专利名称：一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于一种利用荧光PCR区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法与试剂盒。
背景技术：
军团菌(Legionella)是一类革兰氏阴性菌，目前已发现有34个种53个血清型。 军团菌经常藏匿于空调冷却器(塔)、热水管道、淋浴喷头等处，通过空气传播，以气溶胶的 形式经呼吸道吸入人体引起人类引起军团菌病，病人会出现高烧、寒颤、咳嗽、胸闷等类似 于上呼吸道疾病的症状，严重时引起死亡，现在一般的报道它的死亡率是在5 30%。由于 军团菌人类生活的场所中广泛存在，该病一旦暴发流行，起危害是相当大的；据报道，在冷 却水塔里面的军团菌检出阳性率比较高，从15%到30%不等。2006年，卫生部对全国公共 场所集中空调的抽检中也发现，军团菌检出率高达对.5%。此外，从军团菌病患者和环境水 检出结果看，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)检出率最高，在临床上引起的危害也 比其它军团菌属细菌更严重。传统的军团菌检出主要手段是分离培养法，但该方法费时、操作麻烦。此外也有采 用Dieterle镀银法涂片观察、免疫层析、直接荧光抗体测定、PCR电泳或探针杂交检测方法 进行诊断的。但这些方法存在灵敏度不足等缺陷，容易造成漏检。近年来，随着分子生物学 的进展，实时荧光PCR技术在病原体检测中得到广泛应用，和传统PCR电泳检测方法比较具 有许多优点(1)其采用的闭管检测消扩增产物污染问题，提高了检测准确度J2)PCR体系 中增加了荧光探针，提高了检测特异性和灵敏度；C3)操作迅速，无需传统PCR的后处理检 测步骤，自动化程度高。如果在反应体系中引入内参照和双波长荧光探针，还能监测因样品 中可能的PCR抑制剂引起的检测结果假阴性。目前，临床实验室中已经有利用荧光PCR检测军团菌并区分嗜肺军团菌的报道， 例如 Templeton 等(J Clin Microbiol, 2003 (41) :4016-4021)利用分子信标(Molecular Beacon)多色荧光PCR技术检测军团菌16S rRNA、mip基因以及外标内参基因WiHV，将 嗜肺军团菌和其它军团菌相区分。Stolhaug等(Appl Environ Microbiol, 2006 (72) 6394-6398)利用FRET探针荧光PCR技术检测军团菌16S rRNA基因，并通过扩增产物的熔 解曲线分析将嗜肺军团菌和其它军团菌相区分；但可以分析，由于不同血清型菌株基因序 列变化，嗜肺军团菌熔解曲线可能会因特征不明显而导致结果无法判断。本发明提供一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法与试剂盒，利用TaqMan探 针多色荧光PCR技术，无需检测多个特征基因而仅需检测军团菌16S rRNA基因序列，无需 荧光PCR后的熔解曲线分析而仅凭不同荧光标记的探针检测就能将嗜肺军团菌和非嗜肺 军团菌相区分；同时本发明还引入了人工构建的内参照系统，用于避免检测结果的假阴性。 和现有区分检测非嗜肺与嗜肺军团菌的公开技术比较，本发明的检测结果稳定可靠，试剂 盒使用方便，适合于疾控和临床中军团菌和嗜肺军团菌的快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂盒，它采用 基于军团菌靶序列SEQ ID No. 1设计的引物探针，通过TaqMan探针多波长荧光PCR技术单 管扩增检测军团菌和嗜肺军团菌，并根据该结果辨别区分非嗜肺与嗜肺军团菌；同时试剂 盒还使用了人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性。试剂盒组分包括核酸提取 液、PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性对照；其使用包括样本处理和扩增检 测两步骤。试剂盒操作简便，灵敏度高，不仅可避免自身PCR产物核酸污染产生的假阳性， 而且能解决因样本中PCR抑制剂引起的假阴性问题，可广泛应用于疾控和临床中军团菌和 嗜肺军团菌的快速检测。1.实时荧光PCR引物探针的设计与合成通过对GenBank中军团菌属16S rRNA基因序列查询，用分子生物学专业软件对各 种来源军团菌、嗜肺军团菌基因序列进行比对后发现，其中一段序列SEQ ID No. 1在所有军 团菌属细菌中较为保守，且具有嗜肺军团菌特异性序列。因此，按照TaqMan荧光PCR设计的 原则和SEQ ID No. 1序列，设计了一对军团菌属特异性引物、一条军团菌属细菌荧光探针、 一条嗜肺军团菌荧光探针用于军团菌和嗜肺军团菌实时检测。引物和探针碱基序列如下上游引物为5，-TgTgAAATTCCTgggCTTAAC-3，，如 SEQ ID No. 2 所示；下游引物为5，-TTCgTgCCTCAgTgTCAg-3，，如 SEQ ID No. 3 所示；军团菌荧光探针为5’义4881480^017(^0-3’，5’端标记？411(6-羧基荧光素)， 3，端标记 BHQ(Black Hole Quencher))，如 SEQ ID No. 4 所示。