专利名称：：一种肝癌细胞系及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种肝癌细胞系及其应用。
背景技术：
：肝癌(h印atocellularcarcinoma,HCC)是目前发病率高、治疗困难、死亡率高的恶性肿瘤，全球每年有1000000人死于肝癌(YuAS，KeeffeEB.Managementofhepatocellularcarcinoma.RevGas_troenterolDisord，2003，3(1):8-24)。我国月干癌的死亡率在所有恶性肿瘤中居第二位，年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的53%(PisaniP，ParkinDM，BrayF，etal.Estimatesofworldwidemortalityfrom25cancersinl990.IntJCaner，1999，83:18-29)。虽然肝癌的诊断和治疗有了长足的进步，但生存率在总体水平上变化不是很明显。迄今已建立的一系列人肝癌细胞系(cellline)和人肝癌细胞系的动物模型，为肝癌的发病机理和治疗研究奠定了良好的基础。动物肝癌细胞的建立从20世纪50年代末开始，第一株人肝癌细胞系于1960年建立(陈瑞铭.一株人体肝癌细胞株的建立和一些初步的观察.肿瘤研究论文集，1962，39-47)。目前国内外已建立了动物和人的肝癌细胞系有IOO多株，人肝癌细胞系数十株。人肝癌细胞系因为取材于HCC患者，或人肝癌动物模型，因此，其中的信息与人的更为相似，获得的结果更有意义，应用也更为广泛。人肝癌细胞系取材于原发肝癌组织，建系过程中没有改变其生物学特性早期所建的细胞系大都属于此类(AlexanderJJ，BeyEM，GeddesEW，etal.Establishmentofacontinuouslygrowingcelllinefromprimarycarcinomaoftheliver.SAfrMedJ，1976,50(54):2124-2128;MorrisKM，AdenDP，K丽lesBB，ColtenHR.Complementbiosynthesisbythehumanhepatoma—derivedcelllineH印G2.JClinInvest,1982，70(4):906-913;王金兵，朱德厚，叶秀珍，等.启东肝癌细胞系QGY-7703的建立及其特征.中华肿瘤杂志，1981,3(4):243;董荣春，周荣华，吕发度，等.S匪C-7721人肝癌细胞株的建立及其生物学特性的初步观察.第二军医大学学报，1980，(1):5-9)，它们有一些共同点，如AFP均为阳性，能分泌一些血浆蛋白，但也存在一些明显的差别，PLC/PRF/5和H印G2在裸鼠中成瘤性都较差，而QGY-7703和SMMC-7721异种移植成功率为100%，PLC/PRF/5能检测到HBsAg，H印G2则不含HBV。郭秀婵等建立的3株人肝癌细胞，显示了HBV可以协同AFB1导致肝癌的发生(郭秀婵，蓝祥英，周玲，等.乙型肝炎病毒和黄曲霉素协同作用诱发人肝细胞癌细胞株的建立.病毒学报，2001，17(3).205-209)。丙型肝炎病毒是肝癌的一个重要致病因素，Aoki等建立了一株能成功翻译由重组腺病毒产生的HCVRNAs的人肝癌细胞系(AokiY，AizakiH，ShimoikeT，etal.AhumanlivercelllineexhibitsefficienttranslationofHCVRNAsproducedbyarecombinantadenovirusexpressingT7RNApolymerase.Virology,1998，250:140-150)。