专利名称：用于前列腺癌转移早期诊断的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于前列腺癌转移的诊断试剂盒，特别是用于前列腺癌转移早期诊断 的试剂盒。
背景技术：
前列腺癌在西方许多国家是男性最常见的恶性肿瘤。在美国，前列腺癌更是占男 性癌症死亡原因的第二位。近年来，我国的前列腺癌发病率有明显增加，前列腺癌已成为泌 尿外科领域一个越来越重要的课题。前列腺癌的治疗方案的选择主要根据患者年龄、一般 状况、肿瘤分期及分级具体而定，也就是说在确定治疗方案之前必须首先明确患者及肿瘤 的具体情况。肿瘤具体情况的明确依靠于正确的诊断。目前前列腺癌的诊断主要有以下几 种方法(1)直肠指诊在体格检查中，直肠指诊是发现、诊断前列腺癌的最有帮助的第一 线检查，但是直肠指诊是一种非特异性的检查，发现前列腺癌时常常病理分级已达恶性程 度较高的级别，也即到了前列腺癌的晚期。(2)前列腺特异性抗原测定前列腺特异性抗原是一种蛋白酶，通常只在前列腺 液和精液测得，如果在血液中测得前列腺特异性抗原存在，往往可作为患者发生良性或恶 性前列腺病变的标志。前列腺特异性抗原作为单一检查，目前具有较好的前列腺癌阳性诊 断预测率，同样，它也帮助提高了许多小病灶、低分级前列腺癌的发现率与诊断率。但是，有 近30%前列腺癌患者的血清前列腺特异性抗原可能不升高，只在正常范围内(即前列腺特 异性抗原< 4. Ong/ml)波动。即使直肠指诊呈阴性、血清前列腺特异性抗原< 4. Ong/ml的 患者，仍有30%的前列腺穿刺发现前列腺癌的可能性。(3)经直肠超声检查与前列腺穿刺活检经直肠超声检查是诊断前列腺癌的一种 非常有价值的手段，它可帮助医师检查患者的前列腺以及周围组织结构寻找可疑病灶，并 能初步判断肿瘤的体积大小。此外。它还能帮助引导医师进行前列腺可触及或不可触及 的病变的穿刺活检。而即便在超声引导下，系统的前列腺六点穿刺的假阳性率仍可高达 23% 42%。经直肠超声检查在前列腺癌诊断特异性方面也较低，发现一个前列腺低回声 病灶要与多种疾病相鉴别。(4)其它影像学检查(a)计算机断层扫描(CT)检查由于CT检查不能显示正常 前列腺的三个带(外周带、中央带和移行带)，加之多数肿瘤组织的密度与正常腺体近似或 相同，因此CT不能用来诊断早期前列腺癌及前列腺癌的早期转移；(b)磁共振扫描(MRI) 磁共振有很好的软组织分辨率，能直接多方向平面(三维)成像，因此，MRI对前列腺的检 查优于其它影像学方法。但经腹部MRI仅可发现60%的前列腺癌，只可对57%的前列腺癌 患者进行准确的临床分期，同时对前列腺癌的早期转移的诊断阳性率仍然较低。综上所述，目前对前列腺癌的诊断，尤其是前列腺癌早期转移的诊断，仍然没有比 较有效的方法。目前所使用的帮助进行前列腺癌临床分期的方法，都存在着不能鉴别该肿 瘤究竟是早期的器官局限肿瘤还是已经发生微转移的局部晚期癌的不足。而这种鉴别诊断对于患者的预后非常重要，因为如已发展为局部晚期癌，手术治愈的可能性就微乎其微了。 据《吴阶平泌尿外科学》上卷第五十章《前列腺肿瘤》指出在术前诊断为器官局限性肿瘤 的患者中有将近50%术后病理证实为局部晚期癌。如能术前明确前列腺癌患者所患为器官 局限肿瘤或是局部晚期癌，从而选择合适的治疗方案，将极大裨益于治疗效果的提高及患 者生活质量的改善。因此有必要提供一种新的前列腺癌的诊断方法，尤其是前列腺癌早期转移的诊断 方法来克服现有技术中存在的缺陷。
发明内容
为了克服现有检查手段不能早期诊断前列腺癌转移的不足，本发明的目的之一在 于提供一种前列腺癌转移早期诊断的方法，该方法利用分子生物学原理，能够明确诊断出 前列腺癌的转移，更重要的是对前列腺癌的微小转移也能早期明确诊断。本发明的另一目的在于提供一种用于前列腺癌转移早期诊断的试剂盒，该试剂盒 可以明确诊断出前列腺癌的微小转移，准确率非常高。为实现上述目的，本发明一方面提供一种前列腺癌转移早期诊断的方法，该方法 包括(a)提取前列腺癌组织的基因组DNA ； (b)分别利用SEQ IDNO :1、SEQ ID NO 2所示 的M引物对和SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4所示的U引物对，使用甲基化特异性聚合酶链式 反应(Methylation specific PCR, MSP)进行PCR扩增；(c)对上述PCR扩增的产物进行电 泳；(d)根据特异性条带的有无来判断是否发生转移。在本发明的另一个实施方式中，在步骤(b)之前还使用SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示的外引物对来扩增所述基因组DNA，随后再进行步骤(b)，即采用巢式PCR对基因 组DNA进行扩增，以增加本发明方法的灵敏度，使结果更加稳定可靠。