专利名称：：虫草素提取物和在制备降血糖药物或保健食品中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物制药
技术领域：
，具体涉及具有药用价值的真菌提取物，尤其涉及一种虫草素提取物和在制备降血糖药物或保健食品中的应用。
背景技术：
：虫草素(3'-脱氧腺苷)是从蛹虫草中提纯出的一种晶体，是一种新型的核苷类抗菌素，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，已引起全球科技发达国家的高度重视。它对枯草杆菌和念珠菌菌株均有抑制作用；对HIV-I得逆转录酶也有抑制作用；尤其对多种恶性肿瘤有很强的抑制作用。因此，将虫草素作为一种用途广泛的新药来开发是必然的趋势。虫草素主要有化学合成制得和蛹虫草中提取纯化两种来源，常见的是从蛹虫草固体培养子座或蛹虫草液体培养菌丝体和培养液中提取纯化而得。常见的虫草素提取纯化方法有离子树脂吸附法、活性炭吸附法和超临界萃取技术，然而这些方法的提取纯化效果并不太理想，如离子树脂吸附法分离纯化的虫草素较少，提取率较低，活性炭吸附法吸附选择性差，得率低，超临界萃取提取方法所需设备复杂，需要的成本也比较高。目前虽然有研究表明蛹虫草具有降血糖降血脂的作用，但该作用并不是虫草素赋予的，目前尚未见有虫草素具有降血糖作用的相关报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种提取方法简单、成本低、提取纯化效果好，且具有降血糖作用的虫草素提取物。本发明的另一个目的在于提供上述虫草素提取物在制备降血糖药物或保健食品中的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的—种虫草素提取物，该提取物是采用大孔树脂D-101从蛹虫草液体培养液中提取纯化而得，该提取物经检测，其中主要包含虫草素、蛋白质和糖，且虫草素的含量能够达到提取物总质量的60%以上。上述虫草素提取物，是先将蛹虫草液体培养液进行预处理后获得的上柱液上样大孔树脂D-101，调节上柱液的pH为9.0，以40mL/h的流速进样，当进样量达到568mL时，树脂达到完全饱和。此时，饱和动态吸附量为O.183mg/g，然后采用体积百分比浓度为55X的乙醇作为洗脱剂，进行洗脱，收集洗脱液，浓縮冷冻干燥后得到所需虫草素提取物，该虫草素提取物经高效液相色谱法测定含虫草素61.55%，经考马斯亮兰法测定含蛋白质11.15%，经苯酚硫酸法测定含总糖8.51%。上述蛹虫草液体培养液进行预处理，其操作是先将蛹虫草液体培养液进行适量的浓縮，得到浓縮液，然后用无水乙醇沉淀浓縮液中的多糖与蛋白，最后离心去除杂质，收集上清液即可作为上样样品。3上述蛹虫草液体培养液进行预处理操作中，浓縮是将蛹虫草液体培养液浓縮至原体积的1/5，浓縮温度为60°C。上述蛹虫草液体培养液进行预处理操作中，采用占浓縮液4倍体积的无水乙醇沉淀多糖与蛋白24小时；上述大孔树脂D-101在使用前，先进行预处理将树脂用蒸馏水充分淋洗，除去破碎和粒度极小的树脂；用80%的乙醇溶液浸泡过夜，去掉残留在树脂中的溶剂，并活化树脂；再分别用4%氢氧化钠溶液和4%盐酸溶液顺序浸泡35h，以除去树脂中的杂质，最后用蒸馏水反复冲洗至中性。