专利名称：一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种克隆水稻基因的方法，具体地说，涉及一种克隆水稻复杂性状相 关联基因的方法。
背景技术：
随着越来越多的植物基因组测序的完成，从大量的基因组数据中克隆和挖掘相关 功能基因成为了人们当前的重要工作。农作物农艺性状大部分为复杂性状，如产量、稻米品 质、千粒重、花期、穗长、株高和抗旱性等，都由多个基因共同作用来控制，且每一个基因的 贡献都比较小。针对这部分性状的研究，目前多半采用全基因组数量性状位点作图方法来 寻找基因组中对该性状有贡献的位点，但要进一步走到克隆相关基因，却还要面临难以逾 越的障碍，包括精细定位、数量性状的鉴定和单个基因无法表现等。在自然界长期进化中，每一种植物都拥有丰富的生态表现型，从这些生态型中挖 掘有利基因成为当前分子生物学的重要内容。目前人们已经开发了许多分子生物技术手 段，利用它们产生的标记来表现物种的多态性。例如简单重复序列(SSR)、扩增片段长度多 态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、插入缺失标记QnDel)和单核苷酸多态性 (SNP)等，但这些技术手段仍难以具体到控制植物发育的基因上。基因组测序技术的发展促使多个植物的基因组测序工作的完成，针对基因组序列 已经知晓的情况下，人们开发了一些加快基因组功能研究的新技术。定向诱导基因组局部 突变(TILLING)方法可以直接用来发现化学诱导突变造成的基因变异(HenikoffS，Till BJ, Comai L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiology. 2004，135(2) :630-636.)，也被用来了解自然群体中个体的多态性，被称为 EC0-TILLING。但从当前的研究报告来看，其多态性仅仅是用来进一步测序验证的基础，然后利 用序列分析该位点的多态性，是单核苷酸多态性技术的一种延伸。到目前为止，唯一利用该 技术在葫芦植物中寻找到一个简单遗传的抗病基因(Nieto C，Piron F, Dalmais M，Marco CF, Moriones E, Gome ζ -Gu ill amon ML, Truniger V, Gomez P, Garcia—Mas J, Aranda MA, Bendahmane A.EcoTILLING for the identification of allelic variants ofmelon eIF4E, a factor that controls virus susceptibility. BMC Plant Biology. 2007. 7 34.)，而利用EC0-TILLING技术克隆复杂性状相关的功能基因是目前需要克服的关键技术 难题。另外，人们也发展了一些分析方法试图解释复杂性状，从而将生物学标记与形态 性状联系起来。尽管这些技术手段能够从一些方面反映这些标记在自然状态中与某些形态 性状相关联，但这些标记目前多是基因组中随机存在的标记，到定位到具体的相关基因还 有相当长的距离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、低成本、快速克隆水稻复杂性状相关联基因的 方法。本发明人针对已经完成测序的基因组植物，利用EC0-TILLING分析方法，直接将 CEL I酶酶切后的产物在3%琼脂糖凝胶上电泳，其产生的多态性条带转化为遗传学标记， 并对自然群体的复杂性状进行连锁不平衡分析，来寻找并克隆与复杂性状相关的基因。为了实现本发明目的，本发明所述克隆水稻复杂性状相关基因的方法，其采用以 基因组序列已公开的水稻自然群体为基础，采集水稻品种间复杂性状数据，以这些材料的 DNA为模板在琼脂糖电泳上进行EC0-TILLING方法分析，将产生的多态性条带转化为遗传学 标记，然后利用关联分析软件进行连锁不平衡分析，确定与性状相关联的基因并克隆基因。本发明选择已经完成了基因组测序并已公开的水稻自然群体，能够方便地提取基 因组序列。所述复杂性数据是该植物在自然栽培条件下或人工模拟自然条件下所采集得到 的形态性状数据，如产量、品质、千粒重、花期、株高、穗长和抗旱性等，这些数据在个体间呈 连续分布。所述的EC0-TILLING方法是抽提自然群体中个体基因组DNA，根据基因组注释数 据下载各基因家族序列，将研究的目标基因家族设计引物进行PCR，然后以一个常规品种材 料为对照品种进行PCR产物两两混合，经过变性复性使双链杂交，最后使用芹菜汁中抽提 纯化后的CELI酶对错配产生的拱环进行酶切，产生不同大小的片段。所述的遗传学标记是经过CEL I酶酶切后产生的多态性条带。CEL I酶酶切后的产物在3%琼脂糖凝胶上电泳，其产生的多态性条带转化为遗传 学标记。由于自然群体中个体之间基因组序列有差异，EC0-TILLING方法就可以将这种差 异在琼脂糖电泳上表现出数量不同或大小不同的DNA条带。以对照材料为带型0，将产生的 不同类型的条带依次进行编号，作为后面分析用的标记，具体见图1。所述的关联分析软件是指按照连锁不平衡分析原理设计的软件，用来检测不同位 点等位基因间非随机连锁程度。