另一方面，本发明提供一种用于前列腺癌转移早期诊断的试剂盒，其包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2所示的M引物对；禾口 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4所示的U引物对。在 优选的实施方式中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO :5和SEQID NO :6所示的外引物对。在实 际应用中，本发明的试剂盒还包含PCR反应液、基因组DNA提取试剂中的一种或多种，以方 便操作。所述PCR反应液具有广泛的涵义，通常包含PCR反应体系中除引物对以外的其他 组分，例如dNTP、PCR缓冲液、聚合酶等；所述基因组DNA提取试剂具有广泛的含义，通常包 含提取基因组DNA所需的各种试剂，例如苯酚、氯仿、异丙醇等。本发明通过甲基化特异性聚合酶链式反应来检测前列腺癌组织中脑衰蛋白反应 调节蛋白-4(Collapsin response mediator protein_4，CRMP4)基因启动子区的甲基化状 况来判定有无前列腺癌的转移。该方法利用分子生物学原理，具有很高的特异性和准确率， 可以在早期明确诊断出前列腺癌的微小转移。
图1是显示经本发明的方法对各样本处理后的PCR产物的电泳结果图。
具体实施例方式以下将结合实验和附图对本发明作详细描述。
发明原理脱氧核糖核酸(DNA)甲基化是指DNA分子上CpG双核苷酸中的胞嘧啶(C)处于甲 基化状态，即一个甲基团以共价键的形式结合到CpG双核苷酸上胞嘧啶的5-碳原子上，形 成5-甲基胞嘧啶。在基因组转录区，CpG相互聚集，称之为CpG岛(CpG islands) 0 CpG岛 一般长0. 5 2. 01Λ，常位于5’端基因启动子区。在正常细胞中，大多数管家基因的5’CpG 岛处于非甲基化状态；而在肿瘤细胞中，许多基因的CpG岛则表现为异常的高甲基化。DNA 甲基化并不改变核苷酸的序列，而是通过改变染色体结构和组蛋白乙酰化作用的水平等， 从而间接导致基因转录抑制，也就是使其表达下调。CRMP4基因作为CRMP家族的一个成员，是参与神经元分化和突触重组调控的重要 分子。但研究发现，CRMP4在前列腺癌中是抑制前列腺癌转移的抑癌基因，其在转移性前列 腺癌中的表达较良性前列腺增生及局限性前列腺癌明显下调，表达下调的原因之一是因为 CRMP4启动子区存在着明显的高甲基化状态。因而，检测CRMP4启动子区的甲基化状态的高 低就可以明确前列腺癌有无转移，即CRMP4启动子区高甲基化提示前列腺癌有转移，CRMP4 启动子区低或无甲基化提示前列腺癌没有转移。影响CRMP4基因表达的CpG位点，关键的 有以下 10 个:-848, -841、-690、-680、-678、-674、-671、-665、-660、-658。因此，检测这 10个位点甲基化的程度即可判断前列腺癌是否发生转移，检测方法即为MSP法。MSP的原理双链DNA变性解链后，在亚硫酸氢盐(HS03_)作用下发生胞嘧啶(C)— 尿嘧啶(U)转化，C若已有甲基化则无此改变。但是，甲基化修饰只发生于5' -3'方向 C-G(胞嘧啶-鸟嘌呤)相联结构的C上。因此，在HS03_作用后，DNA CpG位点若无甲基化， 则序列中的改变为C — U，CG — UG ；若有甲基化则为C — C，CG — CG。因而用不同的引物 做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。根据目的基因修饰前后的 改变，相应设计M(甲基化)和U(非甲基化)引物，如果M引物可以扩增，则判定存在甲基 化；如果U引物可以扩增，则判定为非甲基化；如果M和U引物同时得到扩增，则判定这些 CpG位点同时存在甲基化和非甲基化两种状态。将扩增的产物进行电泳，即可判断相应引物(M引物和U引物)是否扩增得到特异 性片段，根据片段的有无来判断对应基因是否存在甲基化。存在甲基化者，可以判定前列腺 癌已发生转移。实施例一、引物在本发明的实施例中，根据上述原理设计出的引物如下M 引物对(SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2)正义引物TTTTTGTAGTTTTTGAGAGCGAGTTAC；反义引物CTCTACCATAACGCGAATCGAATACGACG；扩增得到的片断为222bp。U 引物对(SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4)正义引物GTTTTTTGTAGTTTTTGAGAGTGAGTTAT；