嗜肺军团菌荧光探针为5，-TgggACggTCAgATAATACTggTT-3，(5，端标记 HEX (6-羧 基六氯荧光素)或J0E(6-羧基_4，，5，- 二氯_2，，7，- 二甲氧基荧光素)、VIC荧光基团， 3，端标记BHQ)，如SEQ ID No. 5所示。军团菌和嗜肺军团菌检测引物探针序列也可以是上述序列按照靶序列SEQ ID No. 1向前或向后延伸10 20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。本发明的另一方面是采用了人工构建的内参照系统，用于监测样品扩增反应中可 能的PCR抑制物，避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参探针和内参DNA，其中内参探 针采用SEQ ID No. 6序列5，-TTCAgCgAgCgTgggACATCAgg-3，(5，端标记 Cy5 或 ROX (羧基-X-罗丹明)、 TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)荧光基团，3’端标记BHQ)，内参探针也可以是和上述序列同 源性大于85%以上的序列。内参照系统中的内参DNA为人工构建的DNA模板，它含有待检核酸(军团菌DNA) 扩增引物中的一条引物序列和另一条引物互补序列、以及内参探针序列或其互补序列，并 且一条引物序列和另一条引物互补序列分别位于内参探针序列或互补序列的上下游。通过上述设计，获得的一对引物序列为军团菌属细菌所特异，两条荧光探针分别 为军团菌属细菌和嗜肺军团菌所特异；而内参照系统包括内参探针和内参DNA，上述引物 探针由商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司等)合成后用无菌双蒸水 溶解至浓度为25 μ Μ, -20°C保存。2.试剂盒的制备含有上述引物和探针的军团菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(32人份)，其主要成分如下(1)核酸提取液 1. 5ml，主要成分为 10 50mM NaOH, 5 IOmM EDTA、1% 10% Triton X_100、l% 10% NP-40。(2) PCR 缓冲液 0. 7ml，主要成分有 Tris-HCl (pH8. 3)、KC1、明胶、dATP、dGTP、dCTP、 dUTP、MgCl2、引物。(3)荧光探针0. 1ml，含有军团菌、嗜肺军团菌荧光探针。(4) Taq酶70 μ 1，含Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)。(5)内参照16 μ 1，含内参探针和内参DNA。(6)阴性对照200 μ 1，为大肠杆菌培养物。(7)阳性对照200 μ 1，为嗜肺军团菌培养物。上述组装成的试剂盒在-20 V保存。由(2) (5)及模板配制的30 μ 1反应体系各主要成分浓度如下Tris-HCl (pH8. 3) 10mM、KCl 50mM、明胶 0. lmg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0· 2 0. 4mM、MgCl22. 5 5mM、引物各0. 2 0. 5 μ Μ、军团菌、嗜肺军团菌荧光探针及内参探针各 0. 1 0. 5 μ M、Taq DNA 聚合酶 1 5U、UNG 酶 0. 1 1U。在本发明另一优选例中，由(2) (5)及模板配制的30 μ 1反应体系各主要成分 浓度如下Tris-HCl (pH8. 3) IOmM, KCl 50mM、明胶 0. lmg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0. 3mM、MgCl23. 5mM、引物各0. 35 μ Μ、军团菌荧光探针和嗜肺军团菌荧光探针各0. 2 μ Μ、内 参探针 0. 15 μ Μ、Taq DNA 聚合酶 2U、UNG 酶 0. 2U。3.试剂盒使用方法本发明试剂盒在样品军团菌和嗜肺军团菌检测过程中的使用步骤之一为(1)样品处理取采集的样品，如果是待测的水样或空气，需先经滤膜(孔径0. 22 0. 45 μ m)过 滤、洗脱后置于离心管中；如果是临床咽拭子清洗液、支气管肺泡灌洗液、痰液(需先液化) 样本则直接置于离心管，样品液13，OOOrpm离心6分钟，用移液器小心吸弃上清(为防止吸 走沉淀，可保留5 μ 1残液)。在沉淀中加入50 μ 1核酸提取液，旋涡振荡混勻后100°C保持 10分钟，13，OOOrpm离心6分钟取上清进行荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处 理方法和样品液相同。(2)扩增检测试剂盒首次开封使用时，将内参照管低速离心数秒后全部加入到PCR缓冲液中， 在旋涡振荡器上振荡混勻使用。按照待检测样本数n+2，取PCR缓冲液21 X (n+2)、荧光探 针3X (n+2)、Taq酶2X (n+2)组分，混勻后每个扩增管分装沈μ 1，分别加入按照样本处 理方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照以及上述处理好的η个样本模板各4μ 1。每个 反应扩增管体积为30 μ 1，将上述扩增管放到多通道实时荧光PCR仪器上按照50°C 2min、 94°C 2min后94°C 10sec,60°C 45sec循环40次的程序运行。运行结束后结果按照下表判断。
