专利名称：一种检测转bar基因甘蔗的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测转抗除草剂基因甘蔗的方法，特别涉及一种检测转bar基因 甘蔗的方法和应用。
背景技术：
随着分子生物学的发展，转基因技术在作物育种上的应用也越来越广泛。目前，
转基因作物的面积逐年增加，含有抗除草剂转基因作物在目前种植的转基因作物中占比例
最大。杂草每年给甘蔗生产带来巨大损失，研制抗除草剂转基因甘蔗有极大的经济价值。
bar基因是现在应用比较广泛的抗除草剂基因，导入该基因能够提高甘蔗对除草剂BASTA
的耐性，从而生产上通过喷洒除草剂能够有效的杀灭杂草而对抗除草剂转基因甘蔗没有危
害。同时bar基因常常作为植物转基因研究中的抗性标记基因，在植物转基因研究中广泛
应用。快速鉴定出bar基因在甘蔗生产和甘蔗转基因研究中都有重要的作用。 目前较为常规的bar基因检测方法包括PCR， SOUTHERN BLOT， NORTHERN BLOT和
涂抹法等。这些方法都需要一定的实验条件，程序复杂、操作繁琐、成本高。特别是前两种
方法还不能确定外源基因的表达量。涂抹法容易受到外界影响，而且不一致，给实验带来误
差，导致结果不准确。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测转bar基 因甘蔗的方法。 本发明的另一 目的在于提供上述检测转bar基因甘蔗方法的应用。 本发明的目的通过下述技术方案实现一种检测转bar基因甘蔗的方法，包括以
下步骤 (1)选取生长部位一致的野生型甘蔗叶片，剪成长度为2 5cm的小段，分别浸没 于5ml的不同浓度梯度的膦丝菌素溶液中，然后置于人工气候箱中进行培养3 5天观察 结果，确定能够伤害野生型甘蔗叶片的膦丝菌素溶液的最低浓度，导致野生型甘蔗叶片刚 刚全部变黄的膦丝菌素溶液的浓度为最低浓度； (2)取待检测的甘蔗叶片，剪成长度为2 5cm的小段，同时取与待测甘蔗叶片老 嫩程度相同的野生型甘蔗叶片作为对照，同样剪成2 5cm小段，分别置于5ml能够伤害野 生型甘蔗叶片的膦丝菌素溶液的最低浓度中，在人工气候箱中以与步骤(1)相同的培养条 件培养3 5天；然后通过和作为对照的野生型甘蔗叶片比较，叶片保持绿色的即为抗除草 剂转基因甘蔗，同时通过观察叶片的伤害程度还能初步判断bar基因在转基因甘蔗中的表 达量的大小，叶片越绿说明bar基因的表达量越大，否则，表达量较低。
所述人工气候箱的设置为适合甘蔗生长的条件； 所述人工气候箱的设置优选为温度为25t:，光照为2000LX，光照时间为14h，非光 照时间为10h ;
所述的浓度梯度优选为0 、 50 、 100 、 150 、 200 、 250和300ppm (质量体积比)；其中溶 质为膦丝菌素，溶剂为去离子水。 所述方法应用于含有bar基因的甘蔗的鉴定。 所述方法特别适合应用于甘蔗转bar基因后的甘蔗植株的筛选。 本发明的原理是除草剂BASTA是一种以谷氨酰胺合成酶(GS)为靶标酶的有机
磷类非传导性灭生除草剂，其主要成分膦丝菌素(PPT，glufosinateammonium)，能通过抑制
GS的酶活性，引起植物体内氨的迅速积累，发生氨中毒，导致植物死亡。bar基因编码的产
物草丁膦乙酰辅酶A转移酶(PAT)通过对PPT的自由氨基乙酰化，从而使PPT失去了抑制
GS活性的能力，使得转基因植物都获得了对除草剂PPT的抗性。 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明能简便快速地完成转基因 甘蔗的鉴定。目前该方法在甘蔗转基因研究上还没有相关的报道。本方法和目前采用的分 子检测方法相比较该方法，需要的仪器少，操作简单。比起涂抹法，本方法不受外界环境的 影响，处理更均一，效果更为准确。本方法只需取长度为2 5cm左右的叶片即可，能应用 于大批量活体转基因甘蔗的鉴定，为转基因甘蔗活体检测提供新方法。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例l 所用试验材料为甘蔗品种新台糖20号和以其为受体的转bar基因株系，依序包括 如下试验步骤 1、野生型甘蔗叶片敏感试验 (1)配制不同浓度的PPT溶液，浓度分别为用去离子水配制不同浓度梯度的PPT 溶液，浓度分别为0、50、100、150、200、250和300卯m(质量体积比，100卯m为lg PPT溶解 于IOL去离子水中，其他同理)； (2)取7支干净的10ml玻璃试管，分别向每支试管添加5ml PPT溶液，得到含有不 同PPT浓度的7支试管； (3)选取生长部位一致的野生型甘蔗叶片，剪成5cm左右的小段，分别放入7支含 有不同PPT浓度的玻璃试管中； (4)将试管放到人工气候箱中，培养条件温度25 °C ，光照2000LX，光照时间 (14h/10h); (5) 5天后观察结果，在PPT溶液中甘蔗叶片都会受到伤害，导致叶片为黄色，随着 浓度的增加，黄色的面积和颜色逐渐加深。通过选择刚刚导致甘蔗叶片全部发黄的浓度为 最适合的浓度。本实施例中的适合浓度为200卯m;