反义引物CTCTCCTCTACCATAACACAAATCAAATACAACA ；扩增得到的片断为226bp。外引物对(SEQID NO 5 和 SEQ ID NO 6)
正义引物TGATTTTGAGATTTAGTTAGGTAGTG；反义引物TTTCCTCTTTACATCTACCTCAC；扩增得到的片断为612bp。二、方法步骤1.基因组DNA的提取在本发明中，基因组DNA的提取使用酚氯仿法，当然本领域的技术人员可以预期 到，也可以使用本领域已知的其他方法来提取基因组DNA。另外，该实施例中所使用的试剂 和试剂的量仅是示例性的，本领域技术人员可根据实际情况作相应调整。如不特别指出，所 用双蒸水(DDW)、EP管均经高压蒸汽灭菌。1)取新鲜或冰冻前列腺癌组织块0. Ig,尽量剪碎后置于玻璃勻浆器中，加入 Iml的细胞裂解缓冲液勻浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K(500 μ g/ ml) 20 μ 1，混勻。在65°C恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37°C水浴12 Mh，间歇振荡 离心管数次。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中；2)加2倍体积异丙醇，倒转混勻后，可以看见丝状物，用100μ 1吸头挑出，晾干，用 200 μ 1 TE重新溶解；3)加等量的酚、氯仿、异戊醇振荡混勻，离心12000rpm，5min ；4)取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿异戊醇，振荡混勻，离心12000rpm， 5min ；5)取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7. 5mol/L乙酸氨，再加入2倍体积的无 水乙醇，混勻后室温沉淀2min，离心12000rpm，IOmin ；6)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残液除掉；7)用Iml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm，5min ；8)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温 干燥；9)加200 μ 1 TE重新溶解沉淀物，然后置于_20°C保存备用。2.亚硫酸氢钠修饰基因组DNA1)将约2 μ g DNA于1. 5ml EP管中使用DDW稀释至50ul ；2)力口 5. 5 μ 1 新鲜配制的 3Μ NaOH ；3)42°〇水浴30111土11;4)力卩30 μ 1 IOmM对苯二酚(氢醌)至上述水浴后混合液中(溶液变成淡黄色)；5)加520 μ 1 3. 6Μ亚硫酸氢钠(配制方法例如1. 88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释， 并以3M NaOH滴定溶液至pH5. 0 (要准确)，最终体积为5ml ；大浓度的亚硫酸氢钠很难溶， 但加入NaOH后会慢慢溶解)至上述水浴后溶液中；6) EP管外裹以铝箔纸(避光)，轻柔颠倒混勻溶液；7)加200 μ 1石蜡油(防止水分蒸发，限制氧化)，并在50°C避光水浴16h。3.修饰后DNA的纯化回收根据本发明，可使用本领域已知的任何合适的方法来纯化回收修饰后的DNA，例 如可使用市售的合适的回收试剂盒来完成该步骤。以下是使用市售的!Iomega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统(!Iomega，A7280)进行修饰后DNA纯化回收的一个例子，具体步骤如下。1)将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸 取混合液至一洁净1. 5mlEP管中；2)以下使用！Iomega A7280 DNA纯化回收系统a)70°C水浴预热DDW ；配制80%异丙醇；b)加Iml Promega Wizard DNA Clean-up树脂，轻柔颠倒混勻，使DNA充分与树脂结合；c)将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移 至针筒内，用anl以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时 可见小柱内有白色的树脂沉积；d)将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入aiil 80%的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出；e)将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1. 