具有特征性的人肝癌细胞系MHCC97是利用裸鼠人肝癌高转移模型在体外建立的(TianJ，TangZY，YeSL，etal.Newhumanhepatocellularcarcinoma(HCC)celllinewithhighlymetastaticpotential(MHCC97)anditsexpressionsofthefactorsassociatedwithmetastasis.BrJCancer,1999，81(5):814-821)，该细胞系HBsAg、HBxAg、AFP均阳性，经皮下和肝内接种均可使棵鼠致瘤，并发生肺部转移，肝内接种者，肺转移达100%(12/12)，肺转移灶癌细胞AFP阳性。从该细胞系克隆出的两株细胞的生物学特性有明显差别，高转移株肺转移率为100%，而低转移株仅为40%(LiY，TangZY，YeSL，etal.Establishmentofcellcloneswithdifferentmetastaticpotentialfromthemetastatich印atocellularcarcinomacelllineMHCC97.WorldJGastroenterol,2001,7(5):630-636)。吴小鹏等一株外生型肝癌细胞系EGHC-9901,该细胞系能持续高分泌AFP，能形成完整毛细胆管且有明显微绒毛，说明细胞变异较小(吴小鹏，王占民，刘博，等.外生型肝癌细胞系的建立及生物学特性研究.中华外科杂志，2002，40(8):616-617)。一些人肝癌细胞系其宿主患有其他肿瘤或疾病。KMCH-1是第一株肝癌和胆管癌混合的细胞系，该细胞系在无胸腺鼠中能成瘤，但形成瘤体的分化程度却不同，皮下移植瘤呈低分化，而腹腔内月中瘤分化良好(MurakamiT，YanoH，MaruiwaM，etal.Establishmentandcharacterizationofahumancombinedh印atocholangiocarcinomacelllineanditsheterologoustransplantationi皿udemice.H印atology，1987，7:551-556)。RBHF-l遗传性血色素沉积病的肝癌患者，HBV和HCV均阴性，该细胞系的建立有助于铁沉禾只过多的石开究(SingGK，PaceR，PriorS，etal.Establishmentofacelllinefromahepatocellularcarcinomafromapatientwithhemochromatosis.Hepatology，1994;20:74-81)。Mz-H印-l是第一株致癌物相关的肝癌来源的细胞系，该细胞系的宿主长期暴露在高浓度的二氧化钍环境中，没有肝炎病毒感染(DippoldWG，DienesHP，K皿thA，etal.Hepatocellularcarcinomaafterthorotrastexposure-establishmentofanewcellline(Mz-H印-1).H印atology，1985,5(6):1112-1119)。随着分子生物学技术的发展，人们根据预设目的改造原有的细胞系，从而建立有既定生物学特性的肝癌细胞系。HB611是一株转染了含HBV基因的重组DNA分子和一种抗新霉素基因的Huh6-c15的肝癌细胞系克隆，能聚集核心颗粒并高水平产生和释放HBsAg禾口HBeAg(TsurimotoT，FujiyamaA，MatsubaraK.StableexpressionandreplicationofhepatitisBvirusgenomeinanintegratedstateinahumanh印atomacelllinetransfectedwiththeclonedviralDNA.ProcNatlAcadSciUSA，1987，84(2):444-448)。有人将病人的HCV转染到S匪C-7721细胞中，在至少3个多月的时间里都能在细胞内检测到HCVRNA和HCVNS3，CP10抗原的表达(SongZQ，HaoF，MinF，etal.H印atitisCvirusinfectionofhumanh印atomacellline7721invitro.WorldJGastroenterol,2001,7(5):685-689)。