突变菌林，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解 酶、异构酶、或连4妄酶。30. 项20-25中任何的突变菌林，其中由第一核苷酸序列编码的生物物 质是代谢产物。31. 项20的突变菌抹，其中第一核苷酸序列包括生物合成或代谢途径。32. 项20-31中任何的突变菌株，其包括至少2个拷贝的编码生物物质 的第一核苷酸序列。33. 项20-32中任何的突变菌抹，当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌 抹相比，其生产至少减少25%的葡糖淀粉酶和选自酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、或中性a-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一种或多种酶。34. 项20-32中任何的突变菌林，当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉 菌抹相比，其完全缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的a-淀粉酶、中 性a-淀粉酶A、或中性a-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶。35. 项20-34中任何的突变菌抹，其进一步包括编码蛋白质分解活性的8一种或多种基因的变体。36. 项35的突变菌林，其中蛋白质分解活性选自氨肽酶、二肽基氨肽 酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、 半胱氨酸蛋白酶、或液泡蛋白酶。37. 项20-36中任何的突变菌抹，其进一步包括编码选自糖酶、羧肽酶、 过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核 糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、 卣素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、 裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、 酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、a-l,6-转葡糖苷酶、转谷氨 酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一种或多种基因的变体。38. —种用于获得亲本黑曲霉菌抹的突变抹的方法，包括(a) 将编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括g/^4和至少一个选 自osa、 cw^丄amy5、 或oa/z的基因变体的一种或多种第二核苷酸序 列导入亲本黑曲霉菌抹；以及(b) 鉴定来自步骤(a)的包括改变的核苷酸序列的突变菌林，其中当在相 同条件下培养时与亲本黑曲霉菌林相比，该突变菌抹缺乏葡糖淀粉酶和至 少一个选自酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀4分酶A、或中性a-淀粉酶B、蛋 白酶、或草酸水解酶的酶的生产。39. 项38的方法，其中至少一个基因是a^。40. 项38的方法，其中至少一个基因是a^yA41. 项38的方法，其中至少一个基因是am^5。42. 项38的方法，其中至少一个基因是/ wr。43. 项38的方法，其中至少一个基因是o^。44. 项38-43中任何的方法，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是 生物聚合物。45. 项44的方法，其中生物聚合物选自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。46. 项45的方法，其中多肽选自抗原、酶、生长因子、激素、免疫扩 张剂、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、和转录因子。47. 项46的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶。48. 项45的方法，其中多糖是壳多糖、肝素、或透明质酸。49. 项38-43中任何的方法，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是 代谢产物。50. 项38的方法，其中第一核苷酸序列包括生物合成或代谢途径。51. 项38-50中任何的方法，其中突变菌林包括至少2个拷贝的编码生 物物质的第 一核苷酸序列。52. 项38-51中任何的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉 菌林相比，该突变菌抹生产至少减少25%的葡糖淀粉酶和选自酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、或中性a-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的 一种或多种酶。53. 项38-51中任何的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉 菌抹相比，该突变菌林完全缺乏葡糖淀粉酶和选自酸稳定的a-淀粉酶、中性 a-淀粉酶A、或中性a-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一种或多种酶。54. 项38-53中任何的方法，其中该突变菌抹进一步包括编码蛋白质分 解活性的一种或多种基因的变体。55. 项54的方法，其中蛋白质分解活性选自氨肽酶、二肽基氨肽酶、 三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半 胱氨酸蛋白酶、或液泡蛋白酶。56. 项38-55中任何的方法，其中突变菌抹进一步包括编码选自糖酶、 羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、 脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、P-半乳糖苦酶、葡萄糖氧化酶、葡糖 苷酶、卣素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、 脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇 六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、a-l,6-转葡糖苷 酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一种或多种基因的变体。附图简述

图1显示pJRoy10的限制图谱。 图2显示pMBin01+的限制图语。 图3显示pJRoyl7的限制图谱。图4.显示pSM0127的限制图镨。
图5.显示pMBin05的限制图谦。
图6.显示pMBin04+的限制图谱。
图7显示pMBin09的限制图"^普。
图8显示pMBin10的限制图语。
图9显示pMBin02的限制图谱。
图10显示pMBin03的限制图谱。
图11显示pMBin08的限制图谱。
图12显示jwtr缺失对蛋白酶活性的影响。
图13显示/ wr缺失对南极假丝酵母(Ca"Wda awtorc"c力脂肪酶B活性
的影响。
图14显示黑曲霉普通宿主菌抹MBinll4、MBin118和MBinl20中嗜热 柱顶孢OSc少to/W/ww ^^^70/ / 7"附)过氧化氢酶生产的比较。
发明详述
本发明涉及生产异源生物物质的方法，包括(a)在适于生产异源生物 物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌林的突变抹，其中(i)该突变菌抹包括编 码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括g/^4和至少一个选自osa、 amj"、 amjW、 pwr和的基因变体(modification)的一种或多种第二核苷酸序列， 和(ii)当在相同条件下培养时，与亲本黑曲霉菌抹相比，该突变菌抹缺乏葡 糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的oc-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、和中性a-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生产；以及(b)从培养基回收异源 的生物物质。
本发明的优点是消除或减少异源生物物质的黑曲霉发酵液体培养基简 单化下游过程中的葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、和中性a-淀4分酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶。
术语"淀粉葡萄糖苷酶"在此定义为糊精6-a-D -葡聚糖水解酶活性，其催 化1,4 -连接的a-D-葡萄糖残基和末端1，4 -连接的a -D-葡萄糖残基链中分支 点的1 ，6-a-D-糖苷连接的内水解。就本发明而言，根据Fagershom和Kalkkinen， 1995,所ofec/z"o/. J; / /.祝oc/zem. 21: 223-231描述的方法确定葡糖淀粉酶活 性，其中利用葡萄糖氧化酶测定试剂盒(Sigma Chemical Co., St Louis, MO)在
iipH4，25。C测量由葡糖淀粉酶从0.1M麦芽三糖产生的葡萄糖。1个单位的葡 糖淀粉酶活性定义为在25。C， pH4每分钟产生l.Ojamol的葡萄糖。
术语"a-淀粉酶活性"在此定义为1，4 -a-D -葡聚糖葡聚糖水解酶活性，其 催化具有3个以上(x-l，4 -连接的葡萄糖单元的多糖在存在水时内水解为麦
芽低聚糖。
术语"酸稳定的a-淀粉酶活性"在此定义为在酸性pH范围中具有最佳活 性的a-淀粉酶活性。为了本发明，利用4，6-亚乙基(G7)-p-硝基苯基(Gl)-a-D -maltoheptaside作为底物，利用Sigma Chemical Co.试剂盒577在pH 4.0 测定酸稳定的a-淀粉酶活性。
术语"中性a-淀粉酶活性"在此定义为在中性pH范围中具有最佳活性的 a-淀粉酶活性。为了本发明，利用4，6-亚乙基(G7)-p-硝基苯基(Gl)-a-D-麦芽 庚糖苷(maltoheptaside)作为底物，利用Sigma Chemical Co.试剂盒577,在 pH 7.0测定中性a-淀粉酶活性。
术语"草酸水解酶"在此定义为在存在水时催化草酰乙酸转化为草酸和 乙酸酯的酶活性。分类该酶为属于EC 3.7.1.1。为了本发明，根据在本文实 施例小节中描述的方法测定草酰乙酸水解酶活性。1个单位的草酰乙酸水解 酶活性定义为在30。C, pH7.5每分钟产生1.0^imol的草酸。
术语"变体"在此定义为在基因或为其转录或翻译所需要的调控元件中 导入、取代、或除去一个或多个核苷酸，以及基因断裂、基因转换、基因 缺失、或g/aj和至少一个选自osa、 am;M、 a^y5、 / W7\和0a/2的基因的 随机或特异的诱变。g/o4基因和osa、 am，)d、 amy5、 ； wr、和/或oa/z基因 的缺失可以是部分或全部的。变体导致g/a4和至少一个选自os"、 "w少J, amy5 、 / wr、和oa/ 的基因的表达的降低或消除。
在优选的方面，变体导致g/o4和至少一个选自 和oo/z的基因的失活。在另一个优选的方面，变体导致g/flj和至少一个选 自wa、 amyJ、 am;^、 / w71、和oa/z的基因的表达降4氐。在另一个优选的方 面，变体导致g/o4和至少一个选自o a、 am_yy4、 am_y5、 ； ^7\或oa/z的基 因的表达降低、消除、或其组合。
在优选的方面，突变包括gAx4和osa的改变。在另一个优选的方面， 突变包括g/a4和amj^的改变。在另一个优选的方面，突变包括g/d和 a^y5的改变。在另一个优选的方面，突变包括g/a4和pwr的改变。在另一个优选的方面，突变包括和oW的改变。
在另一个优选的方面，突变包括g/a4、 osa、和iwyd的改变。在另一 个优选的方面，突变包括g/aj、 wa、和awy5的改变。在另 一个优选的方 面，突变包括g/"j、 m"、和jwtr的改变。在另一个优选的方面，突变包括 g/aj、 os"、和ofl/z的改变。在另一个优选的方面，突变包^舌g/a^、 a/7yd、 和awy5的改变。在另 一个优选的方面，突变包括g/aj 、 amyJ 、和的 改变。在另一个优选的方面，突变包括g/aj、 amjd、和oa/z的改变。在另 一个优选的方面，突变包4舌g/fl^、 amy5、和/ wr的改变。在另一个优选的 方面，突变包括g/a」、"wj万、和o"/z的改变。在另一个优选的方面，突变 包括g/ai 、 pW71、和oa/z的改变。
在另一个优选的方面，突变包括g/a4、 osa、 am)a、和am)必的改变。在 另一个优选的方面，突变包括g/a^、 osa、 a^)必、和； wr的改变。在另一个优 选的方面，突变包括:gAx^ as", pwr、和oo/2的改变。在另一个优选的方面， 突变包括g/a丄osa、 am)W、和pwr的改变。在另一个优选的方面，突变包括 gAx4 、 ora 、 aw:M 、和oa/z的改变。在另 一个优选的方面，突变包4舌、 twyW 、 flmyB 、和/ wr的改变。在另 一个优选的方面，突变包括g/<M 、 ora 、 amyB 、 和oa/2的改变。在另一个优选的方面，突变包括g/a丄amy丄/ wr、和o"/z 的改变。在另一个优选的方面，突变包括g/a4、 aw;/丄aw少万、和oa/z的改变。 在另 一个优选的方面，突变包括g/a4 、 flwy5、 pwr、和oa/z的改变。
在另一个《尤选的方面，突变包4舌g/a4、 osa、 am，yj、 amj必、和/ wr的改 变。在另 一个优选的方面，突变包括g/aj 、 osa 、 am少B 、 ； wr、和oa/z的改变。 在另一个优选的方面，突变包括gAx4、 amy丄amj^、 / ^7\和oa/ 的改变。 在另 一个4尤选的方面，突变包4舌g/a4 、 ora 、 "m，)W 、 aw》必、和o"/z的？文变。 在另 一个优选的方面，突变包招_ g/a^ 、 ora 、 、 ； W71、和o"/ 的改变。
在另一个优选的方面，突变包4舌g/a4、 osa、 awyd、 "mj;5、 pW77、和 oa/z的改变。
术语"缺乏"(deficient)在此定义为当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉 菌抹相比，黑曲霉突变菌林没有产生可检测的葡糖淀粉酶和至少一个选自酸 稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、和中性a-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水 解酶的酶，或备选的，当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌抹相比，优选 产生减少25%，更优选减少至少50%,更优选减少至少75%,以及最优选减少至少95%的葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的a-淀并分酶、中性a-淀粉酶 A、和中性a-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶。可利用在此所描述的 或本领域已知的方法测定由本发明黑曲霉突变菌林产生的酶的水平。
在本发明的方法中，亲本黑曲霉菌林可以是野生型黑曲霉菌林或其突 变林。可以理解术语"黑曲霉，，也包括黑曲霉的品种(参见，例如，Robert A. Samsom和John I. Pitt编，/"啤raZ/ow o/ Modew T^xo"om/c MeAcxis1 Pem'c/〃/麵A/ ez-g7'〃ws C7oswy c加'ow， Harwood Academic Publishers，荷 兰)。在优选的方面，亲本黑曲霉菌林是黑曲霉DSM 12665。
可利用本领域公知的方法，例如插入、断裂、替代或缺失，通过减少 或消除glaA和至少一个选自os<3、 a附)"、a附》必、；7wr和oa/z的基因的表达 构建缺乏酶的黑曲霉突变菌抹。待改变或失活的基因部分可以是例如编码 区或为表达编码区所需要的调控元件。这种基因调节或调控序列的实例可 以是启动子序列或其功能部分，即足够影响基因表达的部分。可能用于改 变的其它调控序列包括但不限于，前导序列、前肽序列、信号序列、转录 终止子、和转录活化子。
可通过基因缺失技术构建黑曲霉突变菌抹来消除或减少和至少一 个选自a 7、 amjd、 "mj^、 pw71和oa/z的基因的表达。基因缺失技术能够 部分或完全除去基因，由此消除其表达。在这种方法中，基因的缺失可利 用已经构建的、连续包含基因侧翼的5'和3'区的质粒而伴随有同源重组。
也可通过在基因或为其转录或翻译所需要的调控元件中导入、取代、 和/或除去一个或多个核苷酸来构建黑曲霉突变菌株。例如，可插入或除去 核苷酸以使得导入终止密码子，除掉起始密码子，或产生开放阅读框的读 框移位。根据本领域已知的方法这种改变可伴随有定点诱变或PCR产生的 诱变。参见例如，Botstein和Shortle， 1985， Sc/ewce 229: 4719; Lo等，1985, /VoceW"g5 o/ 脸"o"a/」ca(ie附7 o/iSWe"cas 6X4 81: 2285; Higuchi等， 1988,齒c/e/d^ i e廳rc/z 16: 7351; Shimada, 1996，Mo/.肠/. 57: 157;Ho等，1989, Ge"e77:61;Horton等，1989， 77: 61;以及Sarkar
和Sommer， 1990,所o 7fec/ w々腦8: 404。
也可通过基因断裂技术，通过将包含与基因同源的核酸片段的整合型 质粒插入令人感兴趣的基因来构建黑曲霉突变菌林，其可能产生同源性区 域的重复并且在复制区域之间结合载体DNA。如果插入的载体分隔了基因的启动子和编码区或打断编码序列以产生无功能的基因产物，这种基因断
裂可消除基因表达。断裂构建体可以只是伴有与基因5'和3，区域同源的可 选择的标记基因。可选择的标记物能够鉴定包含断裂基因的转化体。
也可通过基因转换的方法(参见例如，Iglesias和Trautner, 1983, Mo/ecw/wGewera/GewWcs 189: 73-76)构建黑曲霉突变菌林。例如，在基因 转换方法中，体外诱变处理相应于基因的核苷酸序列以产生有缺陷的核苷 酸序列，然后将其转化入亲本黑曲霉菌抹以产生有缺陷的基因。通过同源 重组，有缺陷的核苷酸序列替代内源的基因。所需要的是有缺陷的基因或 基因片段也包括可用于选择包含有缺陷基因的转化体的标记物。
也可通过已建立的反义技术，利用与基因的核苷酸序列互补的核苷酸 序列(Parish和Stoker， 1997， F五M9 M/cra6/o/ogy154: 151-157)来构建 黑曲霉突变菌林。更具体地说，可通过导入与该基因核苷酸序列互补的核 苷酸序列来减少或消除经黑曲霉菌林的基因表达，其可在菌林中转录并能 够与菌株中产生的mRNA杂交。在容许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂 交的条件下，因此减少或消除了翻译蛋白的数量。
可通过随机或特异的诱变，利用本领域公知的方法来进一步构建黑曲 霉突变菌抹，包括但不限于化学物诱变作用(参见例如，H叩wood， We Zso/加'ow 。/Mwta"fe Me^ocfe Mz.cra6/o/ogy (J.R. Norris和D.W. Ribbons编) 第363-433页，Academic Press,纽约，1970)和转位(参见例如，Youngman 等，1983，A^/.5W. L 4 80: 2305-2309)。可通过使亲本菌抹经 受诱变并且筛选其中基因表达已经减少或消除的突变菌抹来进行基因的改 变。可进行特异或随机的诱变，例如〗吏用合适的物理或化学诱变处理试剂， 使用合适的寡核苷酸，或使DNA序列经受PCR产生的诱变。此外，可使 用这些诱变处理方法的任何组合进行诱变。
胺、N-曱基-N'硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、 N-曱基-N，-亚硝基胍(NTG)O-甲 羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸盐(EMS)、亚硫酸氢钠、曱酸、和核苷酸类似 物。当使用这种试剂时， 一般通过在存在所选择的诱变处理试剂时在适宜 条件下培养待诱变处理的亲本进行诱变，以及选择显示出基因表达减少或 没有表达的突变抹。
在优选的方面，g/^4包括与SEQIDNO: 5具有至少70%，优选至少75%,更优选至少80%，更优选至少85%，最优选至少90%，以及最优选至少95% 同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，g/aJ包括SEQIDNO:5的核苷i^ 列。在另一个最优选的方面，g/a4由SEQIDNO: 5的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，g/a4包括在极低严谨条件，优选低严谨条件， 更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及 最优选极高严谨条件下与SEQIDNO: 5杂交的核苷酸序列。