权利要求
1.本发明为一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂盒，其特征在于，采用基 于军团菌靶序列SEQ ID No. 1设计的引物探针，通过TaqMan探针多波长荧光PCR技术单管 扩增检测军团菌和嗜肺军团菌，并根据该结果辨别区分非嗜肺与嗜肺军团菌。
2.如权利要求1所述，其特征在于，所用靶序列SEQID No. 1为军团菌16SrRNA基因中 能用于区分非嗜肺与嗜肺军团菌的保守序列，根据SEQ IDNo. 1序列设计的引物能扩增其连 续70 300个核苷酸、设计的两种TaqMan探针荧光探针能分别检测军团菌和嗜肺军团菌， 所述引物长度为15 35个核苷酸、探针长度20 50个核苷酸。
3.如权利要求2所述，其特征在于，试剂盒所用的引物序列可以为SEQIDNo. 2和SEQ ID No. 3的序列；军团菌荧光探针可以为SEQ ID No. 4序列，其5’端标记FAM荧光基团；嗜 肺军团菌荧光探针可以为SEQ ID No. 5序列，其5，端标记HEX或JOE、VIC荧光基团；两条 探针3’端标记BHQ淬灭基团。引物探针序列也可以是上述序列按照靶序列SEQ ID No. 1 向前或向后延伸5 20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。
4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的内参照系 统用于避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参探针和内参DNA。
5.如权利要求4所述，其特征在于，内参探针采用SEQID No. 6序列，探针5’端标记 Cy5或R0X、TAMRA荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团；内参探针也可以是和上述序列同源性 大于85%以上的序列。
6.如权利要求4所述，所用的内参DNA为人工构建的DNA模板，它含有待检核酸(军团 菌DNA)扩增引物中的一条引物序列和另一条引物互补序列、以及内参探针序列或其互补 序列，并且一条引物序列和另一条引物互补序列分别位于内参探针序列或互补序列的上下 游位置。
7.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，包括核酸提取液、PCR缓冲液、荧 光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性对照。
8.如权利要求1所述方法和引物探针建立的试剂盒，其特征在于按照以下浓度配制成 的反应体系进行扩增反应Tris-HCl (pH8. 3) IOmM, KCl 50mM、明胶 0. lmg/ml、dATP、dGTP、 dCTP、dUTP各0. 2 0. 4mM、MgCl22. 5 5mM、引物各0. 2 0. 5 μ Μ、军团菌荧光探针和嗜 肺军团菌荧光探针及内参荧光探针各0. 1 0.5 μ MJaq DNA聚合酶1 5U、UNG酶0. 1 1U。
9.如权利要求1所述试剂盒在军团菌和嗜肺军团菌快速鉴定中的应用，包括以下步骤(1)样本处理提取模板DNA，样本为痰液、咽拭子、支气管肺泡灌洗液等临床样本或水、 空气样品。(2)模板DNA扩增检测，以荧光PCR仪上三个检测通道扩增模板的荧光信号强弱和循环 阈值来判断样品中军团菌和嗜肺军团菌存在，从而对样品中的非嗜肺与嗜肺军团菌进行区 分辨别。
全文摘要
本发明为一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂盒，它采用基于军团菌靶序列SEQ ID No.1设计的引物探针，通过TaqMan探针多波长荧光PCR技术单管扩增检测军团菌和嗜肺军团菌，并根据该结果辨别区分非嗜肺与嗜肺军团菌；同时试剂盒还使用了人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性。试剂盒组分包括核酸提取液、PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性对照；其使用包括样本处理和扩增检测两步骤。试剂盒操作简便，灵敏度高，不仅可避免自身PCR产物核酸污染产生的假阳性，而且能解决因样本中PCR抑制剂引起的假阴性问题，可广泛应用于疾控和临床中军团菌和嗜肺军团菌的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102071247SQ200910199298
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月24日 优先权日2009年11月24日
发明者吴大治, 夏懿, 李志远 申请人:上海复星医学科技发展有限公司, 上海复星医药(集团)股份有限公司