水稻栽培品种主要有籼稻和粳稻两种亚型，其群体结构q 值为2，可以直接使用免费开放使用的软件有TASSEL软件(Http//www. maizeRenetics. net)禾口 EINGENSTART 软件(http //genepath. med. harvard, edu/ reich/Software. htm) 来分析与性状相关联的基因。本发明克隆基因采用本领域熟知的方法进行，例如Sambrook等编著的《分子克 隆实验室手册》(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。先抽提所采集性状材料的RNA，然后利用反转录试剂盒转换 成第一链cDNA，根据该基因的基因组注释数据设计引物，采用保真度高的DNA聚合酶以第 一链cDNA为模板将基因的全长扩增出来，从而得到该基因。实验证明，本发明的克隆水稻复杂性状相关联基因的方法，能够高效、低成本、快 速地发现与复杂性状关联的基因。传统使用的数量性状位点(QTL)作图方法克隆相关基 因，虽能够找到相关染色体区段，但仍需构建更大的遗传群体进行精细定位，并对相关单株 进行性状鉴定，精细定位后，还需对QTL区间候选基因逐个进行功能鉴定，工作量大，成本
4高，周期长。由于复杂性状由多个基因共同控制，每一个基因的效应较低，精细定位准确鉴 定单株十分困难。例如水稻的抗旱性鉴定，单个基因的替换常使水稻的抗旱性丧失。而利 用本发明的方法，只需要将自然群体中所收集的各种生态型的品种进行相关的形态性状的 调查，然后对不同基因家族进行EC0-TILLING分析，利用TASSEL和EINGENSTART软件分析 相关基因，并从相应的生态型品种中进行克隆。这样免去构建需要庞大工作量的遗传群体 和精细定位，也不用考虑遗传群体中单个个体的性状丢失，明显缩短基因克隆时间，降低成 本。本发明方法对加快植物复杂性状相关基因的克隆具有重要意义。本发明还可以对microRNA—类基因进行相关分析，发现该方法也完全适用于以 基因组序列为基础的非蛋白质编码基因的克隆和功能发现。本发明克隆水稻复杂性状相关联基因的方法也同样适用于其他农作物或植物的 复杂性状相关联基因的克隆。
图1为从芹菜汁中提取的CEL I酶在SDS-PAGE上电泳图。1，D2000标记；2_8，粗 提的CEL I酶稀释5倍后分别上样4-10 μ 1。图2为所收集的水稻抗旱品种的EC0-TILLING琼脂糖凝胶电泳结果。图2Α为CEL I酶切前PCR电泳结果，图2Β为CEL I酶切后电泳结果。图2Β下方的数字代表该带型所转 化的标记号。图3-1、3-2、3-3、3_4为所鉴定的4个与抗旱相关的基因在5个不同品种在干旱胁 迫处理后相对表达量结果。“前”表示未进行处理直接取样，“中”表示20% PEG 6000处理 3小时取样，“后”表示胁迫后复水8小时后取样抽提RNA，然后分别对这4个基因进行实时 荧光定量PCR。其中，242代表超级旱稻2-9，195代表SALAK，220代表顶30358，冊3代表沪 旱3号，Sl代表深水稻1。
具体实施例方式下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。下列实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下面实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1用本发明的方法克隆与水稻抗旱性相关联的基因水稻的抗旱性是典型的复杂性状，有多个基因控制并与环境协作，通过QTL定位 作图方法发现了 200多个位点控制水稻抗旱性。收集了国内外150份各种抗旱品种，在人 工抗旱鉴定设施上对这些品种进行抗旱性状的鉴定并克隆相关基因。1.水稻品种田间试验及性状调查表型试验在田间梯度水分鉴定岛上进行。所有供试品种种子(150种品种)浸种催 芽至露白后播种育秧，并按正常田间管理方式插秧，单行种植。采用随机区组设计，3重复， 种植2行，每行18株，按行株距20cmX 20cm种植。试验于5月沈日播种，6月23日移栽， 7月31号开始干旱胁迫，8月31号恢复灌水。考察基本农艺性状、抗旱指数和抗旱级别。
抗旱指数=(待测品种干旱胁迫处理产量/待测品种未干旱胁迫处理处 理)X (对照品种未干旱胁迫处理产量/对照品种胁迫处理产量)。其抗旱级别分为1-9 级，1级表示抗旱指数> 1. 30，3级为1. 00-1. 29，5级为0. 90-0. 99，7级为0. 70-0. 89，9级 为抗旱指数< 0. 69。2.水稻DNA抽提按照CTAB 法(Cetyl trie thy lammonium bromide)提取水稻叶片总 DNA。DNA 沉 淀物用lmol/L NaCl溶解，并用RNase A过夜处理；用95%乙醇、76%乙醇、95%乙醇依次 处理，纯化DNA ；TE溶解DNA，-20°C保存。对所选材料进行DNA浓度测定，并根据PCR反应 体系，统一稀释到约20ng/ul。3. CEL I酶的粗提试验用芹菜由超市购得。取芹菜鲜嫩茎，去根茎，洗净，擦干。榨汁机榨取芹菜汁 液并去除残渣，加入BufferA，2600g离心20min，弃沉淀。