在优选的方面，am>^4包括与SEQ ID NO: 21具有至少70%，优选至少75°/o， 更优选至少80%,更优选至少85%,最优选至少90%,以及最优选至少95% 同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，amyj包括SEQIDNO: 21的核苷酸 序列。在另一个最优选的方面，amyj由SEQIDNO:21的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，包括在极低严谨条件，优选低严谨条件， 更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及 最优选极高严谨条件下与SEQ ID NO: 21杂交的核苷酸序列。
在优选的方面，包括与SEQ ID NO: 17具有至少70%,优选至少75%, 更优选至少80%，更优选至少85%，最优选至少90%，以及最优选至少95% 同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，包括SEQ ID NO: 17的核苷酸 序列。在另一个最优选的方面，amy5由SEQIDNO:17的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，mM_yB包括在极低严谨条件，优选低严谨条件， 更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及 最优选极高严谨条件下与SEQ ID NO :17杂交的核苷酸序列。
在优选的方面，oa/z包括与SEQ ID NO: 23具有至少70°/。，优选至少75%, 更优选至少80%，更优选至少85%,最优选至少90%,以及最优选至少95% 同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，oa/z包括SEQIDNO:23的核苷^ 列。在另 一个最优选的方面，oa/z由SEQ ID NO: 23的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，oa/r包括在极低严谨条件，优选低严谨条件，更 优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及最 优选极高严谨条件下与SEQ ID NO: 23杂交的核苷酸序列。
在优选的方面，/ w71包括与SEQ ID NO: 13具有至少70%，优选至少75%, 更优选至少80%,更优选至少85%，最优选至少90%,以及最优选至少95% 同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，pwr包括SEQIDNO: 13的核苦,列。在另一个最优选的方面，； wr由SEQIDNO: 13的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，包括在极低严谨条件，优选低严谨条件， 更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及 最优选极高严谨条件下与SEQIDNO: 13杂交的核苷酸序列。
为了本发明，通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman, 1983, 7Va"owa/A^femy t/&4 80: 726-730),利用具有同
一性表的LASERGENE MEGALIGNtm軟件(DNASTAR, Inc" Madison， WI),和下列多个序列对比参数缺口罚分10和缺口长度罚分10来确定2 个核苷酸序列之间的同 一性程度。成对序列对比参数是K元组(Ktuple) = 3 ， 缺口罚分=3，和窗(windows)二20。
在此公开的核苷酸序列或其亚序列，以及其氨基酸序列或其片段可用 来设计核酸探针以从不同属或种的菌抹，根据本领域公知的方法鉴定和克 隆编码涉及透明质酸生物合成的酶的DNA。特别地，这种探针可用于与基 因组或令人感兴趣的属或种的cDNA，按照标准的Southern印迹方法杂交， 以便鉴定和分离其中的相应基因。这种探针可以是比全部序列相当短的， 但应该是至少15,优选至少25，以及更优选是至少35个核香酸长度。也 可使用更长的探针。可使用DNA和RNA探针。 一般标记探针用于检测相 应的基因(例如，用32P、 3H、 35S、生物素或抗生物素蛋白)。
因此，可筛选从这种其它的生物体制备的基因组DNA或cDNA文库的 与如上所述的探针杂交，并且编码透明质酸生物合成途径中的酶的DNA。 可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术分离来自这种其它 生物体的基因组或其它的DNA。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移 并固定到硝化纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与在此公开的核 苷酸序列或其亚序列同源的克隆或DNA,在Southern印迹中使用载体材料。 就本发明而言，杂交表明核酸序列与相应于在此公开的核苷酸序列、其互 补链、或其亚序列的标记核酸探针在极低至极高的严谨条件下杂交。可利 用X光胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，定义极低至极高的严谨条件 为在42。C在5xSSPE， 3%SDS， 20(Vg/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA,以及 对于极低和低严谨为25%曱酰胺、对于中等和中等-高严谨为35°/。曱酰胺、
17或对于高和极高严谨为50%甲酰胺中，按照标准的Southern印迹方法进行 预杂交和杂交。
对于至少100个核苷酸长度的长探针，最后利用2xSSC, 0.2。/。SDS洗 涤载体材料3次，每次15分钟，优选在45。C(极低严谨)、更优选至少在 50。C(低严谨)、更优选至少在55。C(中等严谨)、更优选至少在60。C(中等-高 严谨)、更优选至少在65。C(高严谨)、以及最优选70。C(极高严谨)进行洗涤。
对于大约15个核普酸至大约70个核苷酸长度的短揮:针，严谨状态定义为 在J氐于利用才艮才居Bolton禾口 McCarthy (1962, /Voceed/"gs //ze Ato/o"<af/Jcatfemy o/Sde"cay 48:1390)的算法计算的Tm大约5。C至大约l(TC,在0.9MNaCl， 0.09MTris-HClpH7.6， 6mMEDTA, 0.5%NP-40, lxDenhardt氏溶液，1 mM 焦磷酸钠，lmM磷酸二氢钠，O.lmMATP,和每ml 0.2 mg的酵母RNA中， 按照标准的Southern印迹方法进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。
对于大约15个核苷酸至大约70个核苷酸长度的短探针，在6xSSC加 0.1% SDS中洗涤载体材料15分钟一次，利用6xSSC在低于计算的Tm 5°C 至10。C洗涤两次，每次15分钟。
可从产生酶以改变所选择的黑曲霉菌林中相应基因的其它微生物来源 使用与在此所描述的、涉及生产令人感兴趣的酶的核苷酸序列同源或互补 的核苷酸序列。
在优选的方面，未用可选择的标记物标记涉及在黑曲霉突变菌林中酶 生产的基因变体。
上培养突i林。其中可^择的口标记基因包含侧接其5'和3'末端的重复，i 重复可当突变菌株经受反选择时便于通过同源重组使可选择的标记基因环 化突出(looping out of)。也可通过将包括有缺陷基因的5'和3'区，但缺乏可 选择标记基因的核酸片段导入突变菌抹，然后在反选择培养基上选择经同 源重组，而除去可选择的标记基因。通过同源重组，用缺乏可选择标记基 因的核酸片段替换包含可选择标记基因的有缺陷基因。也可使用本领域已 知的其它方法。
可以理解本发明的方法不限于为获得黑曲霉突变菌林的特定顺序。可 将涉及酶生产的基因变体在构建用于生产生物物质的菌林的任何步骤导入 亲本。优选在导入编码异源生物物质的基因前已经使得黑曲霉突变菌抹成为缺乏酶的。
在本发明进一步的方面，黑曲霉菌抹的突变林可包含附加的改变，例 如可编码对生产，回收或应用特定生物物质有害的物质的其它基因的缺失
或断裂。
在优选的方面，黑曲霉菌抹进一步包括变体，例如编码蛋白质分解活性 的一个或多个基因的断裂或缺失。在更优选的方面，蛋白质分解活性选自氨
肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶(aspergillop印sin)、 丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、和液泡蛋白酶。
在另一个优选的方面，黑曲霉菌林进一步包括变体，例如一个或多个 基因的断裂或缺失，其中该基因编码选自下列的酶糖酶、羧肽酶、过氧 化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核 酸酶，酯酶、半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卣素 过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、 脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、 过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移 酶、a-l，6-转葡糖苷酶、a-l，6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、和木聚糖酶。
在本发明的方法中，当在相同的生产条件下培养时黑曲霉突变菌林优 选生产与相应的亲本黑曲霉菌抹至少相同数量的生物物质。在更优选的方 面，当在相同的生产条件下培养时该突变菌抹比相应的亲本黑曲霉菌林生 产至少多出25%，优选至少多出50%,更优选至少多出75%，以及最优选 地至少多出100°/。的生物物质。
在适于利用该领域已知的方法生产异源生物物质的营养培养基中培养 黑曲霉突变菌抹。例如，可通过摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中、在 合适的培养基和在容许生物物质表达和/或分离的条件下进行小规模的或大 规模的发酵(包括连续、分批、分批饲养、或固态发酵)而培养菌抹。在包括 碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中利用本领域已知的方法进行培养。 可从商业供应商获得合适的培养基或可根据公开的组合物(例如，美国典型 培养物保藏中心的目录)制备合适的培养基。可从培养基直接回收分泌的生 物物质。如果生物物质不是分泌的，可从细胞裂解物获得该生物物质。
可利用本领域已知的特异于该生物物质的方法检测生物物质。这些检测方 法可包括使用特异的抗体、高效液相色谱法、毛细管色谱法、酶产物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如酶活性测定可用来测定该酶的活性。用于测 定酶活性的方法是本领域已知用于许多酶的方法(参见例如，D. Schomburg和 M. Salzmann (编)，五"^ywe //aw^oc^， Springer-Verlag,纟丑约，1990)。
可通过本领域已知的方法分离所得到的生物物质。例如，可通过传统 方法从培养基分离令人感兴趣的多肽，包括但不限于离心、过滤、提取、 喷雾干燥、蒸发或沉淀。可通过本领域已知的多种方法进一步纯化本发明 的分离多肽，包括但不限于色谱法(例如离子交换、亲合的、疏水性的、色 谱聚焦、和大小排阻)、电泳方法(例如预备性的等电聚焦(正F)、差异溶解度 (例如，硫酸铵沉淀)、或提取(参见例如尸rafe/" Pwr折ca"o"， J.-C. Janson和 Lars Ryden编，VCH Publishers,纽约，1989)。可通过例如提取、沉淀、或差 异溶解度、或本领域已知的任何方法从培养基分离令人感兴趣的代谢产物。 然后可利用适于代谢产物的方法进一步纯化分离的代谢产物。
异源的生物物质可以是任何生物聚合物或代谢产物。可通过单个基因 或组成生物合成或代谢途径的一系列基因编码该生物物质。因此，术语"编 码异源生物物质的第一核苷酸序列"可理解为包括涉及该生物物质生产的 一个或多个基因。术语"异源生物物质"在此定义为对宿主菌抹不是天然的生
例如天然多肽的蛋白质序列；或由于通过例如强启动子的重组DNA技术， 核香酸序列或宿主菌林的操作其表达定量改变的天然生物物质。
在本发明的方法中，生物聚合物可以是任何生物聚合物。术语"生物聚 合物，，在此定义为相同、相似或不同亚基(单体)的链(或聚合物)。该生物聚合 物可以是，但不限于核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)、或多糖。
在优选的方面，生物聚合物是多肽。多肽可以是具有令人感兴趣的生物 活性的任何多肽。术语"多肽"在此不是意味着是指特定长度的编码产物，因 此包括肽、寡肽和蛋白质。术语"多肽"也包括两个或多个多肽组合形成编码 的产物。多肽也包括杂合多肽，其包括从至少2个不同多肽获得的部分或全 部多肽序列的组合，其中一个或多个多肽可能与黑曲霉菌林是异源的。多肽 进一步包括上述多肽和杂合多肽的天然存在的等位的和工程化的变体。
优选地，异源的多肽是抗体、抗原、抗菌肽、酶、生长因子、激素、免疫 扩张剂(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白和转录因子。
在优选的方面，异源的多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶。在更优选的方面，多肽是a-葡糖苷酶、氨肽酶、a-淀粉 酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖 基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶，a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖脑 苷脂酶、a-葡糖苷酶、p-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 突变酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚 氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、或木聚糖酶。
在另 一个优选的方面，生物聚合物是胶原或白明胶(gelatin)。
在优选的方面，生物聚合物是多糖。多糖可以是任何多糖，包括但不 限于粘多糖或包含氮的多糖。在更优选的方面，多糖是透明质酸。"透明质 酸，，在此定义为非硫酸化的氨基多糖，其由通过交替的p-l,4和p-l,3糖苷键 连接在一起的N -乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重复二糖 单位组成。透明质酸(hyaluronic acid)亦称透明质酸(hyaluronan)，透明质酸 (hyaluronate)，或HA。在另一个更优选的方面，多糖是壳多糖。在另一个 更优选的方面，多糖是肝素。
在本发明的方法中，代谢产物可以是任何代谢产物。代谢产物可经一 个或多个基因编码。术语"代谢产物"包括初级和次级代谢产物。初级代谢产 物是菌林的原始或总代谢产物，其是关于例如能量代谢、生长和结构。次 级代谢产物是次级代谢的产物(参见例如，R.B. Herbert, 77^说o^m/7^/s o/ 5feco"ii"她励。/ ， Chapman and Hall，纽约，1981)。
初级代谢产物可以是但不限于，氨基酸、脂肪酸、核苷、核香酸、糖、 甘油三酸酯、或维生素。
次级代谢产物可以是但不限于，生物碱、香豆素、类黄酮(flavonoid)、 聚酮化合物(polyketide)、奎宁、类固醇、肽、或碎烯。在优选的方面，次级 代谢产物是抗生素、拒食剂(antifeedant)、诱引剂(attractant)、杀菌剂、杀真 菌剂、激素、杀虫剂、或灭鼠剂(rodenticide)。
在本发明的方法中，黑曲霉菌抹的突变抹是重组菌抹，包括编码异源 生物物质，例如多肽的核苷酸序列，其可有利地用于重组生产该生物物质。 优选用包括编码异源生物物质的核苷酸序列的载体转化菌株，然后将载体 整合到染色体中。"转化，，是指将包括核苷酸序列的载体导入宿主菌抹以使得 该载体保持为染色体的整合部分或作为染色体外自我复制的载体。 一般认 为整合是有利的，因为核苷酸序列更可能稳定地维持在该菌抹中。可通过同源重组，非同源重组、或转位使载体整合到染色体中。
可从任何原核的、真核的、或其它来源，例如原生细菌获得编码异源 生物物质的核苷酸序列。就本发明而言，术语如在此使用的与给定来源相
关的"获得自"(obtained from)是指通过该来源或通过其中已经插入来自该来 源基因的菌林而生产生物物质。
在本发明的方法中，黑曲霉菌林的突变林也可用于黑曲霉菌林中天然 生物物质的重组生产。可通过重组方式生产天然的生物物质，例如将编码 生物物质的基因置于不同启动子的控制下以增强该物质的表达，使用例如 信号序列促进其运输到菌抹外部，或增加编码由黑曲霉菌林正常生产的生 物物质基因的拷贝数。因此，本发明在术语"异源生物物质"的范围内也包括 这种天然生物物质的重组生产，其达到的程度是这种表达包括使用黑曲霉 菌抹的非天然遗传元件，或使用已经操作的天然元件以不是通常存在于宿 主菌抹的方式发挥功能。
用于分离或克隆编码生物物质的核苷酸序列的技术是本领域已知的，并 且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备、或其组合。例如可利用公知的 聚合酶链式反应(PCR)影响从这种基因组DNA克隆核香酸序列。参见例如， Innis等,1990, 户C/ Pratoco/s:」GwzVie to Mef/20A朋d ^p/Zc加'o", Academic Press,纽约。克隆方法可包括切下和分离包括编码生物物质的核苷酸序列的 所需要核酸片段，将该片段插入到载体分子中，以及将重组载体整合到黑曲 霉菌抹中，其中可复制该核苷^列的多个拷贝或克隆。核苷^列可以是 基因组、cDNA、 RNA、半合成的、合成的起源、或其任何组合。
在本发明的方法中，生物物质也可以是融合的多肽，其中另一个多肽 融合在多肽或其片段的N -末端或C -末端。通过将编码多肽的核苷酸序列 (或其部分)与编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合而生产融合多 肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的 编码序列以使得它们在读框内，并且融合多肽的表达是在相同启动子和终 止子的调控之下。
在此定义"核酸构建体"为单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的
邻的核酸节段。当核酸构建体包含为表达编码序列所需的所有调控序列时， 术语核酸构建体与术语表达盒同义。术语"编码序列"在此定义为当置于下列提及的调控序列的控制下转录成为mRNA并且转换为令人感兴趣的生物物 质。 一般通过开放阅读框确定编码序列的边界，其通常从ATG起始密码子 或备选的起始密码子，例如GTG和TTG开始。编码序列可包括但不限于， DNA 、 cDNA和重组的核苦酸序列。
可以多种方式操作编码生物物质的分离核香酸序列以保证生物物质表 达。在将核苷酸序列插入到载体中之前，根据表达载体或黑曲霉宿主菌抹 对核苷酸序列的操作可能是合乎需要的或必须的。利用克隆方法来改变核 苷酸序列的技术是本领域公知的。
将包括编码生物物质的核苷酸序列的核酸构建体可操作地与能够指导 编码序列在本发明的突变黑曲霉菌抹中，在与调控序列相适合的条件下表 达的一个或多个调控序列连接。
术语"调控序列"在此定义为包括对核苷酸序列的编码序列的表达必须 或有利的所有组分。各个调控序列可以是天然的或与编码生物物质的核苷 酸序列是外源的。这种调控序列包括但不限于，前导序列、启动子、信号 肽序列和转录终止子。至少调控序列包括启动子和转录及翻译终止信号。 对调控序列可提供接头以便导入便于连接调控序列和编码生物物质的核苷 酸序列编码区的特异限制酶切位点。
调控序列可以是适当的启动子序列，其由用于表达核苦酸序列的黑曲 霉菌林识别。启动子序列包含介导生物物质表达的转录调控序列。启动子 可以是在突变黑曲霉菌抹中显示转录活性的任何核酸序列，并且可从编码 胞外或胞内生物物质的、与黑曲霉菌抹同源或异源的基因获得。