本发明对上述制备所得虫草素提取物进行降血糖功效测试，首先对四氧嘧啶实验性糖尿病小鼠进行腹腔注射虫草素，然后观察小鼠空腹血糖值、口服葡萄糖耐量(0GTT)、脏器指数、体重、摄食量和饮水量等指标的变化，结果表明，剂量为72mg/kgd虫草素提取物能使高血糖模型小鼠的空腹血糖值下降46.67%(P<0.01)，口服葡萄糖耐量试验中的血糖AUC下降25.12%(P<0.01)，肾指数增加23.75%(P<0.05)，脾指数增加26.65%(P<0.05)，体重增加9.14%(P<0.05)，日摄食量减少25.05%(P<0.01)，日饮水量减少21.49%(P<0.01)，由此说明，虫草素具有良好的降血糖作用，改善糖尿病的多饮多食症状，而且对肾脏与脾具有保护作用，从而克客服了现有降血糖药物对肾脏脾脏伤害较大的问题，可作为生产虫草素单体、降血糖药物与降血糖保健食品开发的原料。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的虫草素提取物，其制备方法选择大孔树脂D-lOl的吸附处理，并对吸附处理过程中的参数进行优化选择，与现有方法相比，不但操作简单，工艺条件易控制，而且虫草素提取纯度高；2.本发明的虫草素提取物来源于蛹虫草液体培养液，具有对人体无毒害的优点，而且纯化过程中没有加入任何有害成分，对人体无毒害；3.本发明的虫草素提取物溶解性好，具有良好的降血糖作用。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1虫草素提取物的制备及参数优化本实施例的虫草素提取物，其制备方法包括如下步骤首先选择常规方法培养所得蛹虫草液体培养液作为原料，将蛹虫草液体培养液经旋转蒸发仪浓縮成原体积1/5，浓縮温度为6(TC;用4倍体积无水乙醇沉淀多糖24小时；低速大容量离心机分离沉淀，收集上清液作为上柱样品，其中虫草素的浓度为16.09iig/mL。分别选择不同的大孔吸附树脂S-8、NKA-9，D-101和AB-8进行吸附与解吸。结果发现D-lOl大孔树脂的静态吸附量最高，为O.117mg/g，其次是AB-8，为0.108mg/g，极性的NKA-9吸附效果最差，为0.080mg/g，非极性的D-101对虫草素的吸附能力最强。30%的乙醇溶液对大孔树脂D-101的解吸效果最好，为60.20%，其次是AB-8，为57.07%，NKA-9最差，为46.93%。鉴于D-101对虫草素的吸附与解吸效果较好，因此，采用D-101大孔树脂进行虫草素的纯化。大孔树脂D-101预处理将树脂用蒸馏水充分淋洗，除去破碎和粒度极小的树脂；用80%的乙醇溶液浸泡过夜，去掉残留在树脂中的溶剂，并活化树脂；再分别用4%氢氧化钠溶液和4%盐酸溶液顺序浸泡35h，以除去树脂中的杂质，最后用蒸馏水反复冲洗至中性。大孔树脂D-101吸附处理虫草素(1)进样速度对大孔树脂D-101吸附处理虫草素的影响比较当流出液体积达到345mL时，进样速度分别为20、40、60和80mL/h的未吸附率分别为17.64%、22.24%、33.15%和40.82%，其中，进样速度为20mL/h的吸附率是最高的，但是考虑到流速过小，实验时间延长，生产效率低。所以，本实施例选择使用40mL/h为最佳流速；(2)上柱样品pH对大孔树脂D-101吸附处理虫草素的影响比较当流出液体积达到388mL时，上柱样品的pH分别为5.0、7.0、9.0和11.0时的未吸附率分别为53.91%、48.38%、44.26%和40.86%，从数据可以看出，上柱样品的pH越高越有利于虫草素的吸附，考虑到pH值过高会影响大孔树脂的寿命，所以，本实施例选用上柱样品的pH为9.0。根据上面的参数优化结果，本实施例的大孔树脂D-101吸附处理虫草素前，先调节上柱样品的pH为9.0，并以40mL/h的流速进样，认为达到吸附饱和，结果表明，当进样量达到568mL时，树脂达到完全饱和，此时，饱和动态吸附量为0.183mg/g。