专利名称：一种简单、经济、高效的猪卵母细胞体外成熟方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，特别涉及一种简单、经济、高效的猪卵母细胞体外成
熟新方法。
背景技术：
中国专利申请200810218336. X公开了《一种猪卵母细胞体外培养成熟方法》，包 括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞筛选步骤和成熟培养步骤，其特征 在于，在卵母细胞采集步骤之前，采集的卵巢存放于盛装有生理盐水的容器内保存，且容 器内温度保持在32 34°C ;卵母细胞筛选步骤采用的洗卵液中含有1 10包括采集卵 巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞筛选步骤和成熟培养步骤，其特征在于，在 卵母细胞采集步骤之前，采集的卵巢存放于盛装有生理盐水的容器内保存，且容器内温度 保持在32 34°C ;卵母细胞筛选步骤采用的洗卵液中含有1 10 i！ g/mL的两性霉素B， 2% 20% v/v的血清；卵母细胞成熟培养步骤采用的成熟培养液中含有50 90% v/v 的TCM-199[1幻基础液，5 25IU/mL的hCG(人绒毛膜促性腺激素)和5 20IU/mL的 PMSG(孕马血清促性腺激素)。 该专利申请存在以下不足。首先，卵母细胞采集之前，卵巢采集时将卵巢置于含 有32 34t:生理盐水的保温箱中2h内运回实验室，但生理盐水中没有添加青霉素G和硫 酸链霉素两种抗生素，容易使细菌污染卵母细胞。第二，卵母细胞采集时使用真空泵提供压 力源，依赖于机器负压抽吸卵巢上3 6mm的卵泡，但真空泵价格昂贵，成本高，并且携带也 不方便，不利于生产一线和野外作业。第三，洗卵液成分太多，成本高，不利于现场配制，且 成熟培养前没有用IVM液洗涤卵母细胞，容易将洗卵液参杂到IVM液滴中，导致成熟效果 差。第四，该专利申请与其他现有技术一样，卵母细胞成熟培养也是采用工业混合气体(5% 0)2+95%空气)，工业混合气体价格贵、搬运困难、不利于在生产一线或野外作业时大规模 生产使用。因为现有体外成熟猪卵母细胞的气体均需购买化工企业生产的混合气，比如 5% 0)2，95%空气或者5% C02，2% 8% 02，93% 87% N2的气相环境。这两种气相环境 都离不开商业化的瓶装C02或N2，且需要借助昂贵的专用C02培养箱调节才能实现，所以成 本高；此夕卜，装0)2或^的钢瓶体积大、质量重，不利于运输和挪动，并且工业混合气瓶中的 压力很大搬运过程存在一定的风险；工业混合气只能局限于实验室里使用，而不能在生产 一线或野外作业时大规模开展猪卵母细胞的体外成熟。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种简单、经济、高效的猪卵母细胞体外成 熟方法，解决目前猪卵母细胞体外成熟方法中所用工业混合气体成本高、搬运困难、不利于 在生产一线或野外作业时大规模生产的问题。 本发明的技术方案是，一种猪卵母细胞体外成熟方法，包括采集卵巢步骤，从卵巢 中采集卵母细胞步骤，卵母细胞的筛选步骤和体外成熟培养步骤，其特征在于，卵母细胞体外成熟培养的整个过程都是在人工呼出肺气环境中进行的，即采用人体肺气这种气相实现 体外成熟卵母细胞。 所述的猪卵母细胞体外成熟方法，其特征在于，所述的采集卵巢步骤包括以下步 骤，从屠宰场取猪卵巢，放入盛有青霉素G和硫酸链霉素28 35t:生理盐水的保温杯中，2h 内运回实验室。 所述的猪卵母细胞体外成熟方法，其特征在于，所述的从卵巢采集卵母细胞步骤 包括以下步骤，用无菌注射器抽吸卵巢上3 6mm的卵泡，将抽取液注入置于38。C恒温水浴 锅的离心管中，使卵丘卵母细胞合体自然沉降。 所述的猪卵母细胞体外成熟方法，其特征在于，所述的卵母细胞的筛选步骤包括 以下步骤，卵泡液沉降13-17min，弃上清液，然后将沉淀物用洗卵液稀释并吹打混匀，在体 视显微镜下挑出卵丘包裹2层以上，致密且胞质均匀的卵丘细胞卵母细胞复合体，经洗卵 液洗涤3遍，再用IVM培养液洗涤3遍。 所述的猪卵母细胞体外成熟方法，其特征在于，所述的肺气体外成熟卵母细胞步 骤包括以下步骤，将筛选的卵丘_卵母细胞复合体，平均40个卵丘-卵母细胞复合体一个 孔，移入四孔板中，将四孔板移入充气袋中，封口机封住袋口，试验人员进行呼吸气体交换， 用吹气针将肺部气体吹入充气袋中，把充气袋中空气排完，将充气袋吹满肺气并封口 ，将该 充气袋置于38。C的恒温箱培养，成熟培养42-44h。 与现有技术相比，本发明将采集的卵巢置于添加抗生素的保温杯中保存，携带方 便、保温效果好并且可以防止在抽吸卵泡液时细菌对卵母细胞的污染；筛选卵母细胞洗卵 液的成分简单、廉价、易于配制，并且能获得很好的洗涤效果；特别是本发明中卵母细胞体 外成熟培养的整个过程都是在人工呼出肺气环境中进行的，不仅无须工业混合气，经济安 全，操作简单，而且成熟效果和后期卵母细胞发育能力很高，经42-44h体外成熟培养后第 一极体排出率可达到70%，孤雌激活后囊胚发育率为39%。如果畜牧工作人员在生产一线 或野外作业时使用肺气成熟卵母细胞可以缓解当时没有C02培养箱的紧急情况；在经济欠 发达地区，对于从事生殖生物技术研究的教学单位，很难购买昂贵的C02培养箱，此时，肺气 能够以其经济、便捷的优势替代工业混合气。本发明是一种简单、经济、高效的新方法。