用于在本发明的方法中指导核酸构建体转录的合适启动子的实例是从 下列基因获得的启动子米曲霉C4wergz7/us w7zae) TAKA淀粉酶、米黑根 毛霉(i /7/zomMcormzW7e/)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸 稳定的a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(^spwgz7/M 。wamoh)葡糖淀粉酶 (g/a4)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、 构巢曲霉(v45perg/〃ws m.dw/a附)乙酰胺酶、镶片镰孑包(Fwsan'ww ve"e"a/wm)淀 粉葡萄糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria (WO 00/56900)、镶片镰孢 Quinn (WO 00/56900)、尖镰孢(i^s^7'ww ox;AS/ orww)胰蛋白酶样蛋白酶
(WO96/00787)、里氏木霉(7Hc/706ferma we"0 P-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二 糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶ni、里氏木霉葡聚糖内切酶iv、里氏木霉葡聚糖内切酶v、 里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉p-木糖苷酶，以及
NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性a-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的 启动子的杂合体)；以及其突变的、截短的、和杂合的启动子。特别优选的 启动子是葡糖淀粉酶、TAKAa-淀粉酶、和NA2-tpi启动子。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由黑曲霉菌抹识别以终止 转录的序列。将终止子序列可操作地与编码异源生物物质的核苷酸序列的 3，末端连接。在黑曲霉菌抹中有功能的任何终止子都可用于本发明。
优选的终止子是从编码米曲霉TAKAa-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构 巢曲霉氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的 基因获得的。
调控序列也可以是合适的前导序列，mRNA的非翻译区，其对于经黑 曲霉菌抹的翻译是很重要的。将前导序列可操作地与编码异源生物物质的 核苷酸序列的5'末端连接。在黑曲霉菌抹中有功能的任何前导序列都可用 于本发明。
优选的前导序列是从编码米曲霉TAKAa-淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖 异构酶的基因获得的。
调控序列也可以是多聚腺苷酸序列，是可操作地与核苷酸序列的3，末 端连接的序列，并且当其转录时，受到黑曲霉菌林识别而作为向转录的 mRNA加入多聚腺苷残基的信号。在黑曲霉菌抹中有功能的任何多聚腺苷 酸序列都可用于本发明。
优选的多聚腺香酸序列是从编码米曲霉TAKAa-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀 粉酶、构巢曲霉氨基苯曱酸合酶、和黑曲霉a-葡糖苷酶的基因获得的。
调控序列也可以是编码与异源多肽氨基末端连接的氨基酸序列的信号 肽编码区，并且指导编码的多肽进入菌抹的分泌途径。核苷酸序列的编码 序列的5'末端可固有地包含在翻译阅读框中天然连接编码分泌多肽的编码 区节段的信号肽编码区。备选地，编码序列的5，末端可包含与编码序列外 源的信号肽编码区。外源的信号肽编码区可能是当编码序列通常不包含信 号肽编码区时所必需的。备选地，外源的信号肽编码区可简单地替代天然 的信号肽编码区以获得分泌增强的多肽。然而，任何指导表达异源多肽进 入黑曲霉菌抹分泌途径的信号肽编码区可用于本发明。
24用于黑曲霉宿主菌林的有效信号肽编码区是从米曲霉TAKAa-淀粉酶、 黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉葡糖a-淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、 特异腐质霉(/h脂'co/a !>wo/era)纤维素酶、和疏棉状腐质霉(/fM脂'co/a /朋wg/"osa)脂肪酶基因获得的信号肽编码区。
调控序列也可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码 区。所得到的多肽称为原酶或原多肽(或有时称为酶原)。前多肽一般是非活 化的并且可通过前肽的催化或自催化切割而从前多肽转化为成熟的活性多 肽。前肽编码区可从米黑根毛霉(及/^omwcor m/e/2e()天冬氨酸蛋白酶基因、 或嗜热毁丝霉(MycWop/^ora Aermo/ /n7a)漆酶基因(WO 95/33836)获得。
其中信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端，前肽区紧接位于多肽 的氨基末端而信号肽区紧接位于前肽区域的氨基末端。
核酸构建体也可包括编码一个或多个有利于指导异源生物物质表达的 因子的一个或多个核苷酸序列，例如转录活化子(例如，反式作用因子)、伴侣 分子、和加工蛋白酶。在黑曲霉菌林中有功能的任何因子都可用于本发明。 编码一种或多种这些因子的核酸不是必须与编码异源生物物质的核苷酸序 列串联的。
也可能需要加入容许调节异源生物物质相对于黑曲霉菌株生长而表达 的调控序列。调节系统的实例是应答化学或物理刺激，包括存在调控化合物 时导致打开或关闭基因表达的调节系统。TAKAa-淀粉酶启动子、黑曲霉葡 糖淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调控序列。调控序列的 其它实例是容许基因增殖的序列，例如随重金属扩增的金属硫蛋白基因。这 样的话，编码异源生物物质的核芬酸序列将可操作地与调控序列连接。
在本发明的方法中，包括核苷酸序列、启动子、及转录和翻译终止信 号的重组表达载体可用于重组生产多肽或其它的生物物质。可将如上所述 的多种核酸和调控序列连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或 多个便利的限制酶切位点以容许在这些位点插入或取代编码多肽或生物物 质的核苷酸序列。备选地，可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载 体的序列的核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在表达载体的产生中， 编码序列位于载体中以便编码序列与用于表达的适当调控序列可操作地连 接，并可能分泌。
重组表达载体可以是任何载体，其可便利地经受重组DNA方法而实现核酸序列的表达。载体的选择一般取决于载体与其中将导入该载体的黑曲 霉菌抹的相容性。载体可以是线性的或封闭的环状质粒。载体可以是自我 复制载体，即以染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复 制，例如质粒，染色体外的元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含 任何用于确保自我复制的方式。备选地，载体可以是当被导入黑曲霉菌抹 时，整合到基因组中并与其已经整合进入的染色体一起复制的载体。此外， 载体系统可以是单个载体或质粒，或两个或多个载体或质粒，其同时包含
将导入黑曲霉菌林基因组的总DNA或转位子。
当导入黑曲霉菌抹时，可将载体整合到菌抹基因组中。对于整合到本 发明的突变黑曲霉菌林基因组中，载体可能依赖于编码异源生物物质的核 苷酸序列，或通过同源或非同源重组将载体稳定整合到基因组中的任何其 它元件。备选地，载体可包含用于通过同源重组到黑曲霉菌林基因组中而 指导整合的附加核苷酸序列。附加的核苷酸序列能够使载体整合到宿主细 胞基因组中染色体的准确位置。为了增加在准确位置整合的可能性，整合 元件优选应包含足够数目的核酸，例如100至1，500个碱基对，优选400至 1,500个i威基对，以及最优选800至1，500个i威基对，其与相应的耙序列是 高度同源的以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与黑曲霉基因组中 的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸 序列。另一方面，载体可通过非同源重组整合到菌抹的基因组中。
对于自我复制，载体可进一步包括能够使载体在所述的黑曲霉中自主 复制的复制原点。
可将如上所述的多种核酸和调控序列连接在一起以产生重组表达载 体，其可包括一个或多个便利的限制酶切位点以容许在这些位点插入或取 代编码异源生物物质的核苷酸序列。备选地，可通过插入序列或包括进入 适当表达载体的序列的核酸构建体来表达编码异源生物物质的核苷酸序 列。在表达载体的产生中，编码序列位于载体中以便编码序列与用于表达 的适当调控序列可操作地连接，并可能分泌。
载体优选包含容许容易选择转化黑曲霉菌株的 一个或多个可选择的标 记物。可选择的标记物是提供抗-微生物性或病毒抗性、重金属抗性、原养型 到营养缺陷型等的基因产物。用于黑曲霉宿主菌林的选择性标记物可选自， 包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、a^B(鸟氨酸氨曱酰基转移酶)、6w(膦丝菌素转乙酰酶)、/zp/2(潮霉素磷酸转移酶)、W'"D(硝酸还原酶)、； ,G(乳清酸
核芬_5，-磷酸酯脱羧酶)、sC(硫酸腺喋呤转移酶)、和&pC(氨基苯曱酸合酶)，
以及来自其它种属的等价物。优选用于黑曲霉菌抹的是构巢曲霉或米曲霉的
a附fl iS和/ yG基因和吸水4连霉菌(5^^ptomycas /^grosco/ z'cws)的fear基因。
载体优选包含容许栽体稳定整合到基因组中或容许载体在菌抹中不依 赖于菌林基因组而自发复制的元件。
"导入，，是指将包括核苷酸序列的载体导入黑曲霉菌株以使得该载体保 持为染色体的整合部分或作为染色体外自我复制的载体。 一般认为整合是 有利的，因为核苷酸序列更可能稳定地维持在该菌抹中。通过同源重组， 非同源重组、或转位使载体整合到染色体中。
将表达载体导入黑曲霉宿主菌抹可包括由以本身已知的方式形成原生 质体、转化原生质体、再生菌抹壁组成的方法。转化曲霉宿主菌抹的合适 方法在EP 238 023和Yelton等，1984， /Voceed/， o/Ae iVa"'owa/v4ca&m;; o/ 5We"cw L/SJ 81: 1470-1474中有描述。
用于连接在此所描述的元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术 人员已知的(参见，例如J.Sambrook, E.F. Fritsch和T. Maniatus， 1989， Mo/ecw/or C7ow'wg， ^丄"6orato^ Afawwa/，第二版,Cold Spring Harbor,纟丑约)。
在本发明的另 一个方面，突变黑曲霉菌株可进一步包含一个或多个第 三核芬酸序列的变体，该第三核苷酸序列编码可能对生产、回收、和/或应 用令人感兴趣的异源生物物质有害的物质。该变体减少或消除了 一个或多 个第三核苷酸序列的表达，产生当在相同条件下培养时比没有改变第三核 苷酸序列的突变菌抹可生产更多异源生物物质的突变菌株。
第三核苷酸序列可以例如编码酶。例如，该酶可以是氨肽酶、a-淀粉酶、 糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基 转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖淀粉 酶、a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突变 酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧 化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。第三核苷 酸序列优选编码蛋白水解酶，例如氨肽酶、羧肽酶、或蛋白酶。
本发明也涉及获得亲本黑曲霉菌抹的突变林的方法，包括(a)在黑曲 霉菌抹中导入第一核苷酸序列，其包括g/a4和至少一个选自osa、 "m;^4、/ wr和oa/z的基因的变体，其分别涉及葡糖淀粉酶、蛋白酶、草酸 水解酶、酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、和中性a-淀粉酶B的生产； 以及(b)鉴定来自步骤(a)的包括改变的核苷酸序列的突变菌抹，其中当在相 同条件下培养时，与亲本黑曲霉相比突变菌抹缺乏葡糖淀粉酶和至少一个 选自酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、和中性a-淀粉酶B、蛋白酶、 和草酸水解酶的酶的生产。
本发明进一步涉及亲本黑曲霉菌抹的突变抹，其包括编码异源生物物 质的第 一核苷酸序列和包括g/aj和至少 一个选自的、 "w;^4 、 aw_y5 、 和oa/z的基因变体的一个或多个第二核苷酸序列，其分别涉及葡糖淀粉酶、 蛋白酶、草酸水解酶、酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、和中性a-淀 粉酶B的生产，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉相比，该突变菌 株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、 和中性a-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生产。
通过下列不应被认为是对本发明范围加以限制的实施例进一步描述本 发明。
实施例
所有的引物和oligos由MWG Biotech, Inc., High Point, NC提供。
用ABI 3700测序仪(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)进行DNA测序。
菌林
所有的菌抹来源于黑曲霉04w^^7/ws m'gw) Bo-1 (DSM 12665)。黑曲霉 Bo-1包括a-l，6转葡糖苷酶基因的突变而导致没有a-1,6 -转葡糖苷酶活性。
培养基和溶液
基本培养基的组成为每升6 g NaN03, 0.52 g KC1, 1.52 g KH2P04， 20 g Noble琼月旨，10 g葡萄糖，0.5 g MgS(V7H20,和1 ml的Cove微量元素。
Cove平板的组成为每升342.3 g蔗糖，20 ml Cove盐(50x)， 10 mM乙酰 胺，15 mM CsCl，和25 g Noble琼脂。
50xCove盐溶液的组成为每升26 g KC1, 26 g MgS04， 76 g KH2P04,和50ml的Cove微量元素。
Cove微量元素溶液的组成为每升0.004 g Na2B4O7'10H2O， 0.4 g CuS04.5H20， 1.2gFeS04'7H20， 0.7 g MnS04'H20， 0.8 g Na2Mo02.2H20和 10gZnSO4.7H2O。
AMG微量金属溶液的组成为每升14.3 g ZnS04'7H20， 2.5 g CuS04.5H20， 0.5gNiCl2, 13.8gFeS04, 8.5 gMnS04和3.0 g柠檬酸。
YP培养基的组成为每升10 g酵母提取物和20 g细菌用(Bacto)蛋白胨。 STC由0.8 M山梨糖醇，50 mMTris, pH 8和50 mM CaCl2组成。 SPTC由每升40% PEG 4000, 0.8 M山梨糖醇，50 mM Tris, pH 8， 50 mM CaCl2组成。
SPC由每升40% PEG 4000,0.8 M山梨糖醇和50 mM CaCl2 pH 4.5组成。 酪蛋白平板的组成为每升7 g NaH2P04'H20 ， 0.5g KC1 ， 0.2 g
MgS04'7H20， 2g酵母提取物，10g葡萄糖，0.5 g Triton X-100， 20 g Noble
琼脂和lOg酪蛋白。
淀粉苯胺蓝平板的组成为每升0.1 g葡萄糖，1 gKH2P04， 0.5 gMgS04，
0.5gKCl, 3gNaN03， O，lg酵母提取物，1ml Cove微量元素，5 g淀粉苯
胺蓝，15gNoble琼脂，和lOOmM甘氨酸pH2.9。
实施例1:转化方法
用限制性内切酶消化下列实施例中所描述的20微克的每一个断裂盒， 利用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAGEN， Inc., Chatsworth， CA)从1°/。琼脂糖 -50 mM Tris碱-50 mM硼酸盐-O.l mM EDTA二钠缓沖液(TBE)凝胶切下和纯 化断裂所待用的片段。用无菌的蒸馏水使总体积达到20pl并且分为4个转化物。
利用下列的方法制备原生质体。使含有补充有5°/。葡萄糖的20 mlYP培 养基的摇瓶接种密度为每ml大约106-108的黑曲霉分生孢子。在34。C (200 rpm)孵育过夜(15-17小时)后，通过用无菌的孩吏孔布MiraclothTM (Calbiochem, San Diego， CA)过滤收集菌丝体，并转入在10-20 ml 1.2 M山梨糖醇中的每 ml 3-5 mg NovozymTM 234的溶液(黑曲霉菌抹JRoy3 、 SMO110和MBinl 11 到MBinl14,参见实施例6-9)或1 M MgS04溶液(黑曲霉菌林MBinl 15到 MBinl20，参见实施例9-12)中。NovozymTM 234的消化一般在37°C ，以80-100rpm的温和摇动进行30-45分钟。使原生质体滤过无菌的Miracloth ,用 1.2 M山梨糖醇(黑曲霉菌4朱MBin111到MBinll4)或2 M山梨糖醇(黑曲霉 菌抹MBinll5到MBinl20)漂洗，并且在3000xg离心10分钟。用10ml 1.2 M山梨糖醇洗涤黑曲霉菌林JRoy3、 SMO110和MBin111到MBinl14两次， 并用10mll.2M山梨糖醇-50mMCaCl2洗涂一次，然后以每mll.2M山梨 糖醇3><107-1><108个原生质体的浓度进行重悬。用30 ml 1 M山梨糖醇洗涤 黑曲霉菌抹MBinl 15到MBinl20 —次，并用30 ml STC洗涤一次，然后重 悬在STC:SPTC:DMSO (8:2:0.1 v/v)中以获得每ml 3xl07-lxl08个原生质体 的浓度。直接使用该黑曲霉原生质体用于随后的转化或在-8(TC冷冻。
在转化该原生质体前，溶解选择的盖层(overlap)并置于50°C。用于； ,G 选择的盖层的组成为每升20 ml Cove盐，273.8 g蔗糖，8 g Noble琼月旨，6 g NaN03，和1 gNZAmine酪蛋白氨基酸，pH 5.5。使用p,G选择盖层来产生所 有的基因断裂。用于am^S选择的盖层的组成为每升20 ml Cove盐(50x), 273.8 g蔗糖，8 g Noble琼月旨，10 mM乙酰胺，和15 mM CsCl。当转化任何表 达质粒时，使用a^/S选择盖层。
将DNA加5|Lil肝素(5mg/ml STC)加入lOOjil的原生质体并置于水上30 分钟。在谱系中黑曲霉MBinl15之前的黑曲霉菌林不接受肝素。在室温下 孵育30分钟前，加入SPC(对于黑曲霉菌抹JRoy3、 SMO110和MBinlll到 MBinl14为250(xl,对于剩余的菌抹为lml)并温和地混合。加入10ml体积 的盖层(50。C)并立即倾倒至选择性平板上。利用/^K7作为可选择标记物的 对基因断裂的选择是补充有1 M蔗糖的基本培养基。在产生黑曲霉MBin111 菌林中，使用组成为每升1M蔗糖，1 g5-氟-乳清酸(5-FOA)，和10mM尿 嘧啶核苷的基本培养基平板。Cove平板用来选择包含表达质粒的转化体。 平板在34。C培养3-7天。
实施例2: Southern分析
从包含补充有5%葡萄糖(以及当适用时为10 mM尿嘧啶核苷)的5 ml YP培养基的15 mm平板收获黑曲霉菌丝体，用10 mM Tris pH 7.4-0.1 mM EDTApH8(TE),利用有侧臂的培养瓶和陶瓷滤器过滤并漂洗，最后置于微 离心试管中，在加速真空下干燥l小时。
利用Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen， Inc.，Chatsworth, CA)分离DNA。消化5 ;微克的分离DNA 2小时(4(V1总体积，4U的特异限制性核酸 内切酶/pl DNA)并且利用TBE緩冲液在1%琼脂糖凝胶上电泳。通过用 0.25MHC1处理，用1.5MNaCl-0.5MNaOH变性，以及用1.5MNaCl-lM Tris, pH 8中和，使凝胶中的DNA片段化，然后在2t)xSSC中转移至MSI MagnaGraph尼龙转移膜上(Micron Separations, Inc., Westborough, MA)。使 DNA紫外交联到膜上并且在20 ml的DIG Easy Hyb(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)中在60。C预杂交1小时。
用PCR DIG才笨针合成试剂盒，如制造商(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)所描述的制备探针，电泳，并从1%低熔点琼脂糖凝胶切下。 在使用前，溶解凝胶并通过煮沸10分钟使探针变性。将总凝胶体积的百分 之十加入杂交緩冲液。将变性探针直接加入DIG Easy Hyb緩冲液并在60°C 杂交过夜。进行杂交后洗涤(在2xSSC中两次，在0.4xSSC中一次，每次为 60 °C ， 10分钟)，利用DIG才t测系统和CPD-Star(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)进行化学发光检测。使用DIG-标记的DNA分子量标示 III(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)作为标准。
