专利名称：一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法及其制品的制作方法
技术领域：
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体是涉及一种利用生物反应器生产伪狂犬
病活疫苗的方法及其制品。
背景技术：
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PRV)引起多种动物的一种急性传染病。该传染病遍 布世界主要养猪国家。免疫接种是防制伪狂犬病的主要策略。 当前伪狂犬病活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，该培养方式是 培养细胞贴壁生长于玻璃培养瓶的内壁上，虽然其操作技术要求较低和技术成熟稳定；但 转瓶培养技术已经使用数十年，与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要表现为(l)转 瓶细胞培养，不能做到培养条件适时调整，无法保证细胞培养处于最佳条件，培养细胞密度 小，培养病毒滴度低，动物的免疫效果差；(2)转瓶细胞培养，细胞碎片与杂蛋白多，疫苗的 杂质多，导致免疫动物的副反应大；(3)转瓶细胞培养，细胞批间差异较大，产品质量不均 一、不稳定；(4)转瓶细胞培养，生产效率低，生产成本高。
发明内容
为克服上述转瓶细胞培养技术缺陷，本发明的目的是提供一种利用生物反应器生 产伪狂犬病活疫苗的方法及其伪狂犬病活疫苗产品。 为实现上述目的，本发明首先提供了 一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的
方法，该方法包括如下步骤 (1)用细胞生长液培养制苗用细胞； (2)将所述步骤(1)得到的细胞接种含伪狂犬病病毒弱毒毒种的维持液，并进行 繁殖培养； (3)接毒后2 3日，收获所述步骤(2)得到的细胞培养毒液； (4)在所述步骤(3)得到的细胞培养毒液中加稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥
得到伪狂犬病活疫苗； 其中，上述方法中使用了含微载体的生物反应器进行培养。 优选的，所述步骤(1)包括如下步骤将所述生物反应器和微载体经消毒后接种 所述制苗用细胞，并加入细胞生长液进行培养。 优选的，所述步骤(2)包括如下步骤将所述生物反应器接种所述含伪狂犬病病 毒弱毒毒种的维持液，继续培养。 优选的，所述步骤(1)和(2)中的培养的温度为36°C 37°C。 优选的，所述步骤(l)中的细胞生长液含90X 92X体积百分比的MEM液、抗菌
素和8% 10%体积百分比的犊牛血清，所述细胞生长液的pH值为7. 0 7. 2。 优选的，所述步骤(2)中的接种时的接种量为1% 2%体积百分比的生产用细胞
毒种的维持液。
优选的，所述步骤(2)中的细胞维持液含95% 98%体积百分比的MEM液、抗菌
素和2% 5%体积百分比的犊牛血清，所述细胞维持液的pH值为7. 2 7. 4。 优选的，所述生物反应器为TideCell固定床微载体生物反应器。TideCell生物
反应器可达到简化至只需一般针筒以及无血清培养细胞方式，培养之载体细胞均匀分布成
长，其有效产能经实验证实， 一个TideCell生物反应器，产能约一般传统生物反应器的4倍。 优选的，所述制苗用细胞为猪睾丸细胞系ST、猪肾细胞系PK15或猪肾细胞系 I服S-2。 本发明的目的之二是提供一种伪狂犬病活疫苗制品，该伪狂犬病活疫苗制品通过 上述方法得到。 本发明利用生物反应器大规模高密度培养，可最大限度地提高生物反应器中单位 体积细胞生长密度，在病毒疫苗生产中具有很大潜力和优势，具体表现为(l)细胞密度大 大增加，病毒浓度极大提高；(2)疫苗效价提高，副反应减小；(3)降低劳动强度，减少生产 成本；(4)疫苗生产可监控性提高；(5)保证产品质量均一稳定。利用本发明生产的伪狂犬 病活疫苗安全性好、免疫效力高，对伪狂犬病强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
具体实施例方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。 利用生物反应器大规模细胞培养技术，生产伪狂犬病活疫苗的生产工艺技术与方 法，包括如下步骤 (1)选择生物反应器TideCell固定床微载体生物反应器。
(2)选择细胞系作为制苗用细胞本实施例中选择猪睾丸(ST)细胞系作制苗用细
胞。在另两个实施例中，分别选用猪肾(PK15)细胞系和猪肾(IBRS-2)细胞系。 (3)利用生物反应器培养制苗用细胞选择适宜的细胞系，生物反应器和微载体
经消毒后接种适宜的细胞浓度(10e 8X10e个细胞/ml)并加入适量的培养基，通过调整
细胞培养系统中各培养条件溶氧浓度为50% 100%丄02浓度调至为5%、葡萄糖含量为
500 3000mg/L， pH值为7. 0 7. 4，培养高密度的细胞系作为制苗用细胞。 (4)选择制苗用毒种伪狂犬病病毒Bartha-K61弱毒株。 (5)生物反应器繁殖制苗用毒液将生物反应器中生长良好的上述传代细胞微载 体培养罐中的细胞生长液弃去，接种含适量毒种的维持液，继续培养；接毒后2 3日收获 细胞培养毒液，收获的毒液置_15°C以下保存。 制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检 验，无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用细胞 测定效价，每lml含病毒^ 101QTCID5。。 (6)配苗、分装及冻干将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定 剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。