用于治疗性研究的人肝癌细胞系主要用于药物筛选和细胞凋亡机制的研究。如杨俊霞等利用QGY细胞系作为研究模型，采用逐步用顺铂诱导建立了人肝癌顺铂耐药系QGY/(^0，该细胞系和多种抗癌药有交叉耐药性，并且与5-氟尿嘧啶、表阿霉素、羟基喜树碱等多种抗癌药有不同程度的交叉耐药性，且耐药性稳定(杨俊霞，汤为学.人肝癌顺铂耐药细胞系的建立及其生物学特征.癌症，2002，21(8):872-876)。耐药细胞系7721/Adm阿霉素半数致死浓度(IC50)增大4.65倍，并对多种抗癌药物产生耐药性，其耐药性提高了26倍不等，该耐药模型P-gp，MRP表达有非常显著的升高，而GSH/GST的表达无明显变化(杨俊4，2002，21(S):872-876)。2、人肝癌细胞系的应用人肝癌细胞系广泛地应用于肝癌的生物学特性、发病机制、浸润及转移机制、临床诊断、药物筛选及防治等领域的研究，而且已经深入到了基因及分子水平。它主要用于以下几个方面。1)在肝癌发病机制研究中的应用肿瘤的发生从根本上说肿瘤是个基因性疾病，从原癌基因激活为癌基因和抑癌基因的失活，通过一系列的信号传导途径，导致了正常细胞的分化、异常增生，最终形成肿瘤。Ebi皿maH等认为，c-mycmRNA的过度降低可以诱导肝癌细胞系的凋亡，同时可以引起Bcl-2的减少，提高细胞的死亡率(EbinumaH，SaitoH，KosugaM，etal.Reductionofc_mycexpressionbyanantisenseapproachunderCre/loxPswitchinginducesapoptosisinhumanlivercancercells.JCellPhysiol，2001，188(1):56-66)。AFP是肝癌特异性抗原，同时也是个潜在的肝细胞生长因子，通过对Bel-7402的研究，显示AFP能促进肝癌细胞增殖，其生长调节是由特异的膜受体介导的，并通过cAMP-PKA和细胞内钙离子通道的跨膜信号传导来调节癌基因的表达水平，且有剂量依赖性(LiMS，LiPF，HeSP，etal.Th印romotingmolecularmechanismofalpha—fetoproteinonthegrowthofh丽nh印atomaBel7402ce11line.WorldJGastroenterol,2002，8(3):469-475)。2)在诊断和预防研究中的应用目前与肝癌诊断的标志物比较多，如AFP、MAGE、BAGE等，但都缺乏很好的特异性和敏感性，利用人肝癌细胞系可以筛选一些有潜在价值的肝癌诊断标志物，有可能预防肝癌的发生和提高肝癌的早期诊断水平。0bora等对5株人肝癌细胞系进行了研究，结果显示在干扰素抑制肝癌细胞生长和凋亡上，无环视黄醛具有协同作用，两者结合有可能预防肝癌的发生(0boraA，ShiratoriY，0kunoM，etal.Synergisticinductionof即optosisbyacyclicretinoidandinterferon_betainhumanhepatocellularcarcinomacells.H印atology，2002，36(5):1115-1124)。WangZ等通过对肝癌动物模型和人肝癌细胞系H印G2，S匪C7721以及人胚胎肝细胞系L_02中胰岛素生长因子II(IGF-II)的检测表明，在癌前阶段，IGF-II可以通过旁分泌机制促进肝细胞的增殖，而肝细胞发生恶性转化后，IGF-II也转为自动分泌。因此，IGF-II有可能成为肝癌早期诊断的生物学标志物(WangZ，RuanYB，GuanY，etal.ExpressionofIGF-IIinearlyexperimentalh印atocellularcarcinomasanditssignificanceinearlydiagnosis.WorldJGastroenterol,2003，9(2):267-270)。3)用于肝癌治疗的研究人肝癌细胞系可以应用于药物作用机制的研究。