实施例3:黑曲霉基因组X文库的构建
才艮据Wahleithner等，1996, Cw reW Gew幼'os. 29: 395-403的方法通过在 盐酸胍中裂解，然后如制造商所描述的在Qiagen Maxiprep柱上(QIAGEN， Inc.,Chatsworth,CA)纯化来分离黑曲霉Bo-l DNA。根据制造商的指导，在 EMBL4(Clonetech， Palo Alto, CA)中产生黑曲霉Bo-1的基因组文库。用 Sm/3A部分消化黑曲霉Bo-1基因组DNA。消化后，DNA在预备的低熔点 琼脂糖凝胶上电泳，从凝胶切下包含8至23-kb DNA的区域。用|3-琼脂水 解酶(New England Biolabs， Waltham， MA)从凝胶提取DNA。如供应商指导所 描述的用EMBL4臂(Clonetech， Palo Alto, CA)连接分离的DNA。用Gigapack Gold II包装试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)体外包装该连接物。测定文库的 滴度，并用大肠杆菌K802细胞扩增该文库(美国典型培养物保藏中心， Rockville， MD)。估计未扩增的文库包含26,500个独立的重组体。
实施例4: p少K7盒的构建
将来自包含于EMBL4的黑曲霉Bo-1基因组文库的大约26,500个噬菌斑复制接种到尼龙滤膜上，并用来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)/ ,G基 因的1.4 kb片段探测。如制造商所描述的纯化并增殖若干阳性克隆。利用 QiagenXMini Prep试剂盒(Qiagen, Inc.，Chatsworth, CA)分离来自阳性克隆的 噬菌体DNA。用几个限制性内切酶消化噬菌体DNA,然后是Southern分析 以鉴定包含/ "G基因的片段。标明为克隆7b的 一个克隆包含黑曲霉 基因(SEQIDNOs: 1 [DNA序列]和2 [推导的氨基酸序列])，在3.5 kb的Wal 片段上包括启动子和终止子序列。
从克隆7b将;^K 基因片段以3.5 kb的片段亚克隆到pUC118中 (Roche Diagnostics Corporation,曼海姆，德国)产生pJRoyl0(图1)。通过用 7&pl和消化从pJRoy10分离的包括启动子和终止子序列的基因。 利用QIAEXII凝胶提取试剂盒，在1。/。琼脂糖TBE凝胶上电泳后，分离在 5，末端包含i&; I位点和在3'末端包含S/ el位点的片l殳并且纯化。
从pJRoyl0PCR扩增/ yG终止子序列的582 bp片段，因此分别在该片 段的5，和3'末端加入5^1和/Cy/ I位点。使用引物1来产生S/ el位点而引 斗勿2力口入i&pl4立点。
引物1: 5'-GGGACTAGTGGATCGAAGTTCTGATGGTTA-3， (SEQ ID NO:3) 引物2: 5，-ATACCGCGGGTTTCAAGGATGGAGATAGGA-3，(SEQIDNO:4)
在50pl反应物中进行PCR扩增，其组成为10ngpJRoyl0质粒DNA， 50 pmol每种引物，2.5 mM各种dATP、 dCTP、 dGTP、和dTTP,具有2.5 mM MgCl2的lxPCR緩沖液(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)，以及2.5 单4立的Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)。在 RoboCycler 40热循环仪(Stratagene, La Jolla， CA)中进行反应，程序为1个循 环的95。C,3分钟；30个循环的95°C, 1分钟，60°C, 1分钟，和72。C,1.5分 钟；以及1个循环的72。C,5分钟。
用和i&pl消化582 bp的PCR产物并如下所述直接〃使用。 通过将黑曲霉基因片段和黑曲霉p,C 终止子片段连接到 pBluescript SK- (Stratagene, La Jolla, CA)的S/ el位点中，以使得； fG在两侧 都与582 bp的终止子序列侧邻来构建质粒？]^^101+ (图2)。从pMBin01+ 分离2696 bp的^el片段，并在1。/。琼脂糖-TBE凝胶上电泳后利用QIAEXII 凝胶提取试剂盒纯化。利用Qiagen QiaPrep8小提或大提试剂盒(Qiagen， Inc.,Chatsworth, CA)分离质粒DNA。然后使用2696 bp的片段构建所有的断裂盒。
实施例5:尿嘧啶核苷营养缺陷型的产生
下列实施例中描述的基因断裂使用黑曲霉基因作为选择性标记。 ; ,G基因编码orotodine-5，-磷酸酯脱羧酶，其赋予在不加入尿嗜咬核芬而生 长的尿嘧啶核香营养缺陷型。通过向如实施例4所描述的标记物末端加入重 复序列使重复使用/ ,G成为可能。通过当对5-FOA进行选择时在直接重复 之间的同源重组而发生/ 少K;的切割(d'Enfert， 1996， Cwrem Gfe"幼b 30: 76-82)。
如实施例4所描述的，断裂盒包含侧4妄582 bp的重复/ ,G终止子序列 的p,G基因。基因断裂后，使每种菌抹在含有10mM尿嘧啶核苷的基本培 养基上传代一次以便除去对p,G基因的选择。从包含10 mM尿嘧啶核苷的 平板收集孢子并且转入包含10 mM尿嘧啶核苷和每升1 g 5-FOA的基本培 养基平板。其中丟失P7K7基因的黑曲霉细胞在存在5-F0A时生长，而保持 该基因的细胞将5-FOA转化为有毒的中间产物5-氟-UMP。从生长迟緩的非 生成孢子集落的菌苔挑选出生长更快速的集落并生成孢子，通过在含有10 mM尿嘧啶核苷和每升1 g 5-FOA的基本培养基平板上传代两次进行分离， 并且选择单个的、生成孢子的集落。如实施例2所描述的进行Southern分 析以保证已经删除WK7基因。在断裂位点留下1个拷贝的j^K7终止子。
实施例6:黑曲霉SMO110 (Ag/a)的构建
从实施例3中所描述的基因组人文库分离8kb片段的黑曲霉葡糖淀粉酶 fe/")基因(SEQ ID NOs: 5 [DNA序歹寸]和6[推导的M^f列]),并亚克隆到 pUC118 (Roche Diagnostics Corporation,曼海姆，德国)中以产生pJRoyl3。将来自 pJRoyl3的包含黑曲霉葡糖淀粉酶基因的4kb S/ el片段和1.8 kb的侧翼DNA 插入pBluescriptSK+中(Stmtagene， La Jolla， CA)以产生pJRoyl7 (图3)。
利用QIAEX II Gel提取试剂盒，在1。/。琼脂糖-TBE凝胶上电泳后，从 pJRoy10分离包含p,G基因的2.3 kb的Spel/^ol片段，并在1。/。琼脂糖-TBE 凝胶上电泳后利用QIAEX II凝胶提取试剂盒纯化。用Klenow (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)补平限制性末端，将该片l殳插入 pJRoyl7的葡糖淀粉酶基因编码区内的万g/11位点以产生质粒pSM0127 (图4)。 pSM0127的2个一I位点之间是分别侧接2.2 kb和2.3 kb的5，和3，葡 糖淀粉酶基因序列的2.3 kb的； 少K7基因。
用消化质粒pSM0127,分离由线性的断裂盒组成的6 kb片段并利 用实施例1中所描述的转化方法用于转化缺失p;/H7的菌林，黑曲霉JRoy3。 利用实施例5中所描述的方法从黑曲霉Bo-l获得黑曲霉JRoy3。获得大约 700个转化体。
从黑曲霉葡糖淀粉酶基因座(起始密码子前直接的1113 bp)PCR扩增包 含葡糖淀粉酶基因启动子的1100 bp片段并且用作Southern印迹分析中的探 针。以引物3和4产生探针,其中引物3与5，末端的S/ el位点杂交，而引 物4在3，末端加入S/ /zI位点。
引物3: 5'-ACTAGTGGCCCTGTACCCAGA-3， (SEQ ID NO: 7)
引物4: 5,画GCATGCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3， (SEQ ID NO: 8)
在50^1的反应物中进行葡糖淀粉酶基因启动子的PCR扩增，其组成为 10ng的pJRoyl7质粒DNA, 50 pmol的每种引物，2.5 mM每种dATP、 dCTP、 dGTP、和dTTP,具有2.5 mMMgCl2的lxPCR緩冲液，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，程序为1个循环的 95。C，3分钟；30个循环的95°C， 1分钟；55°C， 1分钟和72°C， 2分钟；以 及1个循环的72°C, 5分钟。
如实施例2所描述的分离和标记葡糖淀粉酶基因启动子探针。 从如实施例2所描述的700个转化体中的200个制备基因组DNA。用 5^1消化基因组DNA,然后用上述探针，利用实施例2中所描述的方法进 行Southern分析。断裂盒基因替代到葡糖淀粉酶基因座中导致野生型4 kb 的葡糖淀粉酶基因条带增加至6.3kb,这是由于增加了 2.3kb的p,G基因。 鉴定了一个这种转化体并指定为黑曲霉SMOllO。
实施例7:黑曲霉Mbinlll (A/^K ， Ag/")的构建
用与3，末端的Spel位点杂交的引物5和在5'末端加入位点的引物 6从pJRoyl7扩增800 bp片段的黑曲霉葡糖淀粉酶基因终止子。 引物5: 5'画GAGGTCGACGGTATCGATAAG-3， (SEQ ID NO: 9) 引物6: 5，-GCATGCAGATCTCGAGAATACACCGTTCCTCAG-3， (SEQ ID NO: 10)在50^1的反应物中进行g/a基因终止子的PCR扩增，其组成为10 ng pJRoyl7质粒DNA, 50 pmol每种引物，2.5 mM每种dATP、 dCTP、 dGTP、 和dTTP，具有2.5 mM MgCl2的lxPCR緩冲液，以及2.5单位的Taq DNA 聚合酶。在RoboCycler40热循环仪中进行反应，程序为1个循环的95。C，3 分钟；30个循环的95°C， 1分钟，55°C, 1分钟和72°C， 2分钟；以及1个循 环的72。C，5分钟。
如下所述纯化包含葡糖淀粉酶基因终止子的800 bp片段并直接使用。
利用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen, Carlsbad， CA),根据制造商的指 导将葡糖淀粉酶基因启动子(实施例7)和终止子PCR产物亚克隆到pCR2.1 载体中。利用QIAEXII凝胶提取试剂盒，在1。/。琼脂糖-TBE凝胶上电泳后， 分离包含葡糖淀粉酶基因启动子的1.1kb的5^I/X/2oI片段。以同样的方式 分离葡糖淀粉酶基因终止子，然而由于内部的S; /2l位点，用5^IAS^/ I消化 产生554 bp的片段。将启动子和终止子连接到pBluescript SK- (Stratagene, La Jolla， CA)的<S/ eI位点中产生pMBin05(图5)。
通过限制性内切酶消化从pMBin05移出S/ el片段并在P/o琼脂糖-TBE 凝胶上电泳后利用QIAEXII凝胶提取试剂盒纯化。将分离的片段转化入黑 曲霉SMO110 (实施例6)以利用实施例1中所描述的转化方法删除p,G断 裂的葡糖淀粉酶位点。在将转化体接种到5-FOA上来选择减去/ _yK7的表型 前(参见实施例5)，进行生长以在选择前提供更多的时间用于重组。在补充 有5。/。葡萄糖，0.9M蔗糖，和10mM尿嘧啶核苷的5mlYP培养基中在37。C 和100rpm生长24小时。
获得9个转化体，当转入实施例5中所描述的选择培养基时一个保持 / yK7表型。将保持-表型的转化体指定为黑曲霉MBinl 11
对黑曲霉葡糖淀粉酶和/7yK7基因产生探针。利用实施例4中所描述的 相同方法，使用上述的引物3和5来从pJRoyl7PCR扩增g/a基因(包括启 动子和终止子)，使用引物1和2 (参见实施例4)来从pJRoy10扩增终 止子序列。如实施例2所描述的分离和标记探针。
如实施例2所描述的，从黑曲霉菌抹JRoy3、 SMOllO、和MBinlll分 离基因组DNA，用5^1消化，并根据实施例2所描述的用于Southern分析 的方法用黑曲霉葡糖淀粉酶基因检测。在黑曲霉JRoy3中观察到表示未断 裂的gla基因座的4 kb条带和6.3 kb的条带，这是由于插入了从黑曲霉SMO110获得的断裂盒。用来自黑曲霉MBinlll的基因组DNA没有检测到 杂交，表示已经缺失了葡糖淀粉酶基因。此外，用p,G终止子序列检测用 SpeI消化的DNA，再次没有在黑曲霉MBinlll菌林中观察到杂交，但是黑 曲霉SMO110保持有6.3 kb的条带。这些结果表示在黑曲霉MBinlll中缺 失了全部的葡糖淀粉酶基因座和基因。
实施例8:黑曲霉MBin 112 (zJa叫4。,(^g/a)的构建 分离部分的黑曲霉酸稳定的a-淀粉酶基因(a^)并如美国专利号 5,252,726所描述的克隆到pUC19 (Roche Diagnostics Corporation,曼海姆，德 国)中。通过用//pal消化从包含部分酸稳定的a-淀粉酶基因的pUC19切下 部分酸稳定的a-淀粉酶基因的起始密码子346 bp上游的101 bp片段，并通 过平末端连接将来自pMBin01 (实施例4)的5^1片段插入这个位点以产生 pMBin04+ (图6)。用和S/ el进行pMBin04+的二重消化，在1%琼脂 糖-TBE凝胶上电泳后利用QIAEX II凝胶提取试剂盒分离4237 bp的 SmalAS/ el片段。4237 bp的SmalAS/ d片段由酸稳定的a-淀粉酶基因的5，末 端、；5，G终止子、全部的p,G基因(包括终止子)、和酸稳定的a-淀粉酶基 因的3，末端组成。
利用实施例1中描述的转化方法，用来自pMBin04+的Smal/Spel片段 转化黑曲霉菌抹MBinlll。在基本培养基上总共获得160个转化体。然后 将转化体转入淀粉苯胺蓝平板以篩选缺乏酸稳定的a-淀粉酶活性的转化 体。16个转化体几乎没有产生澄清带，在补充有10mM尿嘧啶核苷的基本 培养基上分离单个集落两次。
从酸稳定的a-淀粉酶基因座PCR扩增522 bp的片段，用作Southern印 迹分析中的探针。用引物7和8产生探针。 引物7: 5'-CTCATTGGCCGAAACTCCGAT-3，(SEQIDNO: 11) 引物8: 5'-AGCAGACGATGTCCTGAGCTG-3，(SEQIDNO: 12)
在50^1的反应物中进行522 bp片段的PCR扩增，其由10 ng pUC19/HW360质粒DNA， 50 pmol每种引物，2.5 mM每种dATP、 dCTP、 dGTP、和dTTP，具有2.5 mMMgCl2的lxPCR緩沖液，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶组成。在RoboCycler40热循环仪中进行反应，程序为1个循环 的95°C, 3分钟；30个循环的95°C, 1分钟，55°C， 1分钟和72°C, 1分钟；以及1个循环的72。C，5分钟。
如实施例2所描述的分离和标记522 bp的探针。
如实施例2所描述的从16个转化体和作为对照的未转化黑曲霉菌林 MBinlll分离基因组DNA。然后用Wol和S/ el消化基因组DNA，利用上 述探针如实施例2中所描述的进行Southern杂交。完整的酸稳定的a-淀粉 酶基因座显示为2.3 kb的条带而断裂位点是5.3 kb大小。这个大小差异是 由于插入了实施例4中所描述的3 kb pMBin01+ Spel片段。获得包含酸稳定 的a-淀粉酶基因断裂的5个转化体，将1个指定为黑曲霉MBinl12。黑曲 霉菌4朱MBin113中产生的断裂盒的环突出留下了 ； ,G终止子并产生了 2.8 kb的条带。如实施例5所描述的进行环突出并产生黑曲霉MBin113。
实施例9:黑曲霉MBinl14 (4wtT;zlasa,」p,G^lg/a)的构建 利用WO 00/20596中描述的2个重叠的克隆，NcE 1.4和C1E 1.8构建 黑曲霉p"r基因(SEQ ID NOs: 13 DNA序歹'J]和14 [推导的氨基酸序列]) (pMBin09,图7)。用尸M消化NcE 1.4， C1E 1.8，和pZeRO-2 (Invitrogen， Carlsbad, CA),分别在克隆的5，和3'末端产生尸"I位点，并且在多克隆位 点使pZeRO-2线性化。利用p^r克隆的共享区中的位点，通过在尸M 位点将尸WIA&; I克隆片段连接到pZeRO -2中进行三线连接产生pMBin09。 通过用5Wll07I/&/ I消化pMBin09首先产生233 bp缺失的pwr编码序 列，将实施例4中描述的pMBin01 5^1片段作为平端片段插入到消化的 pMBin09中以产生pMBin10 (图8)。利用QIAEXII凝胶提取试剂盒在1%琼 脂糖-TBE凝胶上电泳后分离来自pMBin10的Dralll/Mzel片段，用其进行
利用实施例1中描述的转化方法，用来自pMBin10的DralII/iW^1片段 转化黑曲霉MBin113。在酪蛋白平板上筛选102个转化体。9个转化体几乎 没有或没有显示澄清带，在补充有10mM尿嘧啶核苷的基本培养基上分离 单个集落两次。
从pMBin10中的pwr基因座PCR扩增232 bp片段的； wr编码序列并 且用作Southern印迹中的探针。利用引物9和10产生该片段。 引物9: 5，-TGTGATTGAGGTGATTGGCG-3， (SEQ ID NO: 15) 引物10: 5,-TCAGCCACACCTGCAAAGGC-3，(SEQIDNO: 16)在50^1的反应物中进行PCR扩增，其由10 ng pMBin10质粒DNA， 50 pmol每种引物，2.5 mM每种dATP、 dCTP、 dGTP、和dTTP,具有2.5 mM MgCl2 的lxPCR緩沖液，以及2.5单位的TaqDNA聚合酶组成。反应在RoboCycler 40热循环仪中进行，程序为1个循环的95°C， 3分钟；30个循环的95°C, 1 分钟，60°C, 1分钟和72。C, 1分钟；以及1个循环的72°C， 5分钟。
如实施例2所描述的分离和标记探针，其包含断裂的232 bp的/ wr编 石马序列下;袢。
如实施例2所描述的从9个转化体，以及作为对照的黑曲霉Bo-l和黑 曲霉MBinl12分离基因组DNA，并且如实施例2所描述的进行Southern分 析。用尸WI消化基因组DNA，在对照菌抹中观察到相应于未断裂的/7Wr基 因的2.5 kb条带。当探针与包含132 bp的/ ;;K 终止子和1198 bp的/ wr基 因的尸^I片段杂交时观察到相应于/ wr基因断裂的1.3 kb条带。选择l个 断裂体并指定为黑曲霉MBinl14。如实施例5所描述的外环化(looped out) p,G基因产生黑曲霉MBinl15。
实施例10 :黑曲霉MBinl16 (z/a/^5，^^Uasa，zlp,C^g/a)的构建
如美国专利号5,252,726中所公开的内容克隆黑曲霉中性a-淀粉酶基 因，画W和(NA1 ="w_yj而NA2 =譜;/5)。
通过五coRI/Sg/11消化，并利用QIAEXII凝胶提取试剂盒在1°/。琼脂糖 -TBE凝胶上电泳后分离，从pTakal7 (美国专利号5，536,661)分离2.6 kb片 段的黑曲霉中性a-淀粉酶基因(amj;5) (SEQ ID NOs : 17 [DNA序列]和18 [推 导的氨基酸序列])。将2.6 kb片段插入pZero2.0 (Invitrogen， Carlsbad, CA)的 EcoRI/BawHI位点以产生pMBin02 (图9)。通过尸welASmal消化在pMBin02 中产生从同源amy5基因的第5个外显子除去186 bp和从第6个外显子除 去52 bp的298 bp缺失，并通过平末端连接插入pMBin01 2696 bp S/ el片段 (实施例4中描述的)以产生pMBin03 (图10)。
利用实施例1中描述的方法用分离来自pMBin03的五coRIA4w11片段转 化黑曲霉MBinl15。获得192个转化体，如实施例8所描述的转入淀粉苯 胺蓝平板，其中有下列改变淀粉苯胺蓝平板缺乏甘氨酸并且pH是至少5。 8个转化体显示减少的澄清带，在补充有10 mM尿嘧啶核苷的基本培养基 上分离单个集落两次。利用引物11和12PCR扩增产生具有相应于黑曲霉am;^或amy5编码 序列的295 bp， ATG位点的450 bp下游(在该区域中aw_>W和am少B序列是
相同的)的序列的探针。
引物11: 5,-GGCAGCAGGATATGTAAGTCG-3，(SEQIDNO: 19) 引物12: 5'画CACTGTAATCGACTGAGCTAC-3， (SEQ ID NO: 20)
在50|al反应物中进行PCR，其由10 ng pMBin03质粒DNA， 50 pmol 每种引物，2.5 mM每种dATP、 dCTP、 dGTP、和dTTP,具有2.5 mM MgCl2 的lx PCR緩冲液，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶组成。在RoboCycler 40 热循环仪中进行反应,程序为1个循环的95°C, 3分钟；30个循环的95°C， 1 分钟，60。C，l分钟，和72。C,1分钟；以及1个循环的72°C， 5分钟.