5ml洁净EP管上，离心12000rpm， 2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥(此时，修饰后DNA处于与树脂结合的状态)；f)将小柱取下置于另一洁净1. 5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放 置5min ；离心12000rpm，20s(此为洗脱步骤)，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶 液，终体积为50ul ；3)力口 5. 5 μ 1新鲜配制的3Μ NaOH，室温放置15min ；4)力卩33 μ 1 IOM乙酸铵，以中和NaOH，使溶液pH于7. 0左右。5)力卩4 μ 1 10mg/ml糖原(作为沉淀指示剂)；6)加270 μ 1冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀；7) 40C，12000rpm离心，30min,倒去上清液，收集沉淀(不必吸净)；8)加500 μ 1 70%乙醇(不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可)，轻柔倾斜 EP管，旋转一圈，再次离心，4°C 12000rpm，5min;离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再 做一遍(此为洗涤步骤，共2次)；9)倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液 体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20-30 μ 1 DDW，溶解沉 淀；_20°C保存DNA溶液。4.对修饰后DNA进行MSP本领域技术人员可意识到，可使用合适的手段(例如试剂盒)进行MSP，以下以 TaKaRa Taq (编号DR001A)试剂盒为例进行说明。在本发明的方法中，可采用两种PCR方 法进行MSP，分别为⑴直接PCR法或⑵巢式PCR法。(1)直接 PCR 法按下表1所示建立反应体系，并按下表2所示的条件进行PCR扩增表1反应体系
权利要求
1.用于前列腺癌转移早期诊断的两对引物对，其特征在于，第一引物对具有SEQID NO =USEQ ID NO :2所示的序列，第二引物对具有SEQ ID NO 3, SEQID NO :4所示的序列。
2.一种用于前列腺癌转移早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含SEQ ID NO =USEQ ID NO 2 的第一引物对和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 的第二引物对。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含SEQIDNO :5、SEQ ID NO 6的外引物对。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR反应液。
5.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含基因组DNA提取试剂。
全文摘要
本发明提供用于前列腺癌转移早期诊断的两对引物对第一引物对具有SEQ ID No1、SEQ ID No2所示的序列，第二引物对具有SEQ ID No3、SEQ ID No4所示的序列。本发明还提供一种用于前列腺癌转移早期诊断的试剂盒，包含上述的两对引物对。该试剂盒还可包含具有SEQ ID No5、SEQ ID No6所示的序列的引物对，用于巢式PCR扩增。本发明通过甲基化特异性聚合酶链式反应来检测前列腺癌组织中脑衰蛋白反应调节蛋白-4基因启动子区的甲基化状况来判定有无前列腺癌的转移。该方法利用分子生物学原理，具有很高的特异性和准确率，可以在早期明确诊断出前列腺癌的微小转移。
文档编号C12N15/11GK102051408SQ20091019365
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月4日 优先权日2009年11月4日
发明者刘伟鹏, 庞俊, 高新 申请人:高新