FavouletP等对吡柔比星和阿霉素的细胞外毒性进行了比较，发现吡柔比星对H印G2和Hu-H7的毒性效果更好，认为吡柔比星能更好地应用于晚期肝癌病人的肝动脉化疗栓塞而不至于引起完全的肝动脉阻塞(FavouletP，CercueilJP，FaureP，etal.IncreasedcytotoxicityandstabilityofLipiodol—pirarubicinemulsioncomparedtoclassicaldoxorubicin—Lipiodol-potentialadvantageforchemoembolizationofunresectablehepatocellularcarcinoma.AnticancerDrugs，2001，12(10):801-806)。AbiruS等研究表明，阿司匹林和选择性环氧化物酶-2(C0X-2)抑制剂NS-398可以抑制肝细胞生长因子(HGF)诱导的H印G2细胞侵袭，其机制是通过细胞外信号调节激酶(ERK)1/2通路(AbiruS，NakaoK，IchikawaT，etal.AspirinandNS-398inhibith印atocytegrowthfactor—inducedinvasivenessofhumanhepatomacells.H印atology，2002，35(5):1117-1124)。4)用于肝炎病毒的研究将肝炎病毒整合到人肝癌细胞系中，通过检测一些指标，可以研究肝炎发病机制，为肝炎疫苗和药物治疗提供理论依据。Bouchard等将缺乏x蛋白的土拨鼠HBV整合转染到人肝癌细胞系H印G2中，然后用510倍的x蛋白加以剌激，HBVRNA复制有明显增加，而单纯用信号传导抑制剂，对HBVRNA复制仅有轻微作用，说明这些复制的信号通路是由x蛋白激活的(BouchardMJ，PuroRJ，WangL，etal.ActivationandinhibitionofcellularcalciumandtyrosinekinasesignalingpathwaysidentifytargetsoftheHBxproteininvolvedinhepatitisBvirusreplication.JVirol，2003,77(14):7713-7719)。这为抑制肝炎的复发和加剧提供了治疗方向。Alisi等研究表明，核心蛋白可以直接影响不同p73亚型的功能，在HCV的发病中起着重要作用(AlisiA，GiambartolomeiS，CupelliF，etal.PhysicalandfunctionalinteractionbetweenHCVcoreproteinandthedifferentp73isoforms.Oncogene,2003，22(17):2573-2580)。5)作为生物人工肝的肝细胞来源人肝癌细胞系有正常肝细胞某些功能，对生存条件要求不严，来源广泛，经过传代培养，数量能满足需要。C3A细胞是从H印G2演化而来，具有良好的分泌蛋白、参与尿素及糖原合成肝细胞特异性功能，且增殖能力强。目前美国H印atix公司生产的H印atix-ELAD体外人工肝辅助装置中使用的生物成分就是C3SA细胞株，已被批准进行II期临床试验(WoodRP，KatzSM，0zakiCF，etal.Extracorporealliverassistde-vice(ELAD):aprelimirmryr印ort.TransplantProc，1993，25(4Sup-pl3):53-54)。尽管人肝癌细胞系的应用存在着一些不足，但它是肝癌实验研究的基础。随着人类基因组的完成和分子生物技术的进步，可以针对肝癌的浸润、转移、复发等机制进行更深入的研究，同时加强肝癌抗体和药物的筛选，尽早制服肝癌。
