专利名称：青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤藓醇激酶编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程技术领域的编码序列，具体是一种青蒿4-(5' -二 磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列。
背景技术：
青蒿"/^e啦'da a/ /7朋L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从 其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公 认的最有效的治疗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前， 世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另 外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗 炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见青蒿素是一种极具潜力的天然 药物。
目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的 含量非常低，为0. 01%~1%，低含量使得青蒿素的大规模商业化生产受到了限制。 由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大、产量低、成本高，因此人工生产缺乏可 行性。也有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈 伤组织中的含量低于干重的0.1%，在芽中含量最高也只有干重的0. 16%,大多 数研究没有检测到青蒿素。因此，利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的也不 具备可行性。Dahua Chen等在《Plant Science》(植物科学)2000年155 期179-185页发表了题为"Expression of a chimeric farnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L transgenic plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation"(通过农杆菌介导转化在青蒿植株中 表达法尼基焦磷酸合酶基因)的论文，文中评述，通过过量表达法尼基焦磷酸合 酶(farnesyl diphosphate synthase ，FPS)可在原有基础上提高青蒿素含量2 倍-3倍，达到1%左右。
随着近年来植物基因组学的发展，青蒿素合成途径的基因分离、克隆和功能性研究已经取得了突破性的进展。人们已经初步完成了对参与青蒿素合成途径关 键基因的分离和功能验证工作，并分析了青蒿素合成途径概貌。
经对现有技术的文献检索发现，尚未见与青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种青蒿4-(5' -二磷酸胞 苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列。本发明可提高青蒿中青蒿素的含量以及 其他植物的异戊二烯类化合物含量，可以使含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列的转基因植物成为生物反应器，实现青蒿素的大规 模生产和其他异戊二烯类化合物的生产。
本发明是通过以下技术方案实现的，
本发明涉及一种青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序 列，该序列如SEQ ID NO: 3中第15 1214位所示或者是SEQ ID NO: 3序列中 第15~1214位所示的核苷酸中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码 子取代后产生的序列。
所述青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列如SEQ ID NO: 3中第15 1214位所示。
本发明还涉及一种多肽，序列如SEQ ID NO: 4所示。
本发明还涉及一种利用所述青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇 激酶编码序列提高植物青蒿素含量的方法，包括如下步骤
步骤一，将青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列连 于植物表达调控序列上，构建含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇 激酶编码序列的植物表达载体；
步骤二，将步骤一中的表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；
步骤三，通过抗生素筛选，获得含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列的转化细胞，再生转基因植株。
步骤二中，所述转入采用冻融法。
本发明中，构建步骤一中含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇 激酶编码序列的植物表达载体时可选用本领域已知的各种载体，例如质粒，粘 粒等。本发明中，步骤三中，含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-0-赤藓醇
合酶编码序列的转化细胞为真核细胞。进一步地，真核宿主细胞为酵母细胞、拟 南芥的生殖细胞或愈伤组织细胞、其他植物的生殖细胞或愈伤组织细胞。
术语"简并"是指编码氨基酸的大部分密码子具有简并性，即两个或多个 密码子编码同一氮基酸。例如GM和GAG都编码谷氨酰胺。 本发明具有如下的有益效果
本发明可提高青蒿素含量；同时本发明可使含青蒿4-(5' -二磷酸胞 苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列的转基因植物成为生物反应器，实现异戊 二烯类化合物的大规模生产；利用本发明的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基 -D-赤藓醇激酶蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与青蒿4-(5' -二磷酸 胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或 拮抗剂等。
本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍， 朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志， 2008, 28 (3) : 38 43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的 商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册见New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商 所建议的条件。
实施例
步骤一，青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列《M) 的克隆
(1) RNA的提取(RNA extraction) 取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1. 5mL Eppendorf (EP) 离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性 胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。(2)基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)