成品检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检验，符合"伪狂犬病活
4疫苗"的规定，对猪安全无副作用，每头份疫苗含病毒^ 106TCID5。。 其中，上述方法中涉及到的具体的条件如下 步骤(3) 、 (5)中所述的培养温度是36 37°C 。 步骤(5)中所述的接种量为含1% 2%生产用细胞毒种的维持液。 步骤(3)中所用生长液的配方是90% 92% MEM液、8X 10%犊牛血清、加适
量的抗菌素，pH值调整为7. 0 7. 2。 步骤(5)中所用维持液的配方是95X 98XMEM液、2X 5X犊牛血清、加适量 的抗菌素，pH值调整为7. 2 7. 4。 按上述方法制备得到的伪狂犬病活疫苗按《中华人民共和国兽药典》(2005年 版)进行检验，符合"伪狂犬病活疫苗"的规定，对猪安全无副作用，每头份疫苗含病毒 > 106TCID50。 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
权利要求
一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)用细胞生长液培养制苗用细胞；(2)将所述步骤(1)得到的细胞接种含伪狂犬病病毒弱毒毒种的维持液，并进行繁殖培养；(3)接毒后2～3日，收获所述步骤(2)得到的细胞培养毒液；(4)在所述步骤(3)得到的细胞培养毒液中加稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到伪狂犬病活疫苗；其中，上述方法中使用了含微载体的生物反应器进行培养。
2. 根据权利要求1所述的一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤(1)包括如下步骤将所述生物反应器和微载体经消毒后接种所述制苗用细 胞，并加入细胞生长液进行培养。
3. 根据权利要求1所述的一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤(2)包括如下步骤将所述生物反应器接种所述含伪狂犬病病毒弱毒毒种的 维持液，继续培养。
4. 根据权利要求1所述的一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤(1)和(2)中的培养的温度为36t: 37t:。
5. 根据权利要求1所述的一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤(1)中的细胞生长液含90X 92X体积百分比的MEM液、抗菌素和8X 10X 体积百分比的犊牛血清，所述细胞生长液的PH值为7. 0 7. 2。
6. 根据权利要求1所述的一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤(2)中的接种时的接种量为1% 2%体积百分比的生产用细胞毒种的维持 液。
7. 根据权利要求1所述的一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤(2)中的细胞维持液含95X 98X体积百分比的MEM液、抗菌素和2X 5X 体积百分比的犊牛血清，所述细胞维持液的PH值为7. 2 7. 4。
8. 根据权利要求1 7之一所述的一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法， 其特征在于，所述生物反应器为TideCell固定床微载体生物反应器。
9. 根据权利要求1 7之一所述的一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法， 其特征在于，所述制苗用细胞为猪睾丸细胞系ST、猪肾细胞系PK15或猪肾细胞系IBRS-2。
10. —种伪狂犬病活疫苗，其特征在于，所述伪狂犬病活疫苗通过权利要求1 7之一 所述的方法得到。
全文摘要
本发明提供了一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法及其伪狂犬病活疫苗产品。将生物反应器和微载体经消毒后接种所述制苗用细胞，并加入细胞生长液进行培养。将所述生物反应器接种所述含伪狂犬病病毒弱毒毒种的维持液，继续培养。接毒后2～3日收获细胞培养毒液，并加稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到伪狂犬病活疫苗。本发明使细胞密度大大增加，病毒浓度极大提高；疫苗效价提高，副反应减小；降低劳动强度，减少生产成本；疫苗生产可监控性提高；保证产品质量均一稳定。利用本发明生产的伪狂犬病活疫苗安全性好、免疫效力高，对伪狂犬病强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
文档编号C12N7/00GK101695572SQ20091019331
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者任向阳, 刘法连, 刘秋燕, 吴文福, 岑小清, 廖润科, 张毓金, 林旭野, 游启有, 陈文胜 申请人:广东永顺生物制药有限公司;