发明内容本发明的目的是提供一种肝癌细胞系及其应用。本发明提供的肝癌细胞系为人肝癌细胞株H印-llCGMCCN2.3203。人肝癌细胞株H印-11CGMCCN2.3203可作为肝癌发生、肝癌发展或肝癌转移的细胞模型。人肝癌细胞株H印-11CGMCCN2.3203也可以用于建立肝癌动物模型。本发明还提供一种人肝癌细胞株H印-12CGMCC漁.3204。人肝癌细胞株H印-12CGMCC漁.3204可作为肝癌发生、肝癌发展或肝癌转移的细胞模型，也可以用于建立肝癌动物模型。人肝癌细胞株H印-11和人肝癌细胞株H印-12，均已于2009年07月22日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，人肝癌细胞株H印-ll的保藏号为CGMCCN2.3203，人肝癌细胞株H印-12的保藏号为CGMCCN2.3204。本发明还提供一种研究肝癌的细胞模型组。本发明所提供的研究肝癌的细胞模型组由人肝癌细胞株H印-12CGMCCN2.3204和6人肝癌细胞株H印-11CGMCCN2.3203组成。上述细胞模型组可用于研究肝癌发生机理和/或筛选治疗肝癌药物。实验证明，说明这两株细胞具有不同的生物学活性，H印-12CGMCC漁.3204细胞较H印-11CGMCCN2.3203细胞具有更恶性的致瘤特性。H印-12CGMCC漁3204细胞具有很好的致瘤特性，这两株细胞可以作为研究肝癌发生、发展以及转移的细胞模型。并且，H印-11CGMCCN23203和H印-12CGMCC漁.3204配合使用可以研究肝癌早期、晚期的发生机理，观察H印-11CGMCCN2.3203和H印-12CGMCC漁.3204分别建模的动物模型的蛋白表达差异，克隆相关基因，并用H印-11CGMCCN2.3203进行功能验证，等等，在分子水平上研究影响肝癌发生，发展，转移的机理，并将其作为靶标筛选抗癌药物。图1为H印-12细胞在显微镜下观察的细胞形态图。图2为H印-ll和H印-12接种免疫缺陷小鼠后10周取实验小鼠的肝脏照片。具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、人肝癌细胞株H印-11和人肝癌细胞株H印-12的获得及其致瘤效果验证发明人从一例肝癌患者早期发病和晚期发病的肿瘤取样，建立两个细胞系。1、肝癌患者资料男，46岁，术前检查AFP:2733(0-7.0)病毒感染情况:ALT:32u/L，HBsAg:阴，Anti-HBs:阴，HBeAg:阴，Anti-HBe:阳，Anti—HBc:阳，Anti—HCV:阴，Anti—HIV1/2:阴。2004年2月发现右肝肝癌，第一次肝癌切除手术右肝部分切除。肿瘤块病理检查诊断肝细胞癌，肿瘤大小7X5cm可见脉管癌栓切缘未见癌，慢性胆囊炎2004年9月发现左肝肝癌，第二次肝癌切除手术2004年9月，肝左外叶切除。肿瘤块病理检查诊断肝左外叶肝细胞性肝癌，II-III级，大小8X6cm，未见脉管癌栓，肝切缘未见癌。2.肿瘤细胞建系方法将上述患者第一次肝癌切除手术和第二次肝癌切除手术取样分别按照下述方法进行肿瘤细胞建系(1)取标本第一次肝癌切除手术和第二次肝癌切除手术时分别利用手术刀取新鲜肝癌组织大约2克，置无菌50ml离心管，置冰上，从手术室带到实验室；(2)选取组织用剪刀剪去周围的正常组织和坏死组织；(3)除菌先用含高浓度抗生素(青霉素500u/ml，链霉素500u/ml)的生理盐水冲洗标本2次，然后浸泡标本20分钟；(4)机械分离快速用剪刀剪碎组织，剪至绝大部分均可过200目钢网；7(5)梯度ficoll纯化肿瘤细胞用含2mMEDTA的HBSS洗两遍细胞，然后用含2mMEDTA的HBSS重悬，加到梯度Ficoll(天津灏洋产)上面(下面为100%的ficoll，中间为75%(体积百分含量)ficoll+25X(体积百分含量)RPMI1640培养液)。2400rpm离心20分钟。离心完毕后，吸取75%(体积百分含量)Ficoll和上清界面间的细胞，这部分细胞主要是肿瘤细胞，用RPMI1640培养液洗两次；(6)肿瘤细胞的培养接种密度大约为0.5IX106/ml左右，接种于24孔板，用含20%(体积百分含量)病人自体血浆的RPMI1640培养。每隔3-4天换液一次，待病人血浆用完后换成普通的胎牛血清；(7)肿瘤细胞的传代待细胞几乎长满24孔板以后，逐步传至12孔板，6孔板，T25培养瓶，T75培养瓶。