如实施例2所描述的分离和标记探针。如实施例2所描述的从8个转 化体和作为对照的未转化黑曲霉MBinl15分离基因组DNA并用￡coRI和 fopLUllI消化。利用实施例2中描述的方法对消化的基因组DNA进行 Southern分析。起始密码子的616 bp上游存在五coRI位点，终止密码子的 99 bp下游存在&pLullI位点。野生型黑曲霉菌抹Bo-l aw少B基因条带是 2659 bp。断裂的amjW基因导致2659 bp条带的消失，并且由于插入pMBinOl 5^1片段，在5359bp显示条带。
1个转化体包含清楚的断裂并被指定为黑曲霉MBinl16。如实施例5所 描述的从黑曲霉MBinl16切下pyK7基因，并将该菌林指定为黑曲霉 MBinl 17。
实施例11:黑曲霉MBinl 18 (z^my」^aw^B，4wt7^asa，zl/ ,G^g/")的构建
因为黑曲霉am;^基因序列与amy5是基本上相同的，除在3'末端 (Korman等，1990, Ci^re"f Ge"幼'c^ 17: 203-212)之外，因此应用实施例10 中所使用的断裂构建和方法。根据实施例1中描述的方法用来自pMBin03 的五coRI"vrII片段转化黑曲霉MBinl17,以便断裂基因(SEQ IDNOs: 21 DNA序列]和22 [推导的氨基酸序列])。
获得356个转化体并如实施例10所描述的转入淀粉苯胺蓝平板。在补 充有10 mM尿嘧啶核苷的基本培养基上分离在淀粉苯胺蓝平板上没有产生 澄清带的4个转化体的单个集落两次。
从4个转化体和作为对照的黑曲霉MBinll7分离基因组DNA并利用实施例2中描述的方法进行Southern分析。用￡coRI和5spLU111消化基因组DNA并如实施例IO所描述的进行检测。在野生型黑曲霉Bo-l菌林中存在相应于基因的2.7 kb条带和表示am;^4基因的略大的条带。am;^条带的确切大小不是已知的，因为^pLUl II在amyj基因下游的未知位点有切割。在l个分析的转化体中，相应于amy^基因的条带不再是用探针可检测到的，表明已经存在包括探针位置的aw^J基因的缺失。将该转化体指定为黑曲霉MBin 118。如实施例5所描述的从黑曲霉MBinl 18切下基因，并将该菌抹指定为黑曲霉MBin119。
实施例12:黑曲霉MBinl20 (zloxa,z/am;^,zlaw;^,z//7W7;z/asa,^ ,Gz/g/a)的构建
根据WO 00/50576中描述的方法克隆黑曲霉草酸水解酶(ofl/;)基因(SEQNOs: 23 [DNA序列]和24 [推导的氨基酸序列])。如WO 00/50576所描述的构建质粒pHPl。
通过用SWEII消化pHPl除去285 bp的缺失，其包括156 bp的启动子和129 bp的草酸水解酶基因编码序列。将实施例4中描述的pMBin01 S; el片段平末端连接到这个位点中以产生pMBin08 (图11)。用消化质粒pMBin08，在1。/。琼脂糖-TBE凝胶上电泳后利用QIAEX II凝胶提取试剂盒分离7155bp的片段。来自pMBin08的A^I片段用来断裂黑曲霉MBin119中的草酸水解酶基因。
利用实施例1中描述的转化方法，用来自pMBin08的7Vort片段转化黑曲霉MBinll9。获得49个转化体，利用Sigma草酸酯试剂盒(编号591, SigmaDiagnostics, St. Louis, MO)筛选草酸酯的产生。通过将密度为每ml大约104个转化体的分生孢子接种到包含补充有5%葡萄糖的20 ml YP培养基的125ml摇瓶中而在摇瓶中培养转化体。在37。C和200 rpm培养摇瓶3至6天。在第3天移出5pl的摇瓶培养物样品并离心以产生上清液用于酶活性测定。将第3天的上清液加入96孔平板的孔中，然后按照制造商的说明加入1/10体积的草酸酯试剂盒试剂。在590 nm分光光度测量草酸酯的产量。1个转化体没有产生可检测的草酸酯，在补充有10mM尿嘧啶核苷的基本培养基上分离单个集落两次。
利用引物13和14从草酸水解酶基因内(起始密码子下游的404 bp)PCR扩增包括579 bp序列的片段用作Southern印迹分析中的探针。引物13: 5'-CTACGACATGAAGACCAACGC-3， (SEQ ID NO: 25)引物14: 5'-GCACCGTTCTCCACCATGTTG-3， (SEQ ID NO: 26)
在50jxl的反应物中进行PCR扩增，其由10 ng pMBin08质粒DNA, 50pmol每种引物，2.5mM每种dATP、 dCTP、 dGTP、和dTTP,具有2.5 mMMgCl2的lxPCR緩冲液，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶组成。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，程序为1个循环的95°C, 3分钟；30个循环的95°C， 1分钟，60°C， 1分钟，和72°C， 1分钟；以及1个循环的72°C，5分钟。
如实施例2所描述的分离和标记探针。如实施例2所描述的从转化体，以及作为对照的黑曲霉Bo-1和黑曲霉MBinl18分离基因组DNA，并且用Mfel和消化。用上述探针对黑曲霉对照菌林Bo-1和MBinl 18的Southern分析显示相应于未断裂草酸水解酶基因的2.5 kb条带。该转化体具有与在草酸水解酶基因座插入断裂盒一致的4.9 kb条带。将该转化体指定为黑曲霉MBin120。
实施例13 :黑曲霉普通宿主菌林的表达分析
通过在摇瓶和/或发酵罐中培养菌株评估普通宿主黑曲霉菌株产生葡糖淀粉酶、酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶、和蛋白酶的能力。黑曲霉Bo-l作为对照。
将密度为每ml大约104的黑曲霉菌抹分生孢子接种到包含补充有5%葡萄糖的20 ml YP培养基的125 ml摇瓶中。摇瓶在37。C和200 rpm培养3至6天。在第3-6天移出摇瓶培养物样品，离心产生用于酶活性测定的上清液。
也将黑曲霉菌林接种到包含1.8升培养基的2升发酵罐中，培养基组成为每升2 g MgS04.7H20, 2 g KH2P04， 2 g柠檬酸，2 g K2S04， 0.5 ml AMG微量金属溶液，300 g高麦芽糖糖浆，1.8 g CaCl2'2H20和1.8 ml普朗尼克酸(pluronic acid)。培养的发酵培养基是组成为每升50 g尿素和5 ml普朗尼克酸的培养基。发酵条件是34。C， pH 4.5+/-0.05， 1.0 vvm曝气(aeration)，和1000rpm进行8天。在第l-8天移出发酵样品，离心产生用于酶活性测定的上清液。
在25。C, pH4.3的0.1 M醋酸钠中利用麦芽糖作为底物测量葡糖淀粉酶活性。根据制造商的指导，利用Sigma Trinder显色试剂(Sigma reagent kit315-100， Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)在490證测量葡萄糖。AMG (NovozymesA/S,Bagsv^rd，丹麦；批次7-195)用作以AGU/ml测量的具有葡糖淀粉酶活性的标准物。
确定黑曲霉SMO110没有产生可检测的葡糖淀粉酶活性(在第4天的摇瓶样品中小于0.5 AGU/ml)。确定黑曲霉MBinlll没有产生可检测的葡糖淀粉酶活性(在第4天的摇瓶或发酵样品中小于0.5 AGU/ml)。
分别在pH 4.5和pH 7,0,利用Sigmaa-淀粉酶底物(Sigma Kit #577， SigmaChemical Co.， St Louis, MO)在30。C测量酸稳定的和中性a-淀粉酶活性。检测是在405 nm。 FungamyFM用作标准物并且以FAU/ml报告活性。
与黑曲霉Bo-l (在第5天的发酵样品中为51 FAU/ml)相比，对于黑曲霉MBinll3、MBinll6和MBinll8(在第3天的摇瓶或发酵样品中都>0.1 FAU/ml)发现几乎不能检测到酸稳定的a-淀粉酶活性。与发酵样品中的黑曲霉Bo-l相比，对于黑曲霉MBinl14 (来自第3天的摇瓶^羊品为未4企测到和在第5天的发酵样品中为5.7FAU/ml)中性a-淀粉酶活性基本上减少了 ，而对于黑曲霉MBinll8(在第5天的发酵样品中为0.5FAU/ml)几乎不能检测到。
利用FITC -酪蛋白作为底物(Sigma Chemical Co., St. Loius， MO)确定总的蛋白酶活性。通过混合40(^1的FITC-干酪素底物(储液1:1，具有0.1 M磷酸钾，pH6.0或0.1 M柠檬酸钠，pH5.0)和在0.1 M磷酸钟pH 6.0或0.1 M柠檬酸钠pH 5.0中适当稀释的10|il培养物样品，然后在37。C孵育该溶液1小时而进行测定。孵育1小时后，用的5%三氯乙酸淬灭反应并在冷藏室中孵育1小时。将淬灭的反应物转入Eppendorf试管并离心10分钟。将10(^1等分的上清液转入包含lml 0.5 M硼酸盐pH 9.0的试管并混合。将200(il等分的溶液转入黑色的"U"底96孔平板(ThermoLabsystems, Franklin,MA)。利用Fluorolite 1000仪器(ThermoLabsystems, Franklin, MA),用参考通路3和设置为1176测量荧光。以蛋白酶荧光单位测量活性。
对于黑曲霉MBinl14中pwr基因的缺失，总的蛋白酶活性降低到黑曲霉Bo-l的大约20%。第6天的MBinl14发酵样品具有692的蛋白酶活性，而Bo-l是至少3953荧光单位/ml。
实施例14:南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉MBinl14、 MBinl18和MBinl20中的表达如美国专利号6,020,180所描述的克隆假丝酵母南极洲脂肪酶B基因(SEQ IDNOs: 27 [DNA序歹'J]和28 [推导的氨基酸序列])。如Hoegh等在
73 (Suppl.l): S869-S875 (1995)中所描述的构建包含脂肪酶B基因的质粒pMT1335。如WO 91/17243所描述的构建包含构巢曲霉am必基因的质粒pTOC90。根据实施例1中描述的方法将质粒pMT1335和pTOC90共转化入黑曲霉MBinl14，并且在乙酰胺上选择转化体。
通过划线至乙酰胺平板分离30个转化体。从转化体收集分生孢子，用于如实施例13所描述的接种于摇瓶。在第3-6天移出摇瓶培养物样品，离心产生用于酶活性测定的上清液。
为了评估pwr基因的断裂对蛋白酶活性的总水平的影响，和南极假丝酵母脂肪酶B(CLB)的产率，确定蛋白酶和脂肪酶B的活性。通过发酵评估产生脂肪酶B的几个转化体和最高的生产体。
如实施例13所描述的，在2升的发酵罐中培养黑曲霉MBinl14和作为对照的黑曲霉Bo-l。
如实施例9所描述的测量总的蛋白酶活性。
在pH 7，用p -硝基苯基丁酸(Sigma Chemical Co.， St. Louis， MO)作为底物进行脂肪酶B测定。在0.1 M MOPS-4 mM CaCl2 pH 7.0中适当稀释培养物上清液。将100|il等分的培养物上清液加入在96孔微平板孔中的100|xl的p-硝基苯基丁酸底物溶液。p -硝基苯基丁酸底物溶液由10^1的p-硝基苯基丁酸，9卯(xl的DMSO，和4ml的0.1 M MOPS -4 mM CaCl2 pH7.0组成。用南极假丝酵母脂肪酶B标准物(Novozymes Japan Ltd., Chiba-shi，日本)来计算LU/ml，在405nm分光光度测量脂肪酶活性。
图14显示了这些测定的结果。总的蛋白酶活性降低到野生型的大约20%(参见实施例13,图12),脂肪酶B活性在发酵的自始至终稳定地上升(图13)。
实施例15:嗜热柱顶孢过氧化氬酶在黑曲霉MBinl14、 MBinl18和MBinl20中的表达
如美国专利号5,646,025所描述的克隆嗜热柱顶孢过氧化氢酶基因(SEQID NOs: 29 [DNA序列]和30 [推导的氨基酸序列])。如美国专利号5，646，025所描述的构建包含过氧化氢酶基因的质粒pDM153。根据实施例l描述的方法将质粒pDM153转化入黑曲霉菌抹MBinl14、 MBinl18和MBinl20。
43选择40个转化体，在包含1.5 ml 1:4稀释度的M400培养基的24孔平板中培养。在34。C和125 rpm培养平板90小时。在第90个小时移出样品用于测定。在发酵罐中评估产生最高水平的过氧化氢酶活性的3个转化体。
在25。C，包含18.2(1l过氧化氢储液的10 mM磷酸盐pH 7緩沖液中测量过氧化氢酶活性。过氧化氬储液由每10 ml 10 mM磷酸钾pH 7的30%过氧化氢组成。将25pl等分的培养物上清液加入在96孔^f鼓平板孔中的25^1的过氧化氢储液。孵育5分钟后，加入200pl的钛试剂，在405 nm读取吸光率。钛试剂由l.Og二氧化钛和10gK2SO4组成，其用150ml浓缩的H2SO4在180-220。C消化2 -3小时，冷却，然后用1.5升去离子水稀释。利用Catazyme(NovozymesA/S，Bagsvard,丹麦，批次31-2197)作为标准物，并以KCIU/ml报告在405 nm分光光度测量过氧化氬酶活性。
如实施例13所描述的，在2升发酵罐中培养黑曲霉菌抹MBinl14、MBinl18和MBinl20。
图14显示了黑曲霉普通宿主菌抹MBinll4、MBinll8和MBin120中嗜热柱顶孢过氧化氢酶生产的比较。在任何测试的菌抹中没有观察到酶生产量的明显变化。
在此所描
范围，因为这些方面旨在例证说明本发明的几个方面。任何等效方面限定为是在本发明的范围内的。实际上，除在此所显示和描述的实施方案外，从上述说明书看来，本发明的各种改变对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这种改变也是属于所附的权利要求的范围内的。就分岐来说，包括定义的本公开的内容将进行控制。
在此引用多种参考文献，其公开的内容全部引入作为参考。序列表
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ctgcgaagtacttag"tcctgtaactcttgcgtagagc犯atggcgacggg"tggctgataa函
gggacggtgataagctt1517〈210> 2 〈211> 277 <212〉 PRT
〈213> 黑曲霉(Aspergillus niger) <400> 2
Ser Ser Lys Ser Gin Leu Thr Tyr Thr Ala Arg Ala Ser Lys His 5
Met 1
Thr 10
Arg
Pro Asn Ala Leu Ala Lys Arg Leu Phe Glu lie Ala Glu 20
Lys 15
Lys Ser
Phe 25
Ala 30
Lys
Lys
Thr Asn Val Thr Val Ser Ala Asp Val Thr Thr Thr Lys Glu Leu Leu 35
Asp 40
Lys 45
Asp Leu Ala Asp Arg Leu Gly Pro Tyr lie Ala Val lie Lys Thr His 50 55
Val 60
lie 65
Asp lie Leu Ser Asp Phe Ser Asp Glu Thr lie Glu 70
Thr 75
Ala Leu Ala Gin Lys His Asn Phe Leu lie Phe Glu 85 90
Asp
lie Asp lie Gly Asn Thr Val Gin Lys Gin Tyr His Arg
Lys
Gly Arg
Leu
Lys 95
Lys 80
Phe
Arg
Asp lie
Gly 100
Lys 105
Gly 110
Thr Leu
Tyr
Glu Trp Ala His lie lie Asn Cys Ser lie Leu Pro Gly 120 125
Glu Gly lie Val Glu Ala Leu Ala Gin Thr Ala
Ser 115
Gly 130
Leu 135
Ser 140
Ser 145
Lys Ala Leu
Ala Pro Asp Phe Leu Leu lie Leu Ala Glu Met Thr
Leu 155
Ser 160
Asp 175
Tyr Gly Pro Glu Arg Gly 150
Gly Ser Leu Ala Thr Gly Gin Tyr Thr Thr Ser Ser Val Asp Tyr 165 170
Arg Lys Tyr Lys Asn Phe Gly
Tyr 180
Asn Phe Val Met Gly Phe Val Ser Thr Arg Ser 185 190
Glu 195
Lys
Val Gin Ser Glu Val Ser Ser Pro Ser Asp Glu Glu
Val 200
Asp 205
Phe Val Val Phe Thr Thr Gly Val Asn lie Ser 210
Gly 215
Ser 220
Leu 225
Lys
Gly Gin Gin Tyr Gin Thr Pro Ala Ser Ala lie Gly 230
Asp Phe lie lie
Ala 245
Gly
Gin Ala Ala Gin Gin Tyr Gin Lys 260
Gly Tyr
Gly Arg
Arg Gly lie Tyr Ala Ala Pro Asp 250
Ala 235
Asp Gly
Pro 255
Asp Lys
Ala 240
Val
Glu Gly Trp Glu Ala Tyr Leu Ala 265 270
Arg Val Gly Gly Asn 275
〈210〉 3
〈211〉 30
<212> DNA
<213〉 黑曲霉(Aspergillus niger)<400> 3
gggactagtg gatcgaagtt ctgatggtta 30
〈210〉 4
〈211〉 30
〈212〉 DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
〈400〉 4
ataccgcggg tttxaaggat ggagatagga 30
<210〉 5
<211> 2103
<212〉 DNA
〈213〉 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400〉 5
"tcccttttaggcgcaactgagagcctgagcttcatccccagcatcattacacctcagcaa60
tgtcgttccgatctctactcgccctgsgcggcctcgtctgcacagggttggcaaatg"tga120
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ccatcctgaataacatcggggcggacggtgcttgggtgtcgggcgcggactctggcattg240
tcgUgctagtcccagcacggat犯cccggactacttctacacctggactcgcgactctg300
gtctcgtcctcaagaccctcgtcgatctcttccgaaatgg3g3taccagtctcctctcca360
ccattgagaactacatctccgcccaggcaattgtccagggtatcagtaacccctctggtg420
atctgtccagcggcgctggtctcggtgaacccaagttcaatgtxgatgagactgcctaca480
ctggttcttggggscggccgcagcgagatggtccggctctgagagcaactgctatgatcg540
gcttcgggcagtggctgcttgacaatggctacaccsgcaccgcaacggacattgtttggc600
ccctcgttaggaacgacctgtcgtatgtggctcaatactgg犯cc3gacaggatatgatc660
tctgggaagaagtcaatggctcgtctttctttacgattgctgtgcaacaccgcgcccttg720
tcgaaggt3gtgccttcgcgacggccgtcggctcgtcctgctcctggtgtg3ttCtC3gg780
cacccgaaattctctgctacctgcagtccttctggaccggcagcttcattctggccaact840
tcgatagcagccgttccggcaaggacgcaaacaccctcctgggaagcatccacacctttg，
atcctgaggccgcatgcgacgactccaccttccagccctgctccccgcgcgcgctcgcca960
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acagcgaggctgttgcggtgggtcggtaccctgaggacacgtactac犯cggcaacccgt1080
ggttcctgtgcacc"t"tggctgccgcagEigcagttgtacgatgctctataccagtgggaca1140
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atgctgctactggcacctactcttcgtccagttcgacttatagtagcattgtagatgccg1260
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ccatgtccgagcaatacgacaagtctgettggcgagcagctttccgctcgcgacctgacct1380
ggtcttatgctgctctgctgaccgtcgtaactccgtcgtgcctgcttctt1440
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c"ta,gcaagaccagcaccagtacgtcatcascctcctgtaccactcccaccgccgtggctg腳
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tctctcagctgggtgactggacggcatagctctgagtgctgacaagtsca1800
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catgtatgtagtgggtgtgcataatagtagtga犯tggaagccaagtcatgtgattgtaa2100
tcg2103
<210> 6
<211> 662
<212> PRT
〈213〉 黑曲霉(Aspergillus niger〉
<400〉 6
Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly 15 10 15
Leu Ala Asn Val lie Ser I>ys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser 20
I>ys
Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg
Ala 25
Trp 30
Gly
Ala 50
Ala 65
Ala 35
Asp Pro
Thr 40
Ala lie Leu Asn Asn Phe Thr lie 45
Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp 55
Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr 70
Gly Asp
Ser 60
Phe 75
Gly lie Val Val Thr
Asp Ser Gly Leu Val Leu Lys 丁hr Leu 85
Asp
Val 90
Leu 100
Asp Phe
Trp
Leu Phe Arg
Thr
Arg 80
Asn 95
Gly
Thr Ser Leu Leu Ser Thr lie Glu Asn Phe Thr Tyr lie Ser Ala
105
lie 110
Gin Ala lie Val Gin Gly lie Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser 115 120 125
Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr
Gly
Ala 130
Thr 145
Gly Ser
Leu
Trp
G]y Gly
Gly Glu
Pro 135
Asp 140
Arg 150
Pro Gin Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg 155
Gly
Thr Ala Met lie Gly Phe Gly Phe Thr Gin T卬Leu Leu Asp 165 170
Tyr Thr Ser Thr Ala Thr Asp lie
Gly Asp
Leu Ser Tyr Val Ala Gin Tyr
Thr 180
Val 185
Leu
Pro Leu Val
Arg 190
Asn 175
Asn
Tyr 195
Trp 200
Trp
Asn Gin Thr Gly Tyr Asp Leu 205
Ala 160
Gly Asp Trp
48Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr lie Ala Val Gin His Arg 210 215 220
Ala 225
Leu Val Glu Phe
Thr 230
Ser Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly 235
Ser 240
Ser Cys Ser Trp
Cys 245
Asp
Gin Ser Phe Trp Thr Gly
Trp 260
Gly
Ser Gin Ala Pro Glu lie Leu Cys Tyr Leu Ser
Pro 250
Tyr 255
Phe lie Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser
lie 265
Asp 270
Arg Asp
Ala
Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu Gly Ser lie His Thr Phe 275 280 285
Thr Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ser
Phe 290
Ala 295
Thr 300
Phe Gin Pro Cys
Ser 305
Asp
Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu Val Val Asp Ser Phe
Arg 丁yr Val Gly Arg
Ala 310
Val 315
Arg 320
Asp
Ser lie Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser Asp Ser Glu Ala Val Ala
330
Leu 325
Tyr 340
Asp
Pro Glu Asp Thr
Val 335
Tyr 345
Tyr Asn Gly Asn Pro Phe Thr 350
s Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gin Leu
Trp Tyr
Asp 385
Phe
Leu 355
Ala 360
Cy
Trp Asp Lys Gin Gly Ser Leu Glu Val 375
Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr 390
Gin 370
Thr 380
Ala 395
Tyr 365
Asp Gly
Asp Ala Leu Va〗Ser Leu
Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser lie 405
Val 410
Thr
Phe Thr Ala
Tyr
Ser 400
Val 415
Thr Phe Ala
Asp 420
G〗y
Asn Gly Ser Met Ser Glu Gin 435
Asp
Phe Val Ser lie Val Glu Thr His Ala Ala
430
Ser Asp Gly Glu Gin Leu 445
lie 425
Lys Ser
Tyr 440
Ser
Asn 465
Ala 450
Asp
Asp Leu Thr Trp Ser Tyr 455
Lys
Ala Ala Leu Leu Thr Ala Asn
Leu 460
Arg
Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Phe Thr Ala Ser T卬Gly Glu 470
Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys 485
Gly
Tyr Gly
Gly Val
Ala 490
Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser lie Val Ala Thr 500
Ser 505
Ala 475
Ala Pro
Gly Thr Ser Als
lie 495
Thr 480
Gly
Val 510
Thr 515
Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr 520 525
Ser Thr Ser Lys Thr Phe 530
Thr 535
Gly
Ala Thr Ala
Ser 540
Lys Thr Ser Thr
Ser 545
Thr
Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val
555
Ser 550