2、抗除草剂转基因甘蔗的检测 (1)按照敏感试验的结果，配制浓度为200卯m的PPT溶液；
(2)取10ml的干净的玻璃试管，每支添加5ml PPT溶液； (3)取以新台糖20号为受体的转bar基因甘蔗植株的叶片，同时取与待测甘蔗叶 片老嫩程度相同的未转基因的叶片作为对照，剪成5cm左右的小段，放入含有PPT溶液的干 净的玻璃试管中；
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(4)将试管放到人工气候箱中，培养条件温度25 °C ，光照2000LX，光照时间 (14h/10h); (5)5天后观察结果，通过和对照比较，以新台糖20号为受体的转bar基因甘蔗植 株的叶片保持绿色，未转基因的叶片变黄。 本实施例通过对PPT检测出为阳性的抗除草剂转基因甘蔗进行PCR验证，结果一 致。阳性植株均能扩出相应的特异条带，而未转基因的则没有。从而说明本方法完全可靠。
实施例2 所用试验材料为甘蔗品种新台糖20号和以其为受体的转bar基因株系，依序包括 如下试验步骤 1、野生型甘蔗叶片敏感试验 (1)配制不同浓度的PPT溶液，浓度分别为用去离子水配制不同浓度梯度的PPT 溶液，浓度分别为:0、50、100、150、200、250和300ppm(质量体积比); (2)取7支干净的10ml玻璃试管，分别向每支试管添加5ml PPT溶液，得到含有不 同PPT浓度的7支试管； (3)选取生长部位一致的野生型甘蔗叶片，剪成2cm左右的小段，分别放入7支含 有不同PPT浓度的玻璃试管中； (4)将试管放到人工气候箱中，培养条件温度25 °C ，光照2000LX，光照时间 (14h/10h); (5) 3天后观察结果，在PPT溶液中甘蔗叶片都会受到伤害，导致叶片为黄色，随着 浓度的增加，黄色的面积和颜色逐渐加深。通过选择刚刚导致甘蔗叶片全部发黄的浓度为 最适合的浓度。本实施例中的适合浓度为200卯m;
2、抗除草剂转基因甘蔗的检测 (1)按照敏感试验的结果，配制浓度为200ppm的PPT溶液；
(2)取10ml的干净的玻璃试管，每支添加5ml PPT溶液； (3)取以新台糖20号为受体的转bar基因甘蔗植株的叶片，同时取与待测甘蔗叶 片老嫩程度相同的未转基因的叶片作为对照，剪成2cm左右的小段，放入含有PPT溶液的干 净的玻璃试管中； (4)将试管放到人工气候箱中，培养条件温度25 °C ，光照2000LX，光照时间 (14h/10h); (5)3天后观察结果，通过和对照比较，以新台糖20号为受体的转bar基因甘蔗植 株的叶片保持绿色，未转基因的叶片变黄。 本实施例通过对PPT检测出为阳性的抗除草剂转基因甘蔗进行PCR验证，结果一 致。阳性植株均能扩出相应的特异条带，而未转基因的则没有。从而说明本方法完全可靠。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种检测转bar基因甘蔗的方法，其特征在于包括以下步骤(1)选取生长部位一致的野生型甘蔗叶片，剪成长度为2～5cm的小段，分别浸没于5ml的不同浓度梯度的膦丝菌素溶液中，然后置于人工气候箱中进行培养3～5天观察结果，确定能够伤害野生型甘蔗叶片的膦丝菌素溶液的最低浓度，导致野生型甘蔗叶片刚刚全部变黄的膦丝菌素溶液的浓度为最低浓度；(2)取待检测的甘蔗叶片，剪成长度为2～5cm的小段，同时取与待测甘蔗叶片老嫩程度相同的野生型甘蔗叶片作为对照，同样剪成2～5cm小段，分别置于5ml能够伤害野生型甘蔗叶片的膦丝菌素溶液的最低浓度中，在人工气候箱中以与步骤(1)相同的培养条件培养3～5天；然后通过和作为对照的野生型甘蔗叶片比较，叶片保持绿色的即为抗除草剂转基因甘蔗，同时通过观察叶片的伤害程度还能初步判断bar基因在转基因甘蔗中的表达量的大小。
2. 根据权利要求1所述检测转bar基因甘蔗的方法，其特征在于所述人工气候箱的 设置为温度为25t:，光照为2000LX，光照时间为14h，非光照时间为10h。
3. 根据权利要求1所述检测转bar基因甘蔗的方法，其特征在于所述的浓度梯度为 0、50、100、150、200、250和300卯m ;其中溶质为以质量膦丝菌素，溶剂为以体积计的去离子 水。
4. 权利要求1 3任一项所述方法应用于含有bar基因的甘蔗的鉴定。
5. 权利要求1 3任一项所述方法应用于对甘蔗转bar基因后的甘蔗植株的筛选。
全文摘要
本发明公开了一种检测转bar基因甘蔗的方法和应用。本发明通过将待检测的甘蔗叶片直接浸泡在除草剂溶液中进行处理，同时以不含有bar基因的甘蔗叶片作为对照，通过直接观察伤害程度就能判断结果。该方法应用于含有bar基因的甘蔗植株的鉴定，特别适合转基因再生植株的快速检测，能够大大降低转基因植株分子检测工作，大幅度提高检测效率，降低检测成本。
文档编号C12Q1/68GK101698883SQ200910193440
公开日2010年4月28日 申请日期2009年10月29日 优先权日2009年10月29日
发明者张剑亮, 曹干, 王继华 申请人:广东省农业科学院作物研究所