根据拟南芥中相关基因所编码的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原 理，采用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)方法(Clontech公司SMART RACE试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行
① 首链cDNA的合成
利用SMART RACE试剂盒所提供的5'-CDS primer A和SMART II A oligo 引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成 5，-RACE -Ready cDNA;利用Clontech试剂盒所提供的3，-CDS primer A为引 物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成 3，-RACE-Ready cDNA。
② 3,-RACE
用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的 基因特异引物2 (GSP2) (SEQ ID NO: 1)进行3'-RACE PCR反应。用琼脂糖凝 胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载 体上进行测序。
③ 5, -RACE
用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的 基因特异引物l (GSP1) (SEQ ID NO: 2)进行5， -RACE PCR反应。用琼脂糖凝 胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到PMD18-T载 体上进行测序。将测序结果的重叠区拼接，得到该基因的完整编码区序列。BLAST 分析结果证明从青蒿中得到的基因确为一个4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶的相关基因。
通过上述步骤，获得了青蒿中参与青蒿素合成的4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO: 3)，其中，起始密码子 为ATG，终止密码子为TAA。本实施例中得到的新的青蒿C抓的全长cDNA长度 为1480bp，详细序列见SEQ ID NO: 3,其中开放阅读框位于15~1214位核苷 酸(1200个核苷酸，含终止密码子)。根据所获得的cDNA推导出青蒿4-(5'-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶的氨基酸序列， 共399个氨基酸残基，详 细序列见SEQ ID NO: 4。步骤二，青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(;-甲基-0-赤藓醇激酶相关基因的序
列信息与同源性分析
步骤一中得到的青蒿C舰(4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶) 的全长cDNA长度为1200bp (SEQ ID NO: 3)，其中开放阅读框位于第15-1214 位核苷酸，根据所获得的cDNA推导出青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶的氨基酸序列(见SEQ ID NO: 4)，共399个氨基酸残基，分子量 为43818. 44,等电点为7.15。利用vectorNTI 9. 0软件对来源于各种植物的4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D"赤藓醇激酶的相关氨基酸序列进行同源比对，结果 发现，克隆到的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列与 拟南芥(Arabidopsis thaliana)， 玉米 (Zea may)， 烟草 (Nicotiana Benthamiajm)，薄荷(Mentha x piperita)，番茄(Lycopersicon esculent咖) 以及甜叶菊(Stevia rebaudiana) 中同源基因所编码的氨基酸序列相似性 分别为70%, 76%， 72%， 70%， 78%， 78%。由此可见，青蒿0^基因与其他高 等植物中的C服相关基因在所编码的氨基酸水平上存在较高的同源性，可以认为 它们的产物在功能上也有较高的相似性。
步骤三，青蒿4-(5， -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶相关蛋白或多 肽在青蒿细胞中进行真核细胞表达
(1)含目的基因(青蒿CMK基因)的表达载体的构建
根据青蒿C服的全长编码序列(SEQ ID NO: 3)，设计扩增出完整编码阅读 框的引物，并在正反引物上分别引入^a/zHI和&cI限制性内切酶位点，以便构 建表达载体。以青蒿cDNA为模板，经PCR扩增后，将青蒿C服的编码区序列连 接至中间载体pMD18-T中进行测序。将测序正确的C服的编码区序列进一步克 隆到表达载体pCAMBIA2300中，接着将其转入根癌农杆菌EHA105，并进行PCR 验证。结果表明，含青蒿Off基因的植物表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株 中。
(2)根癌农杆菌介导C服基因转化青蒿 ①外植体的预培养
青蒿种子用75% (v/v)乙醇浸泡1 min;再用20% (w/v) NaC10浸泡20 min; 无菌水冲洗3-4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培 养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，可以通过商业渠道获得；25'C、 16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗。待 苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
② 农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到1/2 MS和100 Mrnol/L AS组成的共培养培养基 中，滴加含活化好的所述含DEL0到DEL8基因植物双元表达载体的根癌农杆菌 工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28'C暗培养3d。以滴加在不 带有目的基因的根癌农杆菌的1/2 MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
③ 抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0. 5 mg/L 6-BA、 0. 05 mg/L NAA、 50 mg/L Kan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25'C、 16小时的日 光和8小时的黑暗中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得 Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/L Cb组成 的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。
④ 转基因青蒿植株的PCR检测
根据目的基因所在表达盒p35s-CMK -nos序列p35s和C服分别设计正向引 物设计和反向引物对C服基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引 物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增 出任何片段。