具体实施例方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合
实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本 发明，并不用于限定本发明。 实施例1 1.试剂及培养液准备 (1)洗卵液预热 将洗卵液置于3『C恒温箱预热，供卵母细胞挑选时使用。
(2)平衡卵母细胞体外成熟液(IVM液) 四孔板中每孔分别加入400 ii 1 IVM液，使其铺满底部，再于液体表面覆盖400 y 1 石蜡油(mineral oil)，置于5% C02， 95%空气的培养箱中，至少平衡4小时。 2.卵巢采集
从屠宰场取卵巢，放入盛有青霉素G和硫酸链霉素的28 35°C生理盐水的保温杯 中，2h内运回实验室。
3.卵母细胞收集抽吸卵泡时，用配有18号针头的10ml无菌注射器抽吸卵巢上3 6mm的卵 泡，将抽取液缓慢注入置于3『C恒温水浴锅的15ml尖底离心管中，使卵丘卵母细胞合体 (Cumulus-Oocyte complexes, COCs) 自然沉降。
4.卵母细胞筛选 卵泡液沉降15min左右可看到明显的界限，弃上清液，然后将沉淀用洗卵液 (DPBS-0. 01% PVA)稀释并吹打混匀，在体视显微镜下迅速挑出卵丘包裹2层以上，致密且 胞质均匀的卵丘细胞卵母细胞复合体，经DPBS-0. 01 % PVA洗涤3遍后，再用IVM培养液洗 涤3遍。 5.肺气体外成熟卵母细胞 将上述筛选出来的卵丘-卵母细胞复合体(C0Cs)，平均40个卵丘-卵母细胞复合 体(COCs) —个孔，移入四孔板中，接着将四孔板移入充气袋中，塑料薄膜封口机封住袋口， 试验人员深吸气并保持10 20s进行气体交换后利用配备过滤器的吹气针将肺部气体吹 入充气袋中，连续两次吹气再排气，把充气袋中空气排完，紧接着将袋子吹满肺气并封口 ， 最后袋子置于3『C的恒温箱培养，成熟培养42_44h后进行孤雌激活。
6.结果 经肺气体外成熟培养42-44小时后，第一极体排出率(成熟率)达到66% -70 %。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种猪卵母细胞体外成熟方法，包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞的筛选步骤和体外成熟培养步骤，其特征在于，卵母细胞体外成熟培养的整个过程都是在人工呼出肺气环境中进行的，即采用人体肺部气体实现体外成熟卵母细胞。
2. 如权利要求1所述的猪卵母细胞体外成熟方法，其特征在于，所述的采集卵巢步骤 包括以下步骤，从屠宰场取猪卵巢，放入盛有青霉素G和硫酸链霉素的28 35t:生理盐水 的保温瓶中，2h内运回实验室。
3. 如权利要求1所述的猪卵母细胞体外成熟方法，其特征在于，所述的从卵巢采集卵 母细胞步骤包括以下步骤，用无菌注射器抽吸卵巢上3 6mm的卵泡，将抽取液注入置于 3『C恒温水浴锅的离心杯中，使卵丘卵母细胞合体自然沉降。
4. 如权利要求1所述的猪卵母细胞体外成熟方法，其特征在于，所述的卵母细胞的筛 选步骤包括以下步骤，卵泡液沉降13-17min，弃上清液，然后将沉淀物用洗卵液稀释并吹打 混匀，在体视显微镜下挑出卵丘包裹2层以上，致密且胞质均匀的卵丘细胞卵母细胞复合 体，经洗卵液洗涤3遍，再用IVM培养液洗涤3遍。
5. 如权利要求1所述的猪卵母细胞体外成熟方法，其特征在于，所述的肺气体外成熟 卵母细胞步骤包括以下步骤，将筛选出来的卵丘_卵母细胞复合体，平均40个卵丘-卵母 细胞复合体一个孔，移入四孔板中，接着将四孔板移入充气袋中，封口机封住袋口，试验人 员深吸气并保持10 20s进行气体交换后，利用吹气针将肺部气体吹入充气袋中，连续两 次吹气再排气，把充气袋中空气排完，紧接着将袋子吹满肺气并封口 ，最后袋子置于38°C的 恒温箱培养，成熟培养42-44h后进行孤雌激活。
6. 如权利要求5所述的猪卵母细胞体外成熟方法，其特征在于，经肺气体外成熟猪卵 母细胞后第一极体排出率达到70%。
全文摘要
一种简单、经济、高效的猪卵母细胞体外成熟方法，包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞的筛选步骤和体外成熟培养步骤，其特征在于，卵母细胞体外成熟培养的整个过程都是在人工呼出肺气环境中进行的，具体是将筛选的卵丘-卵母细胞复合体，平均40个卵丘-卵母细胞复合体一个孔，移入四孔板中，将四孔板移入充气袋中，封口机封住袋口，试验人员进行呼吸气体交换，用吹气针将肺部气体吹入充气袋中，把充气袋中空气排完，将充气袋吹满肺气并封口，将该充气袋置于38℃的恒温箱培养，成熟培养42-44h。
文档编号C12N5/075GK101709290SQ20091018579
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者张运海, 曹祖兵, 李运生, 章孝荣, 随刘才 申请人:安徽农业大学