Thr Ala
Thr 560
Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn lie Tyr Leu Val 565 570 575Gly Ser lie Ser Gin Leu Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp Gly lie Ala 580 585 590
Leu Ser Phe Thr Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro Leu Trp Tyr 595 600 605
Val Thr Val Thr Leu Pro Als Gly Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Phe lie 610 615 620
Arg lie Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg 625 630 635 640
Glu Tyr Thr Val Pro Gin Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala Thr Val Phe 645 650 655
Thr Thr Asp Thr Trp Arg 660
〈210〉 7 〈211> 21 <212〉 腿
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger) <400> 7
actagtggcc ctgtacccag a
〈210〉 8 〈211〉 26 <212> 腿
<213〉 黑曲霉(Aspergillus niger) 〈400〉 8
gcatgcattg ctgaggtgta atgatg 26
<210〉 9 <211> 21 <212> DNA
〈213〉 黑曲霉(Aspergillus niger) 〈400> 9
gaggtcgacg gtatcgataa g
〈210> 10 〈211> 33 <212> 腿
〈213〉 黑曲霉(Aspergillus niger) <400〉 10
gcatgcagat ctcgagaata caccgttcct cag 33
〈210> 11 <211> 21 <212> 腿
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger) <400> 11
ctcattggcc gaaactccga t
〈210〉 12
〈211〉 21
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)〈400〉 12
agcagacgat gtcctgagct g 21
<210〉 13
〈211> 4098
<212〉 DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400〉 13
ttggtgctgga^igccceittt33ggg3tCtttgccaatgttcagtcgcct60
atggtctttgtcgagagaaactctttctcgcatgaitcgcttttgattttc120
tCtgggttC3cgcggtactttctccccgtcastccccaaccgctgttgtgcctgaccatc180
aatgtggaacggat犯gggg3C犯gagaaattg犯ggagcg3tcataa犯agctaatttt240
ggttt3ttatttttttttct貼犯ggaa犯300
aagaaaaggtaaga犯ggcggtcatcactttcagccaaag360
atacagacgagttactgaccttcttatcctggacttccgcccgatccatatcttcatgat420
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ttcccaccggCgtC3tt"ttggtcccaaccccctccctggaagcagcgggatttagttacg540
atccggtttacatcggagacccatagcgcatgccaatcaaaacccctccc600
agggtgactggccagtatcacgacccattgtttctatctttctagaagacctgcagggac660
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tggacggacccataaccaatctaaccaaagccaatttcgtcaattcccagctggcgagca780
caatcccattcccagggttggccgccaactgttaaaaggcactatgtgtctctccacctg840
cccgcccccctcgatggcctgcgcgtaataactattctactgctttttgcctcttacttg900
cctcattattagtattttactctactctccagattgcctgccagcaattggtccaaagtg960
gact"ttgtttgatgacatgactcgaaccgtggacgagatccgccttcttc1020
atgggagcac犯gagcttggacgttgccgagga>tggca_ggcgactagctccccattccga1080
cactgctcgtccgaaaggccgcatacgacgatcgatgactgcctgtcacacatgtcggaa1140
gcttaaaacttagatccgcgcggtcatgcgtgccgtcgctgtctatctct1200
aaggtcagaggcactacctacctgccag"ttgaagctttgtccttctgaacgcgacatgat1260
actagtcgtggaatataactgtcccaactttgctgacagtccacaatatctttagaatcg1320
attgtaagctgcctgaaacgaccgaccgcttccaagacagtgctgcgatgtggccagacg画
ccacctcggcaattccctccatcgaggagcgcctcacctccctagaaagatgcatgaggg1440
agatgacgggcatgatgcgacagatgctagatcactccccaggtttcgcaaatgcctcgg1500
ttccgcatttga_cc￡i^agceitcatcacggatgEiaaccgcctcgatggagggaagcccgt1560
cgtcccccttcctgcctaagcccgttcgcctcattcaggacctccagtccgacttcttcg1620
gagaagcagagacttcccccgttgactcccctctctccagcgeitggtaeicgccaagggcg1680
ctatcgactctaagctatccctc犯a"ttgttgcaaacgtatgggtatacctgattgacaa1740
ttacca犯aagctgctaatccttggcgc犯atcaggtttgtcgatcactttggcgcttgc翻gtttccatttacaatctctccgacatccacaagcccccgactctttactg1860
tataatactgcatgccttctagcttcacgctatgtaccggggataccgacatctaccgtg1920
catgctatataccttcaagtgcgacatgcagtagtcaatetttttgtgggaaaasccaccc1980
ctgaag"tatgagaccctccaagcacttgcacttctctgtctctggccagcaaccgcccag2040
aaagagccacccatggacagctggctgctgagtggtatctcaatt33ccatgcaattatc2100
gcgctcgatttcctaaactatgcgccctcggaagtcatgg"tggac犯tgaaiacggctgcg2160
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gg眺tgggctcaccttttctgtaagaagcctgttcttgtttcccggggactaccactga2520
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tcgsggggtscggcttcgagcaactgatgccagaagtcatgccgagttcctttccggatg3060
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cagggatgataacctgcagcggtggtUagttcctgcccatgggctgaactaaaaccccg3240
犯cctagC3tgatgacgtgcaacgaaagg3tcataaccaaggcc犯gtaaat ac t aaaat3300
aaaataatataattccacacgatccactaccsccaccsccaccggatccatcaggttgcc3360
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Ugaacgagtcagaacacattcttttcgtttctatcgtttcttttccaaggcagcagaga3660
gacgaac朋gtcagtgcttgctaactaacttacccctcagcattttagtaaactactatt3720
tagg肌卿gt33tcattcatcgaagacaagatgtttatttctccgatcg3780
aacgttcaggtagactaagtagtagtagtagtatgtctttgacccctttactccactatc3840cgttggictgc 3catagtagt犯gt3actat ct肪cc3gtt tgggtgggag ccggaggatg ccgccgagaa Uatt犯gtc cttttcatga tgaggagagg aaggagaggg gggacgggat tccaattaat tatc"Lggatt犯ttaaaact tggagaggag gtatgttgct gtgaatgt
<210> 14
<211> 666
<212〉 PRT
〈213〉 黑曲霉(Aspergillus niger)
〈400> 14
Met Thr Arg 1
gccgaggaga gga犯gtgag 3900 gatcattgct agttagttat 3960 tagag犯ata aacttttctc 4020 ggtagggg叫ttgggtattg 4080
4098
Thr Val Asp Glu lie Lys Tyr Glu Thr Pro Ser Ser Trp 5 10 15
Glu His Lys Ser Leu Asp Val Ala Glu Asp 20 25
Gly Arg Arg Leu Ala Pro 30
His Ser Asp Thr Ala Arg Pro Lys Gly Arg lie Arg Arg Ser Met Thr 35 40 45
Ala Cys His Thr Cys Arg Lys Leu Lys Thr Arg Cys Asp Leu Asp Pro 50 55 60
Arg Gly His Ala Cys Arg Arg Cys Leu Ser Leu Arg lie Asp Cys匕ys 65 70 75 80
Leu Pro Glu Thr Thr Asp Arg Phe Gin Asp Ser Ala Ala Met Trp Pro 85 90 95
Asp Ala Thr Ser Ala lie Pro Ser lie Glu Glu Arg Leu Thr Ser Leu 100 105 110
Glu
His
lie 145
Arg Cys 115
Ser Pro 130
Met Arg Glu Met Thr Gly Met Met Arg Gin 120 125
Met Leu Asp
Gly Phe Ala Asn Ala Ser Val Pro His Leu Thr Lys Ser 135 140
lie Thr Asp Glu Thr Ala Ser Met Glu Gly Ser Pro Ser Ser Pro 150 155 160
Phe Leu Pro Lys Pro Val Arg Leu lie Gin Asp Leu Gin Ser Asp Phe 165 170 175
Phe Gly Glu Ala Glu Thr Ser Pro Val Asp Ser Pro Leu Ser Ser Asp 180 185 190
Gly Asn Ala Lys Gly Ala lie Asp Ser Lys Leu Ser Leu Lys Leu Leu 195 200 205
Gin Thr Phe Val Asp His Phe Gly Ala Cys Val Ser lie Tyr Asn Leu 210 215 220
Ser Asp lie His Asn Asp Met Lys Ala Pro Asp Ser Leu Leu Tyr Asn 225 230 235 240
Thr Ala Cys Leu Leu Ala Ser Arg Tyr Val Pro Gly lie Pro Thr SerThr Val His
Ala 260
245
lie Tyr Leu Gin
Val 265
250
Arg His Ala Val
Val 270
255 Asn
lie
Leu Trp Glu Lys Pro Pro Leu Lys Tyr Glu Thr Leu Gin Ala Leu Ala 275 280 285
Leu Leu Cys Leu Trp Pro Ala Thr Ala Gin Lys Glu Pro Pro Met Asp 290 295 300
Ser Trp Leu Leu Ser Gly lie Ser lie Asn His Ala lie lie Ala Leu 305 310 315 320
Asp Phe Leu Asn Tyr Ala Pro Ser Glu Val Met Val Asp Asn Glu Thr 325 330 335
Ala Ala Gin Leu Arg Leu Trp Asn Thr Tyr Cys Leu Thr Gin Leu His 340 345 350
Phe Ala Val Gly Asn Ala Arg Pro Phe His lie Gin Gin Arg Tyr Leu 355 360 365
Asp His Cys Pro Arg lie Leu Glu His Pro Ala Ala Thr Leu Glu Asp 370 375 380
Ala Arg Val Val Ala Glu lie Gin Leu Tyr Leu Met Thr Leu Arg Leu 385 390 395 400
Gin Ser Asn Ser Ser Arg Met Arg Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Glu Glu 405 410 415
lie Glu Arg Trp Lys Arg Glu Trp Ala His Leu Phe Cys Lys 420 425 430
Val Leu Val Ser Arg Gly Leu Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Gly Glu
445
Val 435
Pro 440
Lys Gly
Pro
Arg
Ser Ser Thr Leu Glu Leu Ser Leu Trp Phe Cys Gin Thr Leu Leu His
460
Ser 450
Ser 455
Arg 465
Thr Ala Met Arg Leu Gin Pro Arg Ser Asp Arg Leu Ala Ser 470 475
Glu 480
Val Leu Gin Thr Ser Arg Leu lie lie Ser Arg Phe Leu Gin 485 490
lie 495
Arg
Ser Thr Ala Leu Ser Leu Val Asp Gin Val Tyr Phe lie Val Gly
Ala 500
Asp 505
lie 510
丁yr
Tyr Ala Ala Leu Asn Leu Cys Asp Phe Asn Leu Met Asp Pro Leu lie
525
Ala 515
Asp 520
Glu Gin Val Gin Met Phe Leu Leu His Leu Ser Pro Asn Glu Asp His 530 535 540
lie Ala Tyr Arg Phe Ser Cys Met Val Ala Glu Phe Lys Arg Arg Cys 545 550 555 560
Gly Ser Ala Glu Cys Asn Asp Pro Ser Ser Thr Val 565 570
Arg Gly
Ser 575
Pro
Lys
Leu Ser Ser Tyr Gly Asp Ser Arg Lys Met Ser Met Gly Gin Ala Pro580 585 590
Phe Met Pro Pro Leu Met Asp Gly Met lie Glu Gly Tyr Gly Phe Glu 595 600 605
Gin Leu Met Pro Glu Val Met Pro Ser Ser Phe Pro Asp Gly lie Leu 610 615 620
Asn Gly Met Pro Val Thr Gly Leu Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Thr Leu 625 630 635 640
Ser Ser Asn Thr Arg Asp Asp Asn Leu Gin Arg Trp Phe Ser Ser Cys 645 650 655
Pro Trp Ala Glu Leu Lys Pro Arg Thr Pro 660 665
〈210〉 15 <211> 20 <212> 醒
<213〉 黑曲霉(Aspergillus niger) <400> 15
tgtgattgag gtgattggcg
〈210〉 16 <2il> 20 <212> 腿
<213〉 黑曲霉(Aspergillus niger) 〈400> 16
tcagccacac ctgcaaaggc
<210> 17
<211〉 2443
<212〉 DNA
<213〉 黑曲霉(A印ergillus niger) 〈220>
〈221〉 raise—feature
<222〉 (It)): (10)
<223〉 n=a, c， g或t
<400> 17
ctgceigaatn aatttataact ettctgegaa gcttaaagta tgtcccttgt egatgegatg gecatgettg gaggatagca accgacaaca aaaccccaca gaaggcattt atgatggtcg aggtcgcggc acctgetttg gctgcaacgc tccttctcac ggatcgattt geaaggaegg eggatcaggt gtgttgttac ctactagctt tagaaatact gtggtggaac atggcagggc a3a3朋aa3g 33gg3朋agc 3gsaga3saa cacatagttg gactatatcc agggaatggg
tegcttggat tccccgcccc tggcegtaga tatcacaaca t3taaatact agcaagggat tcacatcaag ctctcccttc tctgaacaat cgtggtggtc tctatttctg tacggccttc ctgcggactg gcgatcgcaa tccatttatt atgggtcgac gaetgegact tgtaatactg tcagasagag g33tgtaaac tgscttgats atcatcgaca aggtaaattg cccctttatc taaaataaaa agaactctag tcctaaccat cttcacagcc atctggatca cccccgttac
20
20
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
55agcccagctgccccagaccaccgcatatggagatgcctaccatggctactggcagcagga660
tatgtaagtcgatttcttta犯tatctacctgtcatcttttacatcaat3tgaactaact720
tgatggttttagatactctctgaacga^agcagatgacttg犯ggcgct780
ctcttcggcccttcatgagagggggatgtatcttatggtcgatgtggttgctaaccatat840
ggttcgtggtcctttgcaactgacttcgcgg3t3tggttC3tttcagtactg3C33tg3g■
taatatcagggctatgatggagcgggtagctcagtcgattacagtgtgtttaaaccgttc960
agttcccaagactacttccacccgttctgtttcattcaaa actatgaagatcagactcag1020
gttgaggattgctggctagggtctccttgcctgatctcgataccaccEiag1080
gatgtggtcaagaatgaatggtacgactgggtgggatcattggtatcg犯ctactccagt1140
aagat:atttctccctcattctacaacttggctgatcgatg atacttacgaaatcagttga1200
cggcctccgtatcgacacagccagaaggacttctggcccgggtacaacaa1260
agccgcaggcgtgtactgtatcggcgaggtgctcgacggtgstccggcctacacttgtcc1320
ctaccagaacgtcatggacggcgtactgaactatxccatgtatggttcctccaaccatga1380
gccttcttgcaagtctcatctcctaacgaaacggctaaaa ccagttactatccactcctc1440
aacgccttcaagtcaacctccggcagcatggacgacctct3C犯catg3tcaacaccgtc1500
aaatccgactgtccagactcaacactcctgggcacattcgtcgagaaccacgacaeiccca1560
cggttcgcttcgtaagtcttcccttttattttccgttcccaatttccacaC3g犯cccca1620
gcaaagttacaccaacgacatagccctcgccaagaacgtcgcEigca/ttca1680
tcatcctcaacgacggaatccccatcatctacgccggccaagaacagcactacgccggcg1740
gaaacgaccccgcgaaccgcg犯gcaacctggctctcgggctacccgaccgacagcgagc1800
tgtacaagttaattgcctcccggaacgcaatccggaactatgccattagcaaagatacag1860
gattcgtgacctacsaggtaagcacaacctct朋gcataccctsatggcctstcttcaga1920
gtatctgacaC3￡iga^gact3atcactggcaggcccatctacaaagacgac1980
acaacgatcccgatgcgcaagggcacagatgggtcgcaga tcgtgactatcttgtccaac2040
aagggtgcttcgggtgattcgtataccctctccttgagtggtgcgggUeicacagccggc2100
cagcaattgacggaggtcattggctgcacgaccgtgacgg ttggttcggatgg犯3tgtg2160
cctgttcctatggcaggtgggctacctagggtattgtatccgactgagaagttggcaggt2220
agcaagatctgtagtagctcgtgaagggtggagagtatatgatggtactgctattcaatc2280
tggcattggacagcgagattg犯tgtggtggacgtaacctacgttgtgtctgtagaatat2340
￡itacatgt3￡Lgatacatgagcttcggtgatataatacagaagtaccatacagtaccgcgt2400
tatggaatcggggcUUcctataatagactag2443
<210> 18
〈211〉 499
〈212〉 PRT
〈213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 18Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe1 5
Ala Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala20 25
Leu10
Asp
TyrTrp
Ala
Gly65
Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr35 40
Thr Cys Asn Thr Ala Asp Gin Lys Tyr Cys50 55
GlyArgAsp
Gly60
Leu Gin Val Ala15
Ser Gin Ser lie30
Gly45
Gly
Ser Thr Thr
Thr Trp Gin
lie lie Asp Lys Leu Asp Tyr lie Gin Gly Met Gly Phe Thr Ala70 75 80
lie Trp lie Thr Pro Val Thr Ala Gin Leu Pro Gin Thr Thr Ala Tyr85 90 95
GlyGluHis
Asp
Asn
Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gin Gin Asp lie Tyr Ser Leu Asn100 105 110
Tyr115
Glu130
ArgTyr AspPhe Ser Ser
Gly145
GlyGlyGlyGin
Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu120 125
Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met135 140
Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr150 155
Ser Val Phe Lys
Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe lie Gin Asn165 170 175
Glu Asp Gin Thr Gin Val Glu Asp180
Ser Leu Pro Asp Leu Asp Thr195
Thr200
Cys185
Lys
Trp
Asp
Leu Gly Asp Asn Thr190
Pro160
TyrVal
Val
Val
205
Asn Glu Trp
丁yr
Arg225
Asp210
Val
Trplie Asp Thr
GlyVal
Ser
230
Leu215
Val Ser Asn Tyr Ser lie Asp Gly Leu220
Asn Lys Ala Ala Gly Val245
Pro Als Tyr
Tyr Pro lie275
Thr260
Tyr
CysTyr
Pro
His Val Gin Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr235 240
Tyr Cys lie Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp250 255
Tyr Gin Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn265 270
Pro Leu Leu Asn Ala Phe280
Ser Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met lie Asn Thr290 295
Lys
Val300
Ser285
Lys
Thr Ser
Ser Asp
Pro305
ArgAla
Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn310 315
GlyCys
Pro320
Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp lie Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala325 330 335
Phe lie lie Leu Asn340
Glu Gin His Tyr Ala Gly355
AspGly
Gly
Asn360
lie345
Pro lie lie
Tyr
Ala350
Gly
Gin
Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala ThrTrp Leu Ser Gly Tyr Pro370
Arg Asn Ala lie
Ser385
Arg390
Thr375
Asn
Val Thr Tyr LysLys
Asn405
Pro
MetLysTyr
ArgGly
Thr450
Ala435
TrpAsp
Ser Gly Asp Ser