步骤四，利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量 (1) HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC:采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱 (Sy咖etryShieldTMC18， 5 ^m, 250x4. 6咖，Waters),流动相甲醇(methanol): 水为70%:30%，柱温30'C，流速1. OmL/min,进样量10 灵敏度(AUFS:l. 0)， 理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
ELSD:采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40 'C,放大系数(gain)为7，载气压力5 bar;
精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0 mg用1 mL甲醇完全溶解，得到 2 mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20'C备用。
本实施例中流动相甲醇(methanol):水为70%:30%时，青蒿素的保留时间 为5.1 min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。(2) 标准曲线的制作 将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2 nL, 4 ^L, 6 nL， 8 pL，
10nL记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X, pg)进行回归分 析。通过研究，本实施例中青蒿素在4-20 pg范围内呈现良好的log-log线性 关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为Y=l. 28e+000X+4. 71e+000， R=0.979546。
(3) 样品的制备和青蒿素含量的测定
青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburgh et al. (2006)中报道的方法取 少量新鲜的青蒿叶片(1-2 g鲜重)，于50 ml试管中将其浸没在10 ml氯仿中 摇荡l分钟，将浸出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3ml无水乙醇充分 溶解提取物，用于HPLC检测。同时，氯仿提取后的叶片收集放入60度烘箱进 行烘干，称重(计算青蒿叶片的干重)；
采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20 根据峰面积代入 线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)， 从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。
在本实施例中编码4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(6MD基 因的转化显著提髙了青蒿叶片中青蒿素含量，这使得转基因植株中青蒿素的含量 超过对照非转化普通青蒿的50%以上。由此可见，4-(5，-二磷酸胞苷)-2-C-甲基 -D-赤藓醇激酶基因可作为一种获得了青蒿素高产的青蒿植株的候选基因，用于 利用转基因技术提髙植物青蒿素含量和其他异戊二烯类化合物的研究和产业化 生产中。
9序列表
〈110>上海交通大学
<120>青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶蛋白编码序列 〈160> 4
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1 <211> 25 <212〉 DNA
<213> 青蒿(Artemisia annua L ) <400> 1
aggccgtgga aaatacgatg ctgtt 25
<210> 2 〈211〉 25 <212> 醒
〈213> 青蒿(Artemisia annua L ) 〈400〉 2
cccgtctggc ctcttattgg ttatt 25
<210> 3 <211> 1480 〈212〉 DNA
〈213> 青蒿(Artemisia annua L.) <400> 3
ggtaactaac caccatggca acaatggctg ctgcttcttc tcacttgttt gtatatcatc aaaattcaac aaatcctcca ttactttaaa acaatcttcg agaattgcag aaattttaga acccatttgg、 tggttaaagc ttcttcatct acaccaaaaa tggaagaaaa caagaggagt tggtgtataa tcttgatgag gattagctga tgaggtggat atgaatgctg gattgtcaag actctctttg gtaagatcaa tgttttctta agaataacca ataagaggcc agacgggttt catctctatt tcatgtaatc agcttagggg ataagataaa gttctcctta aaactacaga tcgcctctca actaatgtgc caggaattcc acttgatgaa
tac幼caatg 60
ttttatcata 120
gataataatg 180
aagctaaatc 240
ttttctcctt 300
catgacctag 360
tcaccatcga 420
agaaatttga 480taataaaggc cttaaatcta tatcggaaga agacgggaag tgacaaattc ttttgggtac 540
atgttgataa aaaggttcca actggggctg ggcttggtgg cggaagtagt aatgctgcaa 600
ccgcactttg ggcagcaaac caattcagtg gttgcctagc aacggagcaa gaactccaag 660
aatggtctgg tgagattggt tcagatgtcc ccttcttctt ctccaatgga gccgcctatt 720
gcacgggtag aggcgaggtt gttcaagata taccttcacc tgtacctttt gacttaccaa "780
tggttctgat taagcctcca gaggcatgct ctactgctga agtttacaag cgtttccggt 840
tggatgtatc aagtactgct gatcctttag cattgctgga gaagatctca aaaatatggaa 900
tatcacaaga tgtttgcata aacgatttgg aaccgcctgc ttttgaagtt cttccgtctc 960
tgaagagact aaaacaacgc atagttgctg caggccgtgg aaaatacgat gctgttttta 1020
tgtctggaag tggaagcacc atagtaggcg tgggttctgc agatccccca caatttttat 1080
atgatgaatga ggattataag gacgtctttc tatccgaagc taacttcatc acacgcacag 1140
agaaccaatg gtaccaagaa ccatcttcgt caaatactac ttcatttgta gatcaatcca 1200
gttgacaggt ttcaacatta tcaaacatcg
atagtccgat
gctacgctgc aatttaggat atctgttata ttgcggcc犯aaatcattta tcttattgcc aaagtttgat
tatggatgtg tcctttatat