上样后，先采用150mlpH9.0的超纯水过柱去除杂质后，再依次用体积百分比浓度为15%、35%、55%、75%和95%的乙醇各60mL作为洗脱剂进行梯度洗脱；通过对洗脱液中的含量测定，发现洗脱下来的虫草素81.47%集中在55%乙醇洗脱液中，17.15%集中在35%乙醇洗脱液中，把各组分浓縮，冷冻干燥，测得35%、55%、75%和95%的乙醇洗脱液纯度分别为5.38%、37.78%、1.05%和1.20%，因此本实施例选择55%乙醇溶液作为优选的洗脱剂，收集55%乙醇洗脱液，反复分离纯化后得到虫草素提取物，该虫草素精品经高效液相色谱法测定含虫草素61.55%，经考马斯亮兰法测定含蛋白质11.15%，经苯酚硫酸法测定含多糖8.51%。实施例2(1)昆明种SPF小鼠20士2g，适应性喂养三天后，禁食不禁水14h，每只小鼠按200mg/kg的剂量一次性腹腔注射1%的四氧嘧啶。72h后取尾取静脉血测血糖，取血前禁食8h。选取血糖浓度大于11.lmmo1/1的作为高血糖模型动物。(2)取高血糖模型小鼠分为高血糖模型对照组，阳性药物对照组和虫草素提取物高剂量治疗组，每组12只。取12只正常小鼠作为空白对照组。虫草素提取物高剂量治疗组腹腔注射实施例1制备的虫草素提取物72mg/kgd，阳性药物对照组腹腔注射盐酸苯乙双胍70g/kgd，高血糖模型对照组和空白对照组每天腹腔注射相应体积的生理盐水。(3)实验周期为21天，实验期间各组小鼠自由饮食，隔周测定空腹血糖含量，实验结束时进行口服葡萄糖耐量测试，测定肝糖原含量、脏器指数。实施例3(1)昆明种SPF小鼠20士2g，适应性喂养三天后，禁食不禁水14h，每只小鼠按200mg/kg的剂量一次性腹腔注射1%的四氧嘧啶。72h后取尾取静脉血测血糖，取血前禁食8h。选取血糖浓度大于11.lmmo1/1的作为高血糖模型动物。(2)取高血糖模型小鼠分为高血糖模型对照组，阳性药物对照组和虫草素提取物5中剂量治疗组，每组12只。取12只正常小鼠作为空白对照组。虫草素提取物中剂量治疗组腹腔注射实施例1制备的虫草素提取物24mg/kgd，阳性药物对照组腹腔注射盐酸苯乙双胍70g/kgd，高血糖模型对照组和空白对照组每天腹腔注射相应体积的生理盐水。(3)实验周期为21天，实验期间各组小鼠自由饮食，隔周测定空腹血糖含量，实验结束时进行口服葡萄糖耐量测试，测定肝糖原含量、脏器指数。实施例4(1)昆明种SPF小鼠20±2g，适应性喂养三天后，禁食不禁水14h，每只小鼠按200mg/kg的剂量一次性腹腔注射1%的四氧嘧啶。72h后取尾取静脉血测血糖，取血前禁食8h。选取血糖浓度大于11.lmmol/L的作为高血糖模型动物。(2)取高血糖模型小鼠分为高血糖模型对照组，阳性药物对照组和虫草素提取物低剂量治疗组，每组12只。取12只正常小鼠作为空白对照组。虫草素提取物低剂量治疗组腹腔注射实施例1制备的虫草素提取物8mg/kg*d，阳性药物对照组腹腔注射盐酸苯乙双胍70g/kgd，高血糖模型对照组和空白对照组每天腹腔注射相应体积的生理盐水。(3)实验周期为21天，实验期间各组小鼠自由饮食，隔周测定空腹血糖含量，实验结束时进行口服葡萄糖耐量测试，测定肝糖原含量、脏器指数。实施例24的实验数据如表1和表2所示。表1虫草素对糖尿病小鼠空腹血糖的影响G士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1中，与模型组相比，*:P<0.05，**:P<0.01.从表1可见，本发明得到的虫草素提取物对小鼠具有良好的降血糖作用。虫草素提取物72mg/kgd、24mg/kgd、8mg/kgd治疗组小鼠的空腹血糖21天后，分别下降了46.67%(P<0.01)、32.84%(P<0.05)和18.36%。