Gly420
Thr Asp Gly
Asp Ser GluTyr Ala lie
lie Tyr Lys410
Ser Gin lie425
Tyr Thr Leu440
Thr465
Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val470
Pro Arg Val Leu Tyr Pro Thr485
Leu Tyr380
Ser Lys395
Ala Gly Gin Gin Leu Thr Glu Val455
Glu Lys Leu490
Lys Leu lie AlaAsp Thr Gly
Asp Asp Thr
Val Thr lie
Ser Leu
lie Gly460
Pro Met475
Ser445
Cys
Thr lie415
Leu Ser430
Gly AlaThr Thr
Ala Gly Gly
Ala Gly Ser
Lys lie495
Phe400
Pro
AsnGlyVal
Leu480
Cys
Ser Ser Ser
<210> 19<211〉 21〈212〉 DNA
〈213〉 黑曲霉(Aspergillus niger)<400> 19
ggcagcagga tatgtaagtc g
21
<210> 20〈211〉 21〈212〉 DNA
〈213〉 黑曲霉(Aspergillus niger)<400> 20
cactgtaatc gactgagcta c
21
<210><211〉<212〉<213>
<220><221〉<223>
<220>〈221〉〈222〉〈223〉
21
2520DNA
黑曲霉(Aspergillus niger)
misc—featuren=a, c, g或t
misc—feature
(io):. (io)
n二a， c, g或t
〈400〉 21ctgcagaatn
gcttaaagta
gccatgcUg
tgtcccttgtgaggatagcagaaggcattt
cttctgcgaa tcgcttggat tccccgcccc tggccgtaga 60
cgatgcgatg tatcacaaca tata犯tact agcaagggat 120
accgacaaca tcacatcaag ctctcccttc tctgaacaat 180
atgatggtcg cgtggtggtc tctatttctg tacggccttc 240
583ggtCgCggCacctgctttggctgcaacgcctgcggactggcgatcgcaatccatttatt300
tccttctcacggatcgatttgC33gg3Cggatgggtcgacgactgcgscttgtaatactg360
cggatcaggtgtgttgttacctactagctttcagaaagagg犯tgtaiaactgacttgata420
tagaaMactgtggtggaacatggcagggcaggtaaattgcccctttatc480
aaggaaaagcagaagaaaaat aaaat aaaaagaactctagtcctaaccat540
cacatagttggactatatccaggg肪tgggcttcacagccatctggatcacccccgttac600
agcccagctgccccagaccaccgcatatggagatgcctaccatggctactggcagcagga660
tatgtaagtcgatttctttaaMatctacctgtcatcttttacatcaatatg犯ctaact720
tgatggttttagatactctcctacggcactgcagatgacttg犯ggcgct780
ctcttcggcccttcatgagagggggstgtatcttatggtcgatgtggUgctaaccatat840
ggttcgtggtcctttgcaactgacttcgcggatatggttcatttcagtactgac幼tgag900
taatatcagggctatgatggagcgggtagctcagtcgattacagtgtgtttaaaccgttc960
ag"ttcccaagactacttccacccgttctgtttcsttcaaaactatgaagatcagactcag1020
gttgaggattgctggctsggagatsac3ctgtctccttgcctgatctcgataccaccaag1080
gatgtggtcaagaatgaatggtacgactgggtgggatcattggtatcgaactactccagt1140
aagatatttctccctcattctaceiacttggctgatcgatgaatcagttga1200
cggcctccg"tatcgacacagtaaaacacgtccagaaggacttctggcccgggtacaacaa1260
agccgcaggcgtgtactgtatcggcgaggtgctcgacggtgatccggcctacacttgtcc1320
ctaccagaacgtcatggacggcgtactgaactatcccatgtatggttcctccaaccatga1380
gccttcttgcaagtctcatctcctaacgaaacggct犯犯ccagttactatccactcctc1440
aacgccttcaagtcaacctccggcagcatggacgacctctcaacaccgtc1500
犯atccgactgtccagactcaacactcctgggcacattcgtcgagaaccaCgElC犯CCC31560
cggttcgcUcg"taagtcttcccttttattttccgttcccaatttccacaceigaacccc31620
cctaacaagagcaaagttacacc犯cgacatagccctcgcc犯gaacgtcgcagcattca1680
tcatcctcaacgacggaa/tccccatcatctacgccggccaagaacagcactacgccggcg1740
gaaacgaccccgcgaaccgcgaagc犯cctggctctcgggctacccgaccgacagcgagc1800
tgtacaagttaattgcctcccgg犯cgcaatccggaactatgccattagcaaagatacag1860
gattcgtgacctacaaggtaagcacaacctctaagcataccctaatggcctatcttcaga1920
gtatctgacac朋gagactaatcactggcaatacag犯ctggcccatctacaaagacgac1980
acaacgatcccgatgcgcaagggcacagatgggtcgcagatcgtgactatcttgtccaac2040
犯gggtgcttcgggtgattcgtataccctctccttgagtggtgcgggttacacagccggc2100
cagcaattgacggaggtcattggCtgCELCgaccgtgacggttggttcggatgg磁tgtg2160
cctgttcc"tatggcaggtgggctacctagggtattgtatccgactgagaagttggcaggt2220
agcaagatxtgttacggctgagcagtcaagctcaagtcccaactgtattgactctgttga2280ctattcctgg gtctccttag atg3tgcagt tgg3ggaata tgcc朋ttgg cacttgtcgc 2340
g"tgttggccg tgagatttat agagaccata ttaaaaaagc acgtgatgtg gcgttggaaa 2400
atggattaga ccttcaacag gtttcgaagg aagacccaga cttcttcgtc aagcaagggg 2460
tgataattgg tgtcgcacgc cggttcgtta gcgacattag agattgggcc aaccaataca 2520
<210〉 22
<211> 498
<212〉 PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
〈400〉 22
Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe 1 5
Leu 10
Gly Leu Gin Val Ala
Arg Ser Gin Ser lie
Tyr Phe Leu leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp 35
Ala Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro 20
Ala 25
Ala
Thr 50
Asp
Asn Thr Ala
Asp 55
Phe 40
Gin
Gly 65
Cys
lie lie Asp Lys Leu Asp Tyr 70
Lys lie
Asp Arg Tyr Gin
Tyr Trp
Gly 45
Gin 30
Ser Thr Thr
Cys
Gly 75
Gly 60
Met
Phe
lie Trp lie Thr Pro Val Thr Ala Gin Leu Pro Gin Thr Thr
Gly Thr Trp Gin Gly
Thr
Gly Glu
Trp Asp Asn
Pro 85
Ala Tyr His
Leu 90
Ala 95
Ala 80
Tyr
Tyr 100
Tyr 115
Gly Ala
Ty: Asp
t Trp Gin Gin Asp lie Tyr Ser Leu Asn 105 110
Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu 125
Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys 120
Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met 135
Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp 150
Phe Ser Ser Gin
His
Gly 145
Glu 130
Tyr
Arg Asp
Tyr 155
Val 140
Ser Val Phe Lys
Pro 160
Asp 165
Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe lie Gin 170
Asn 175
Glu Asp Gin Thr Gin Val Glu Asp 180
Leu
Ser
Pro 195
Asp Leu Asp Thr
Thr 200
Leu 215
Cys 185
Lys Ser
Tyr
Leu Gly Asp Asn Thr Val 190
Val Val Lys Asn Glu Trp
Tyr Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser lie Asp Gly Leu 210
Trp Asp
Ser 220
Arg lie Asp Thr Val Lys His Val Gin Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr 225 230 235 240
Asn Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys lie Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp 245 250
Gly 255
Tyr
Cys Pro Tyr Gin Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn 265 270
Tyr Pro lie Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe l>ys Ser Thr Ser Gly
Pro Ala Tyr
Thr 260Ser
Pro 305
Met 290
275
Asp Asp Leu Tyr
Asn 295
280
Met lie Asn
Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val 310
Arg Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp lie 325
Ala Phe lie lie Leu Asn 340
Glu Gin
His 355
Trp Leu Ser Gly Tyr Pro 370
丁yr Gly
Asp Ala Gly Gly
Asp Gly
lie 345
Ala 330
Pro
Asn 360
Asp Pro
Thr 375
Ser 385
Asp Ser Glu
Arg Asn Ala lie Arg Asn Tyr Ala lie 390
285
Thr Val Lys 300
Glu Asn His 315
Leu Ala Lys lie lie Tyr
Ala Asn Arg 365
Leu Tyr Lys 380
Ser Lys Asp 395
Val Thr 丁yr Lys Lys
Asn 405
Met Lys Tyr
丁hr
465
Pro
Tyr
Arg Gly
Thr 450
Ala 435
Gly 420
Ser
Trp Pro lie Tyr Lys Asp Asp Thr 410
Thr Asp Gly Ser Gin lie Val Thr lie 425
Asp Ser Tyr Thr Leu
Tyr 440
Gly
Ala Gly Gin Gin Leu Thr Glu Val
Leu 455
Pro Met Ala 475
Val Gly Ser Asp Gly Asn Vsl Pro V3I 470
Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser 485
Arg Gly
Leu 490
Ser Asp Asp Asn
Asn Val 335
Ala Gly 350
Cys
Pro 320
Ala
Gin
Glu Ala Thr
Leu lie Ala
Ser Leu Ser 445
lie Gly Cys 柳
Thr Gly
Thr lie 415
Leu Ser 430
Gly Ala Thr Thr Gly Gly
Lys lie 495
Phe 400
Pro
Asn Gly Val
Leu 480
Cys
〈210〉 23
<211> 3494
<212> DNA
〈213〉 黑曲霉(Aspergillus niger) <220>
<221〉 misc—feature
<222〉 (3375)..(3370)
<223> n=a， c' g或t
<400〉 23
tgctccctcg gccaagcgcc aataacgtcc gattcatccc attcctcgtc cagctggcga 60
actccggagg ttgattgctc gctcgctctc agttggccac caaacttact cgtccccctc 120
cttcaccctc cctcctctgc caatgctaca gagtacttgg ctaggctact atcttctcag 180
ctgggtgaag aacaacgggc cccgtgcgtg atgagcaaaa gcgtctgaca tgcagcaact 240
gcagtatact ggagcccgcg gctaccgagg aactcgtgct cgtgtgccac cacatcgaag 300
tgagttgatg cgtcttgtcc atgcagtgtc ggcgtggcct aaagtacggg ccaaacctgt 360
ctgacttcat cccacactat taccccctcc ctcattctcc cctgattcgg cccaataagg 420aaatcacttagtcaatcaatcctgccattaccggcgcgtaacgcgcggac480
tgtctcttactcccc"tcgcggtgggcggcccagccagccccatccttactagatttagcg540
aattactggtcattagccctgtacgggggaggggcggg犯cgaataatag600
aataaattta3taaag3aaa犯gagggggggggagcttatctaggcccctgctgcattgc660
attcggacatttttcgacttgtcacaggcatccgccgatggcgtcgeittg720
accattttcttttcttttctcggcgctgggatggtggccaatggc犯tgg780
ttcgttxaccggagtagggtgtacgtgcattgtgtggattgacgatgattctcggccaag840
ggcttgcgUgcaatcccaccaggaggggaatgttgcagacagacag犯agcaaaagaag900
ttcttgaaaaatgatcttctcaggtaMgaatattggttg960
ctggcgggctgatcttctcccgacacg"tctgtcaccttctggcccttcct1020
ttctatctcttccttctcatcatcagtctcctttctctcctaccttcact1080
ctccactttctcctttcgaactctcctcctcattctcacctatatatacc1140
ttgtgcttttctcgcaatgasagttgatacccccgattctgcttccaccatcagcatgac1200
caacactatcaccatcaccgtagagcaggacggtatctatgagatcaacggtgcccgtca1260
agagcccgtggtcaacctgaacatggtcaccggtgcgagc犯sctgcgcaagcagcttcg1320
cgagaccaatgsgttgctcgtgtgtcctggtgtgtacgacggtctgtccgcccgtattgc1380
catcaacctgggcttcaagggcatgtacatggtatgttggattccttagactacctttcc1440
ccacagtcaacacttctccgcttccgcgatggaga犯aaBgatcatactaacggaaaggt1500
cagaccggcgccggtactaccgcgtctagactgggcatggccgatctgggtctagcccac1560
atctacgacatgaagacc肌cgc卿gatgatcgcgaacctggacccctacggtcctccc1620
ctgatcgcagacatggacactggctacggaggtgag犯tcccccatctccactgtctgcc1680
a3gac3taatgatctacccgcgccaaaaagc犯aacggC3atatagacccagttccccac1740
aaaacaaaaataggccccctgatggtcgcccgttccgttcaacaatacat1800
ccaagccggagtcgcgggattcc3C3tcgag3tgCgg3C31860
cctggcaggcaagcgcgtcgtcaccatggeicgaatacttgactcgcatccgcgccgccaa1920
gctcaccaaggaccgcctccgcagcgacatcgtgctgattgcccgcaccgacgccctcca1980
gcagcacggctacgacgagtgcattcgccgccttaaggccgcccgcgatcttggcgccga2040
tgttggtctcctcgagggcttcaccagtEiagg柳tggcgaggcggtgtgtccaggacct2100
tgcgccttggccgcttctgctcaacatggtggag犯cggtgctgggccggttatttccgt2160
cgatgaggct3ggg認tgggcttccgcattatgatcttctcgttcgcttgcattactcc2220
tgcctatatggggattaccgctgctctggagaggctc肌ggatggtgtggttgggtt2280
gcccgaggggatggggccgaagaagctgtttgaggtgtgcggattgatggactcggtgag2340
ggttgataccgaggctggtggagatgggtttgctaatggtgtttaattcttttctttttt2400
tgattcttaattccctggttgmtgttgtgaaagtttcttatttttctggtttgtttta2460tttccccttctggtaactaattttgtgtgag肌agagUgUgagttgggttgaactgca2520
ttggatgggattgatttattttcgggatca犯gtga犯gg犯gggaagggggctgtgtta2580
ttggtmcgagtggggaccgatatattcctactataca/tatcgaagcttgcgtggtaca2640
tatactagtatctactacatgg犯atg3aa3Ctgggtgttagatttcagt2700
tgacaggtcttatgttcgtttaccgatagagtaattcctgcttctcactccatgtgagcc2760
caatcacaatggei3ttgt犯tctggttgccttataagtacttagtactctgtactctgta2820
ctacttctcgcatcacatca犯tcttaatacttagtacgtagtttgtttcscccagcaas2880
accttattgccttaacaatcatat"tctcagtaagcacgaggagagaagta2940
ttctagaccctgacagaacwccctgatcgacagtcacttaccc犯caaagtaagtggtct3000
ctaccctctgattacagttaaggcaggcagtagt犯gca^gaag&3g犯a3060
ttaactactaagtttctcactactgcatgcacgaccacggagtcgccgtgcaaaaaaatt3120
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gtcgatcgttttctgttttctttttgkatttttatttytgttggwctctgtttgtgttgt3360
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gaaatggattatgctattgattgatgaatggtgatgatctgcgtggaaattaatgtcaga3480
gtct,tgmtgattca3494
<210> 24
〈211> 341
<212> PRT
<213〉 黑曲霉(Aspergillus niger)
〈400〉 24
Met Lys Val 1
丁hr lie Thr
Ah Arg Gin 35
Lys Leu Arg 50
Gly Val Tyr 65
Lys Gly Met Met Ala Asp
Glu Met lie 115
Asp Thr 5
lie Thr 20
Glu Pro
Lys Gin Asp Gly
Tyr Met 85
Leu Gly 100
Ala Asn
Pro Asp Ser Ala
Val Glu Gin Asp 25
Val Val Asn Leu 40
Leu Arg Glu Thr 55
Leu Ser Ala Arg 70
Thr Gly Ala Gly
Leu Ala His lie 105
Leu Asp Pro Tyr 120
Met Asp Thr Gly Tyr Gly Gly Pro Leu
Ser Thr lie Ser Met Thr Asn 10 15
Gly lie Tyr Glu lie Asn Gly 30
Asn Met Val Thr Gly Ala Ser 45
Asn Glu Leu Leu Val Cys Pro 60
lie Ala lie Asn Leu Gly Phe 75 80
Thr Thr Ala Ser Arg Leu Gly 90 95
Tyr Asp Met Lys Thr Asn Ala 110
Gly Pro Pro Leu lie Ala Asp 125
Met Val Ala Arg Ser Val Gin
63Gin 145
130
Tyr lie Gin Ala
Gly 150
135
Val Ala Gly
140
Phe His lie Glu Asp 155
Gin lie 160
Cy-165
Gin Asn Lys Arg Cys Gly His Leu Ala Asp Glu Tyr
Leu 180
Gly Arg
Thr Arg lie Arg
Leu Arg
Ser 195
His
Gly 210
Asp
Asp Glu Cys lie Arg 215
Tyr
Ala Asp Val Gly Leu Leu Glu 230
Arg Arg Cys Val
Gly 225
Gin
245
Gly 260
Ala 185
lie Val Leu lie Ala 200
Arg Gly
Asp Leu Ala Pro Val Glu Asn Gly Ala Gly Pro Val
lie 265
Met Gly Phe Arg lie Met lie Phe Ser 275 280
Tyr Met Gly lie Thr Ala Ala Leu Glu 290 295
Gly Lys Arg Val Val Thr Met 170 175
Ala Lys Leu Thr Lys Asp Arg 190
Arg Thr Asp Ala Leu Gin Gin 205
Leu Lys Ala Ala Arg Asp Leu 220
Phe Thr Ser Lys Glu Met Ala 235 240
Trp Pro Leu Leu Leu Asn Met 250 255
Ser Val Asp Glu Ala Arg Glu 270
Phe Ala Cys lie Thr Pro Ala 285
Arg Leu Lys Lys Asp Gly Val 300
Val Gly Leu Pro Glu Gly Met Gly Pro 305 310
Gly Leu Met Asp Ser Val Arg Val Asp 325
Lys Lys Leu Phe Glu Val Cys 315 320
Thr Glu Ala Gly Gly Asp Gly 330 335
Phe Ala Asn Gly Val 340
<210> 25 <211> 21 <212〉 腿
〈213〉 黑曲霉(Aspergillus niger) 〈400> 25
ctacgacatg aagaccaacg c 21
<210〉 26 〈211〉 21 <212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger) <400〉 26
gcaccgttct ccaccatgtt g 21
<210> 27 <211〉 1389 〈212〉 DNA
〈213〉 南极假丝酵母(Candida antarctica) 〈400> 27
atgcgagtgt ccttgcgctc catcacgtcg ctgcttgcgg cggcaacggc ggctgtgctc 60 gcggctccgg cggccgagac gctggaccga cgggcggcgc tgcccaaccc ctacgacgat 120cccttctacacgacgccatccaacatcggcacgtttgccaagggccaggtgatccaatct180
cgcaaggtgcccacggacatcggcaacgccaacaacgctgcgtcgttccagctgcagtac240
cgc3ccacc3atacgcagaacgaggcggtggccgacgtggccaccgtgtggatcccggcc300
aagcccgcttcgccgcccaagatcttttcgtaccaggtctacgaggatgccacggcgctc360
gactgtgctccgagctacagctacctcactggattggaccagccg犯caa ggtgacggcg420
gtgctcgacacgcccatcatcatcggctgggcgctgcagcagggctacta cgtcgtctcg480
tccgaccacg朋ggcttcaaagccgccttcatcgctggctcatggctatc540
ctcgacggcatccgcgcgctcagaacctgccatccgacagcaaggtcgct600
cttgagggctacagtggcggagctcacgccaccgtgtgggcgacttcgcttgctgaatcg660
tacgcgcccgagctcaacattgtcggtgcttcgcacggcggcacgcccgtgagcgccaag720
gacacctttacattcctcaacggcggacccUcgccggctttgccctggcgggtgtttcg780
ggtctctcgctcgctcatcctgatatggagagcttcattgaggcccgattgaacgccaag840
ggtcagcggacgctcaagcagatccgcggccgtggcttctgcctgccgcaggtggtgttg900
acctaccccttcctcaacgtcttctcgctggtcaacgacacgaacctgctg犯tgaggcg960
ccgatcgctagcatcctcaagcaggagactgtggtccaggccgaagcgagctacacggta1020
tcggtgcccaagttcccgcgcttcatctggcatgcgatccccgacgagatcgtgccgtac1080
cagcctgcggctacctacgtC朋gg3gCa2Ltgtgccaagggcgccaacatcaatttttcg1140