tatgattctt gtctagtcac
tgttgtaaga tcggcttaga eigtcatagaa gtgagcatca atgtagcatc ctttctaaat agttattgtg
tttttatctt ataactttac
〈210> 4 〈211〉 399 〈212〉 PRT
<213> 青蒿(Artemisia annua L ) 〈400〉 4
Met Ala Thr Met Ala Ala Ala Ser Ser His Leu Phe Tyr Asn Asn Gly
5 10
15
1260 1320 1380 1440 1480
lie Ser Ser Lys Phe Asn Lys Ser Ser lie Thr Leu Lys Gin Ser Ser
20 25
30Phe Tyr His Lys Asn Cys Arg Asn Phe Arg Thr His Leu Val Val Lys 35 40 45
Ala Ser Ser Ser Asp Asn Asn Asp Thr Lys Asn Gly Arg Lys Gin Glu 50 55 60
Glu Leu Val Tyr Asn Leu Asp Glu Lys Leu Asn Arg Leu Ala Asp Glu 65 70 75 80
Val Asp Met Asn Ala Gly Leu Ser Arg Leu Ser Leu Phe Ser Pro Cys 85 90 95
Lys lie Asn Val Phe Leu Arg lie Thr Asn Lys Arg Pro Asp Gly Phe 100 105 110
His Asp Leu Ala Ser Leu Phe His Val lie Ser Leu Gly Asp Lys lie 115 120 125
Lys Phe Ser Leu Ser Pro Ser Lys Thr Thr Asp Arg Leu Ser Thr Asn 130 135 140
Val Pro Gly lie Pro Leu Asp Glu Arg Asn Leu lie lie Lys Ala Leu 145 150 155 160
Asn Leu Tyr Arg Lys Lys Thr Gly Ser Asp Lys Phe Phe Trp Val His 165 170 175
Val Asp Lys Lys Val Pro Thr Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gly Ser Ser 180 185 190
Asn Ala Ala Thr Ala Leu Trp Ala Ala Asn Gin Phe Ser Gly Cys Leu 195 200 205
Ala Thr Glu Gin Glu Leu Gin Glu Trp Ser Gly Glu lie Gly Ser Asp 210 215 220
Val Pro Phe Phe Phe Ser Asn Gly Ala Ala Tyr Cys Thr Gly Arg Gly 225 230 235 240Glu Val Val Gin Asp lie Pro Ser Pro Val Pro Phe Asp Leu Pro Met 245 250 255
Val Leu lie Lys Pro Pro Glu Ala Cys Ser Thr Ala Glu Val Tyr Lys 260 265 270
Arg Phe Arg Leu Asp Val Ser Ser Thr Ala Asp Pro Leu Ala Leu Leu 275 280 285
Glu Lys lie Ser Lys Asn Gly lie Ser Gin Asp Val Cys lie Asn Asp 290 295 300
Leu Glu Pro Pro Ala Phe Glu Val Leu Pro Ser Leu Lys Arg Leu Lys 305 310 315 320
Gin Arg lie Val Ala Ala Gly Arg Gly Lys Tyr Asp Ala Val Phe Met 325 330 335
Ser Gly Ser Gly Ser Thr lie Val Gly Val Gly Ser Ala A印Pro Pro 340 345 350
Gin Phe Leu Tyr Asp Glu Glu Asp Tyr Lys Asp Val Phe Leu Ser Glu 355 360 365
Ala Asn Phe lie Thr Arg Thr Glu Asn Gin Trp Tyr Gin Glu Pro Ser 370 375 380
Ser Ser Asn Thr Thr Ser Phe Val Asp Gin Ser Ser Tyr Ala Ala 385 390 39权利要求
1、一种青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列，其特征是，该序列如SEQ ID NO3中第15～1214位所示或者是SEQ ID NO3序列中第15～1214位所示的核苷酸中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。
2、 根据权利要求l所述的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列，其特征是，该序列如SEQ ID NO: 3中第15 1214位所示。
3、 一种多肽，其特征在于，序列如SEQ ID NO: 4所示。
4、 一种利用权利要求l所述的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列提高植物青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，将青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-0-赤藓醇激酶编码序列连于植物表达调控序列上，构建含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列的植物表达载体；步骤二，将步骤一中的表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；步骤三，通过抗生素筛选，获得含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列的转化细胞，再生转基因植株。
5、 根据权利要求4所述的利用青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列提高植物青蒿素含量的方法，其特征是，步骤二中，所述转入具体为采用冻融法进行转入。
全文摘要
一种基因工程技术领域的青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列，序列如SEQ ID NO3中第15～1214位所示或者是SEQ ID NO3序列中第15～1214位所示的核苷酸中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列；利用所述编码序列提高植物青蒿素含量的方法包括如下步骤将所述编码序列连于植物表达调控序列上，构建含青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列的植物表达载体；将步骤一中的表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；通过抗生素筛选，获得含有青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶编码序列的转化细胞，再生转基因植株。本发明可提高青蒿中青蒿素的含量以及其他植物的异戊二烯类化合物含量。
文档编号C12N15/54GK101665796SQ20091019517
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月4日 优先权日2009年9月4日
发明者唐克轩, 可 杨, 王玥月, 翁纯纯 申请人:上海交通大学