传代时用含0.5mMEDTA的0.25X(质量百分含量)胰酶消化。冻存不同代数的细胞并做好代数纪录。冻存液为含有10%(体积百分含量)DMS0的90X(体积百分含量)FBS(fetalbovineserum，胎牛血清)。第一次手术切除的肿瘤培养的细胞株命名为人肝癌细胞株H印-11，第二次手术切除的肿瘤培养的细胞株命名为人肝癌细胞株H印-12。人肝癌细胞株H印-ll和人肝癌细胞株H印-12，均已于2009年07月22日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，人肝癌细胞株H印-ll的保藏号为CGMCCN2.3203，人肝癌细胞株H印-12的保藏号为CGMCC漁.3204。3、H印-11和H印-12细胞系的特征观察H印-ll和H印-12细胞在显微镜下观察细胞形态不同(见图1)。H印-ll细胞呈多角形贴壁生长，而H印-12细胞呈圆形、集落、半悬浮生长。4、H印-ll和H印-12致瘤特性验证将两株细胞H印-ll和H印-12通过胰酶消化，在含10%的RPMI1640培养液中培养)传代23代后得到的细胞株，分别种到免疫缺陷小鼠(SCID小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)的肝脏，在接种后每周观察小鼠，到接种后第6周发现接种H印-12的小鼠腹部有肿物出现，而接种人肝癌细胞株H印-ll的小鼠腹部未见肿物出现，生长正常。到接种后第10周接种H印-12的小鼠腹部肿物增大显著、并出现消瘦，同时处死两组实验动物，取动物肝脏。发现接种H印-ll的小鼠肝脏内未见肿瘤，而接种人肝癌细胞株H印-12的小鼠肝内出现巨大肿瘤，见图2。图2表明人肝癌细胞株H印-ll和人肝癌细胞株H印-12接种免疫缺陷小鼠后10周取实验小鼠的肝脏，接种H印-ll的小鼠肝脏未见肿瘤生长，而接种了H印-12的小鼠肝脏长出巨大肿瘤。肝细胞的生长增殖是与肝脏内的间质细胞提供的微环境分不开的，人肝癌细胞株H印-ll和人肝癌细胞株H印-12接种免疫缺陷小鼠的肝脏后表现出的差异，表明这两株细胞在肝脏内具有不同的生物学活性，H印-12细胞较H印-ll细胞具有更恶性的致瘤特性，反映了这两株细胞适合对肝癌的发生发展进行研究。这两株细胞可以作为研究肝癌发生、发展以及转移的细胞模型。人肝癌细胞株H印-ll和人肝癌细胞株H印-12配合使用可以研究肝癌早期、晚期的发生机理，观察H印-ll和H印-12分别建模的动物模型的蛋白表达差异，克隆相关基因，并用H印-ll进行功能验证，等等，在分子水平上研究影响肝癌发生，发展，转移的机理，并将其作为靶标筛选抗癌药物。权利要求一种人肝癌细胞株Hep-12CGMCC№.3204。2.权利要求1所述的人肝癌细胞株H印-12CGMCCN2.3204在作为肝癌发生、肝癌发展或肝癌转移的细胞模型中的应用。3.权利要求1所述的人肝癌细胞株H印-12CGMCCN2.3204在建立肝癌动物模型中的应用。4.一种研究肝癌的细胞模型组，由人肝癌细胞株H印-12CGMCCN2.3204和人肝癌细胞株H印-11CGMCC漁.3203组成。5.权利要求4所述的细胞模型组在研究肝癌发生机理和/或筛选治疗肝癌药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种肝癌细胞系及其应用。该肝癌细胞系为人肝癌细胞株Hep-12CGMCCNo.3204。人肝癌细胞株Hep-12CGMCCNo.3204和人肝癌细胞株Hep-11CGMCCNo.3203可组成一种用于研究肝癌机理的细胞模型组。该肝癌细胞系具有很好的致瘤特性，可作为肝癌发生、肝癌发展或肝癌转移的细胞模型。文档编号C12Q1/02GK101693886SQ200910180628公开日2010年4月14日申请日期2009年10月26日优先权日2009年8月10日发明者杜晓娟,柯杨,王觎,许小兰,邢宝才申请人:北京肿瘤医院;