三个虫草素提取物治疗组小鼠的血糖与阳性对照组小鼠的血糖比较，差异不显著，这说明虫草素提取物降血糖作用良好，一定剂量的虫草素降糖效果与阳性对照{盐酸苯乙双胍(降糖灵M的效果相当，虫草素高剂量组的降糖效果甚至优于盐酸苯乙双胍。表2虫草素提取物对小鼠口服葡萄糖耐量的影响G士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2中，与模型组相比，*:P<0.05，**:P<0.01.从表2可见，本发明得到的虫草素提取物能推迟小鼠口服葡萄糖后血糖升高时间及改善糖耐量能力，口服葡萄糖后，虫草素提取物高剂量组与阳性对照组小鼠的血糖值在lh时才升至最高水平，其他各组小鼠的血糖值均在O.5h时就升到最高水平。与模型对照组相比，虫草素提取物高、中、低剂量组的血糖AUC分别下降了25.12%(P<0.01)、20.64%(P<0.05)、10.47%。虫草素提取物高剂量组与阳性对照组的血糖AUC之间的无显著性差异，这表示高剂量虫草素提取物的效果与盐酸苯乙双胍接近。本发明得到的虫草素提取物还能提高小鼠肾指数和脾指数。与高血糖模型对照组相比，高、中、低剂量虫草素提取物能使小鼠的肾指数分别增加23.75%(P<0.05)、23.07%(P<0.05)和13.15%，脾指数分别增加26.65%(P<0.05)、17.18%和5.28%。虫草素对小鼠的肾脏与脾具有保护作用。本发明得到的虫草素提取物高、中、低剂量组小鼠的体重与高血糖模型组比较，分别增加了9.14%(P<0.05)、11.24%(P<0.05)和4.6%。虫草素能显著改善糖尿病小鼠的多饮多食症状，虫草素提取物高、中、低剂量组小鼠的日摄食量分别减少了25.05%(P<0.01)、15.57%(P<0.01)和14.18%(P<0.01)，日饮水量分别减少21.49%(P<0.01)、12.84%(P<0.01)和8.32%(P<0.01)。权利要求一种虫草素提取物，其特征在于该虫草素提取物是将蛹虫草液体培养液上样大孔树脂D-101，洗脱剂采用体积百分比为55％的乙醇，从而制备得到虫草素提取物。2.根据权利要求1所述虫草素提取物，其特征在于所述蛹虫草液体培养液上样大孔树脂D-101时，上样液的pH为9.0，以40mL/h的流速进样。3.根据权利要求1所述虫草素提取物，其特征在于所述蛹虫草液体培养液上样前先进行预处理，其步骤为先将蛹虫草液体培养液浓縮成原体积的1/5，得到浓縮液，浓縮温度为60°C，然后用4倍体积无水乙醇沉淀浓縮液中的多糖24小时，最后离心处理，收集上清液作为上样液。4.权利要求1所述虫草素提取物在制备降血糖药物或保健食品中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于所述虫草素提取物在制备降血糖药物或保健食品时，其使用剂量为72mg/kgd。全文摘要本发明公开一种虫草素提取物和在制备降血糖药物或保健食品中的应用，该虫草素提取物是将蛹虫草液体培养液上样大孔树脂D-101，洗脱剂采用体积百分比为55％的乙醇，从而制备得到。本发明的虫草素提取物，其制备方法选择大孔树脂D-101吸附处理，并对吸附处理过程中的参数进行优化选择，与现有方法相比，不但操作简单，工艺条件易控制，而且虫草素提取纯度高。本发明的虫草素提取物来源于蛹虫草液体培养液，具有对人体无毒害的优点，而且纯化过程中没有加入任何有害成分，对人体无毒害。本发明的虫草素提取物溶解性好，具有良好的降血糖作用。文档编号A23L1/29GK101716196SQ20091019439公开日2010年6月2日申请日期2009年12月4日优先权日2009年12月4日发明者张松,杜梅申请人:华南师范大学