ccctacccgatcgccgagcacctcaccgccgagatctttggtctggtgcctagcctgtgg1200
tt"tatcaagcaagccttcgacggcaccacacccaaggtgatctgcggcactcccatccct1260
gctatcgctggcatcaccacgccctcggcggaccaagtgctgggttcgga cctggcc犯c1320
cagctgcgcagcctcgacggcaagcagagtgcgttcggcaagccctttggccccatcac31380
ccaccttag1389
〈210〉 28
<211〉 462
<212> PRT
<213> 南极洲假丝酵母(Candida antarctica) <220>
〈221〉 MISC_FEATURE
<222〉 (138^.. (1389)
<223> X=Xaa
<400> 28
Met Arg Val Ser Leu Arg Ser lie Thr Ser Leu Leu Ala Ala Ala Thr 15 10 15
Ala Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Thr Uu Asp Arg Arg Ala 20 25 30
Ala Leu Pro Asn Pro Tyr Asp Asp Pro Phe Tyr Thr Thr Pro Ser Asn 35 40 45
lie Gly Thr Phe Ala Lys Gly Gin Val lie Gin Ser Arg Lys Val Pro 50 55 60Thr 65
Arg
Trp lie Pro
Val 90
Ala 100
Ser 110
Cys Ala Pro
Ser 125
Tyr Leu
Tyr Ser
Lys Pro Ala Ser Pro Pro Lys lie Phe 105
Val Tyr Glu Asp Ala Thr Als Leu Asp 115 120
Leu Thr Gly Leu Asp Gin Pro Asn Lys Val Thr Ala Val Leu Asp 130 135 140
lie lie lie Gly Trp Ala Leu Gin
Pro 145
Trp 150
Phe 170
Gly Met Ala lie Leu 180
Arg 185
Leu Pro
Ser 195
His Ala Thr
Ala 210
Asp Val
Leu 225
Trp
Asn lie Val Gly
Asp
Ser Lys Val Ala Leu Glu Gly 200
Ala
Lys Tyr
Ser 205
Thr 215
Ser Leu Ala Glu
Ser 220
Ala 230
Gly
Asp Thr Phe Thr Phe Leu Asn Gly Gly 245
Pro 250
lie Glu
Ala 275
Arg Leu Asn Ala Lys Gly Gin Arg Thr 280
Gly
Leu 285
Leu 305
Leu 310
Asp
Pro lie Ala Ser lie Leu Lys Gin Glu 325
Thr 330
Glu 335
Tyr 80
Asp lie Gly Asn Ala Asn Asn Ala Ala Ser Phe Gin Leu Gin 70 75
Thr Thr Asn Thr Gin Asn Glu Ala Val Ala Asp Val Ala Thr Val 85
Thr 95
Gin Tyr Thr
Ala Leu Gin Gin Gly Tyr Tyr Val Val 155
Ser 160
Tyr
Ser Asp His Glu Gly Phe Lys Ala Ala Phe lie Ala Gly Tyr Glu Glu 165
Glu 175
Lys
Gly lie Arg Ala Leu Lys Asn Tyr Gin Asn
Tyr 190
Gly Gly Ala
Tyr Ala Pro Glu
Ser His Gly Gly Thr Pro Val Ser Ala Lys 235 240
Phe Ala Gly Phe Ala Leu 255
Ala Gly Val Ser Gly Leu Ser Leu Ala His Pro Asp Met Glu Ser Phe 260 265 270
Lys Gin lie
Arg Gly Arg Gly Phe Cys Leu Pro Gin Val Val Leu Thr Tyr Pro Phe 290 295 300
Asn Val Phe Ser Leu Val Asn Asp Thr Asn Leu Leu Asn Glu
315
Val Val Gin Ala
Ala 320
Ala
Ser Tyr Thr Val Ser Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe lie Trp His Ala 340 345 350
lie Pro Asp Glu lie Val Pro Tyr Gin Pro Ala Ala
360
Asp 355
Thr 365
Val
Tyr
Glu Gin Cys Ala Lys Gly Ala Asn lie Asn Phe Ser Pro Tyr Pro 370
Ala 375
Ser 380
Ala 385
Glu His Leu Thr Ala Glu lie Phe Gly Leu Val Pro Ser Leu 390 395
Lys lie
Trp 400
Phe lie Lys Gin Ala Phe Asp Gly Thr Thr Pro Lys Val lie 405 410
Lys Thr Pro lie
Pro 420
Gly
Ala lie Ala Gly
Cys 415
lie 425
Gly
Thr Thr Pro Ser Ala Asp Gin 430Val Leu Gly Ser Asp Leu Ala Asn Gin Leu Arg Ser Leu Asp Gly Lys
435 440 445
Gin Ser Ala Phe Gly Lys Pro Phe Gly Pro lie Thr Pro Pro
450 455 460
<210> 29
<211> 2794
<212〉 腿
〈213〉 嗜热柱顶孢(Scytalidum thermophilura)
<400> 29
atgaacagagtcacg犯tctcctcgcctgggccggcgcgatagggctcgccc3agc犯c360
tgtccctttgcggaccctgccgctctgtatagtcgtcaagatactaccagcggccagtcg120
ccacttgcagcatacgaggtggatgacagcaccggatacctgacctccgatgttggcggg180
cccattcaggaccagaccagcctcaaggcaggcatccggggtccgacccttcttgaggac240
tt,tatgttccgccagaagatccagcacttcgaccatgaacgggtaaggacat犯tgctca300
cacgsgcggctgcgtgcccacctat"ttccgagacattgggctggctggctggctgtgact360
gcttgagtttgggg織tacggagtaccttactgacgcgctgaaccactccaggttcccg420
aaagggcggtccatgctcgaggcgctggagcacacgggaccttcacgagttacgccgact480
ggagtaacatcaccgcggcgtcctttctgaacgccactgg3犯gcagacgccggtgtttg540
tccggt.tctcgaccgtt.gctgggtctcgsgggagcgcagacacggcgagagacgttcatg600
gtttcgcgacgcggtttgtaagttttgttgtgtttcattcgttccggtctgtaga_gg3gg660
gttaggatatgagctaacgtgtgtgtgtgtgtgaagtacactgatgaaggcaactttgta720
cgtcccacgcatggtcctcaattctcttatctggcagccatgtggtcattgtcgacgttg780
ctaacttgcgtaggatatcgtcggaa^caacatcccggtattcttcattc犯gatgcaat840
ccagttccctgaccttatccactcggtcaagccgcgtcccgacaacgagattccccaagc900
ggcgscggctcttgggacttcttcagccagcagccaagcaccatggtaag960
caatggaccaaggagccgcacctggggtgacatgccagggagtacacaaggcgttccgat1020
gaccctcgtgtgaccaaggcagtacaacactccacggaggactcgaagagattcggcaat1080
atggaacacagaactgacaggatggtagcacacgttgttctgggccatgtccggccacgg1140
aatccctcgcagctaccgcc3ta_tggtacgtttgcctggctgagatgaccgtgaatccat1200
ttctaacctcaagcccaggatggcttcggcgtccacacgttccggtttgtcaaagatgac1260
ggctcgtccagtggcatUcaagtcacgccagggaaaggcgagtctagtc1320
tggga卿ggcgcaggttctttctggcaagaatgccgacttccaccgtcaggacctctgg1380
gatgctattgagtccgggaacggaccagaatgggatgtctgcgtccagattgtcgatgag1440
tcccaggcgcaagcctttggcttcgacttgctggacccgacaaagatcatccccgaggag1500
tacgcccccttgacgaagctgggcctcttgaagctggatcgcaatccgaccaactacttc1560
gccg柳cggagcaggtcatgttccaacccggtcatatcgtccgcggcatcgacttcacg1620
gaggatcccctgctacagggacgcctcttttcgtaccttgacacgcagctgaaccggaat1680ggcgggcccaactttgagcagctgcccatcaacatgccgc gggtgccgattcacaacaat1740
aatcgcgacggcgccggccagatgttcatccacaggaaca agtatcctgtaagtgcctct1800
"tttgcctcgatcgUgtggtgccggcttgctgacageicgc agtacactcccaacaccctg1860
aacagtggttatccgcggcaaatgccggac gcggattcttcacagcgcct1920
ggccgtaccgccagcggtgccctcgtccgtgaggtgtxgc c犯cattc犯cgaccactgg1980
tcgcagccccg"tctxttcttcaactccctcactcccgtcg aacaacagttcctcgtcaac2040
gccatgcgctccttgtgaagtCgg犯g肪g tC￡l3g33g￡l￡l CgtgCtC3CC2100
cagctcaaccgcgtcagccatgacgtggccgtgcgcgtgg ccgccgctatcggcctcggc2160
gcgcccgacgcggacgEicacatactaccacaacaacaaga cggctggcgtctcaatcgtt2220
ggaagcgggcccttgcctacC3tcaagactctccgcgtcg gcatcctggctaccacgagc2280
gagtcgagcgcgctggatcaggcggcccagctccgcaccc gtctggaaaa ggacgggctt2340
gtggtcacggttgtggctgaaacgctgcgcgagggggtag acc卿cgta ctcgacggcg2400
gatgccacgggtttcgacggcgUgttgttgtggacgggg cggcggcgctgtttgccagc2460
accgcgtcgtcgccgttgUcccgacgggcaggccgttgc agatctttgtggacgcgtat2520
cggtggggaaagccggtcggtgtgtgtggtggg犯gtcga gcgaggtgUggEltgCggCg2580
gatgttccggaagacggggscggggtgtattcggaggagt cggtggacatgtttgtggag2640
gagtUgagasggggttggctactttcagggtgagtcttg atgcctttgtttgttgtgat2700
gttattgttt"tgttt"tgtCtcggactttgtgaaag組ga cggactgacgtctttggtat2760
ctagtttaccgatcggtttgctctcgactcttag2794
〈210〉 30 <211〉 717 <212> PRT
<213> 嗜热柱顶孢(Scytalidum thermophilum) <400> 30
Met Asn Arg Val Thr Asn Leu Leu Ala Trp Ala Gly Ala lie Gly Leu 15 10 15
Ala Gin Ala Thr Cys Pro Phe Ala Asp Pro Ala Ala Leu Tyr Ser Arg 20 25 30
Gin Asp Thr Thr Ser Gly Gin Ser Pro Leu Ala Ala Tyr Glu Val Asp 35 40 45
Asp Ser Thr Gly Tyr Leu Thr Ser Asp Val Gly Gly Pro lie Gin Asp 50 55 60
Gin Thr Ser Leu Lys Ala Gly lie Arg Gly Pro Thr Leu Leu Glu Asp 65 70 75 80
Phe Met Phe Arg Gin Lys lie Gin His Phe Asp His Glu Arg Val Pro 85 90 95
Glu Arg Ala Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala His Gly Thr Phe Thr 100 105 110
Ser Tyr Ala Asp Trp Ser Asn lie Thr Ala Ala Ser Phe Leu Asn Ala
68Thr
Gly 130
115
Lys Gin Thr Pro
Val 135
120
Phe Val Arg PheSer 145
Arg
Arg Gly Ser Ala Asp Thr Ala Arg Asp 150
Ser 140
125
Thr Val Ala Gly
Gly Tyr
Val 155
Thr 160
His Gly Phe Ala
Arg Phe Tyr Thr Asp Glu Gly Asn Phe Asp lie Val Gly Asn Asn lie 165 170
Pro Val Phe Phe lie Gin Asp Ala lie Gin Phe Pro Asp
Gly Asp
Ser Val Lys Pro Arg Pro Asp
Phe 180
lie 185
Leu 190
Asn 175
lie His
Lys 195
Asn 200
Glu lie Pro Gin Ala Ala Thr Ala 205
Arg
His Asp Ser Ala Trp Asp Phe Phe Ser Gin Gin Pro Ser Thr Met His 210
Ala
Phe 215
Pro 220
Thr 225
Leu Phe Trp His Met Asp Gly
Met 230
Ser Gly His Gly lie Pro Arg Ser Tyr 235
Phe 245
Gly Ala
Gly Val His Thr Ser Ser Lys Leu lie
Phe 250
Asp 255
Lys 260
Lys
Ser Leu Val Trp Glu Glu 275
Arg Phe Val Lys
Trp His Phe Lys Ser Arg Gin Gly
270
Ala 280
His 265
Gin Val Leu Ser
Arg 240
Asp Lys
Gly 285
Asp Phe His Arg Gin Asp Leu Trp Asp Ala lie 290 295
Pro 305
Glu
Arg Asp
Glu 300
Ser
Val Cys Val Gin lie Val Asp Glu Ser
Cys 310
Trp
Ala Phe Gly Phe Asp Leu Leu Asp Pro
Asp 315
Lys Asn Ala Gly Asn Gly Gin
Ala
Gin 320
Asp 325
Tyr Thr
Asp
Ala Pro Leu Thr Lys Leu Gly
Thr 330
lie lie Pro Glu Glu 335
Leu 340
Leu 345
Lys
Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro 350
Asn
lie
Leu 385
Val 370
Phe
Tyr 355
Arg Ser
Lys
A]a Glu Thr Glu Gin Val Met Phe Gin Pro Gly His
Glu 360
Leu 380
Phe
Gly lie Asp Phe Thr Glu Asp Pro Tyr Leu Asp Thr Gin Leu Asn Arg Asn Phe Glu Gin Leu
Asp 390
Arg 395
Pro 405
lie Asn Met Pro Arg Val Pro 410
Gin 365
Leu Gly lie
Gly Gin Gly Arg
Gly His
Pro
Asn 415
Asn 400
Asn
Asn Arg Asp Gly Ala Gly Gin Met Phe lie His Arg Asn Lys Tyr Pro 420 425 430
Tyr Thr Pro Asn Thr Leu Asn Ser Gly Tyr Pro Arg
Pro 435
Ser 440
Gin 445
Ala Asn Gin
Asn Ala Gly Arg Gly Phe Phe Thr Ala Pro Gly Arg Thr Ala Ser Gly 450 455
Arg 460
Arg
Leu Val Arg Glu Val Ser Pro Thr Phe Asn Asp His Trp Ser 470 475
Pro Arg Leu Phe Phe Asn Ser Leu Thr Pro Val Glu Gin Gin Phe Leu
Ala 465
Gin 480Vsl Asn Als
Met 500
485
Arg Phe Glu lie
Ser 505
490
Leu Val Lys
Lys Lys Asn Val Leu Thr Gin Leu Asn Arg Val Ser '515 520
Arg
Val Arg Val Ala Ala Ala lie Gly Leu Gly 530 535
Thr Ala Gly
Ser Glu 510
His Asp 525
495 Glu
Val
Val Ala
lie 535
Ala Pro 540
Thr 545
Tyr Tyr His Asn
Asn 550
Val Ser 555
Asp Ala Asp Asp lie Val Gly
Ser 560
Lys
Gly Pro Leu Pro Thr lie Lys Thr Leu Arg Val Gly lie Leu Ala Thr
575
Thr 565
Arg 570
Thr Ser Glu Ser Ser Ala Leu Asp Gin Ala Ala Gin 580 585
Leu Glu
l>ys 595
Asp Gly Leu Val Val Thr Val Val Ala 600
Glu Gly Val Asp Gin Thr Tyr Ser Thr Ala
Gly 610
Tyr 615
Gly 625
Val Val Val Val Asp Gly Ala Ala Ala 630
Asp Ala 620
Leu Phe 635
Leu Arg 590
Glu Thr 605
Thr Gly Ala Ser
Thr
Leu
Phe
Thr
Arg Arg Asp
Ala 640
Ser Ser Pro Leu Phe Pro Thr Gly Arg Pro Leu Gin lie Phe Val Asp 645 650 655
Ala Tyr Arg
Glu
Tyr Val
Trp 660
Lys
Asp Ala Ala
Ser Glu Glu Ser Val Asp 690
Leu 675
Gly Ala
Pro Val Gly Val Cys Gly 665
Asp Val Pro Glu Asp Gly
Met 695
Val 680
Phe Val Glu
Gly Lys 670
Asp Gly 685
Ser Val
Ser
Tyr
Glu Phe 700
Ala Thr Phe Arg Phe Thr Asp Arg Phe Ala Leu Asp 705 710 715
Glu Lys Gly Leu
Ser
权利要求
1.一种生产异源多肽的方法，包括(a)在适于生产异源多肽的培养基中培养亲本黑曲霉菌株的突变体，其中(i)该突变菌株包括编码异源多肽的第一核苷酸序列和包括glaA、asa、amyA、amyB和oah的变体的一种或多种第二核苷酸序列，以及(ii)当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、中性α-淀粉酶B和草酸水解酶的生产；以及(b)从培养基回收异源的多肽。
2. 权利要求1的方法，其中由第一核苷酸序列编码的异源多肽是抗体、 抗原、抗菌肽、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂、神经递质、受体、报 告蛋白、结构蛋白、或转录因子。
3. 权利要求2的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解 酶、异构酶、或连接酶。
4. 权利要求l的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌抹 相比，突变菌林生产至少减少25%的葡糖淀粉酶、酸稳定的a-淀粉酶、中 性a-淀粉酶A、中性a-淀粉酶B、和草酸水解酶中的各酶。
5. 权利要求l的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌抹 相比，该突变菌抹完全缺乏葡糖淀粉酶、酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉 酶A、中性a-淀粉酶B、和草酸水解酶。
6. 权利要求1的方法，其中该突变菌抹进一步包括编码具有蛋白质分 解活性的酶的一种或多种基因的变体。
7. 权利要求l的方法，其中突变菌抹进一步包括编码选自糖酶、羧肽 酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱 氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苦酶、p-半乳糖苦酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苦 酶、卣素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂 肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六 磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、a-l,6-转葡糖芬酶、 转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一种或多种基因的变体。
8. —种亲本黑曲霉菌抹的突变株，包括编码异源多肽的第一核苦酸序列和包括、 as"、 awj;j 、 am_y5和oa/z的变体的一种或多种第二核苷酸 序列，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌林相比，该突变菌抹缺 乏葡糖淀粉酶、酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、中性a-淀粉酶B和草酸水解酶。
9. 权利要求8的突变菌林，其中由第一核苷酸序列编码的异源多肽是 抗体、抗原、抗菌肽、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂、神经递质、受 体、报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。
10. 权利要求9的突变菌林，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、 裂解酶、异构酶、或连接酶。
11. 权利要求8的突变菌抹，当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌林 相比，其生产至少减少25%的葡糖淀粉酶、酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀 粉酶A、中性a-淀粉酶B、和草酸水解酶中的各酶。
12. 权利要求8的突变菌株，当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌林 相比，其完全缺乏葡糖淀粉酶、酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、中 性a-淀粉酶B、和草酸水解酶。
13. 权利要求8的突变菌抹，其进一步包括编码具有蛋白质分解活性的 酶的一种或多种基因的变体。
14. 权利要求8的突变菌林，其进一步包括编码选自糖酶、羧肽酶、过 氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖 核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、P-半乳糖普酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卣 素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、 裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、 酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、a-l，6-转葡糖苷酶、转谷氨 酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一种或多种基因的变体。
15. —种用于获得亲本黑曲霉菌抹的突变抹的方法，包括(a) 将编码异源多肽的第一核苷酸序列和包括g/a丄osa、 a附^5、 和oW的变体的一种或多种第二核苷酸序列导入亲本黑曲霉菌抹；以及(b) 鉴定来自步骤(a)的包括改变的核苷酸序列的突变菌林，其中当在相 同条件下培养时与亲本黑曲霉菌抹相比，该突变菌抹缺乏葡糖淀粉酶、酸 稳定的a-淀粉酶、中性a-淀粉酶A、中性a-淀粉酶B、和草酸水解酶的生 产。
16. 权利要求15的方法，其中由第一核苷酸序列编码的异源多肽是抗 体、抗原、抗菌肽、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂、神经递质、受体、 报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。
17. 权利要求16的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂 解酶、异构酶、或连接酶。
18. 权利要求15的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌 抹相比，该突变菌抹生产至少减少25%的葡糖淀粉酶、酸稳定的a-淀粉酶、 中性a-淀粉酶A、中性a-淀粉酶B、和草酸水解酶中的各酶。
19. 权利要求15的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌 抹相比，该突变菌抹完全缺乏葡糖淀粉酶、酸稳定的a-淀粉酶、中性a-淀 粉酶A、中性a-淀粉酶B、和草酸水解酶。
全文摘要
本发明涉及在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法，其包括(a)在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌株的突变株，其中(i)该突变菌株包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT或oah的基因变体的一种或多种第二核苷酸序列，和(ii)当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生产；以及(b)从培养基回收异源的生物物质。
文档编号C12P1/02GK101629204SQ200910167050
公开日2010年1月20日 申请日期2004年3月31日 优先权日2003年3月31日
发明者玛丽亚·康奈利, 霍华德·布罗迪 申请人:诺维信股份有限公司