取上清缓慢加入固体(NH4) 2S04粉 末至浓度为25%，并轻轻搅拌30min，13000-16200g离心45min，弃沉淀。取上清缓慢加入 固体(NH4) 2S04粉末至浓度为80%，并轻轻搅拌30min，13000-16200g离心1. 5h，弃上清。加 入BufTerB并悬浮沉淀。BufferB透析过夜，前三次每隔Ih换一次透析液，最后一次透析过 夜。最后将提取物分装储存于_80°C备用。BufferA IOOmmo 1/L Tris-HCl, pH 7. 7，100 μ mol/L PMSF (苯甲基磺酰氟)。BufferB IOOmmol/L Tris-HCl, pH 7. 7,0. 5mol/L KC1，100 μ mol/LPMSF。4. EC0-TILLING技术的PCR反应体系及后期处理从水稻基因组数据库中下载转录因子AP2/EREBP、heat shocktranscription factor (HSF)、GROWTH-RE⑶LATING FACTOR(GRF)、Alfin-like、CCAAT-HAP3 和 ZIM 家族 220 个基因启动子序列，设计并合成引物。其20yL PCR反应体系2yL 10X反应缓冲液，IyL 2匪ol/μ LdNTP混和液， 1 μ L 10ymol/y L F 弓丨物，1 μ LlO μ mol/μ L R 弓丨物，IU ExTaq(购自 Takara 公司)DNA 聚 合酶，4 μ L 20ng/ul DNA 模板，11 μ LddH2O。PCR 扩增程序-MV 4min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin ； 10°C保存。扩增时根据不同引物的Tm值调节退火温度，扩增反应在Hykiid MBS 0. 2S PCR 仪上进行。对照品种为日本晴，与其它品种两两混合。杂交程序95°C IOmin ；95°C降至 850C (-20C /s) ；85°C 降至 25°C (_0. 1°C /s) ；10°C保存。杂交反应在 Hykiid MBS 0. 2S PCR 仪上进行。CEL I酶切体系及反应条件10 μ L杂交PCR产物，3 μ L 10Χ反应缓冲液 (IOOmmol/L Tris-HCl,pH 7. 7,0. 5mol/L KCl)，1 μ L CEL 1,16μ L ddH20。混勻后置于PCR 仪中45°C反应30min。扩增产物用3%琼脂糖凝胶分离。5. EC0-TASSEL分析与抗旱相关联基因将电泳分离开的电泳条带按照各种带型进行统计，带型统计方法按照图2所 示，对每一个品种进行标记，然后将这些数据和抗旱级别数据按照TASSEL(Http://WWW. maizegenetics. net)软件要求输入，分别对转录因子 AP2/EREBP、HSF、GRF、Alfin-like, CCAAT-HAP3和ZIM家族220个基因启动子多态性进行关联分析，以P < 0. 001为显著相关，具体结果见表1。表1干旱处理下转录因子启动子与抗旱性状的关联分析结果
权利要求
1.一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法，其特征在于，其采用以基因组序列已公 开的水稻自然群体为基础，采集水稻品种间复杂性状数据，以这些材料的DNA为模板在琼 脂糖电泳上进行EC0-TILLING方法分析，将产生的多态性条带转化为遗传学标记，然后利 用关联分析软件进行连锁不平衡分析，确定与性状相关联的基因并克隆基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的EC0-TILLING方法是抽提自然群体 中个体基因组DNA，根据基因组注释数据下载各基因家族序列，将研究的目标基因家族设计 引物进行PCR，然后以一个常规品种材料为对照品种，进行PCR产物两两混合，经过变性复 性使双链杂交，最后使用芹菜汁中抽提纯化后的CEL I酶对错配产生的拱环进行酶切，产生 不同大小的片段。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述的遗传学标记是经过CELI酶酶切 后产生的多态性条带。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，CELI酶酶切后在3%琼脂糖凝胶上进行电泳。
5.根据权利要求1-4任意一项所述方法，其特征在于，所述复杂性数据是在自然栽培 条件下或人工模拟自然条件下所采集得到的形态性状数据产量、品质、千粒重、花期、株 高、穗长和抗旱性，这些数据在个体间呈连续分布。
6.根据权利要求1-5任意一项所述方法，其特征在于，所述的关联分析软件为TASSEL 软件和EINGENSTART软件。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述对照品种采用水稻日本晴。
全文摘要
本发明提供了一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法。其采用以基因组序列已公开的水稻自然群体为基础，采集水稻品种间复杂性状数据，以这些材料的DNA为模板在琼脂糖电泳上进行ECO-TILLING方法分析，将产生的多态性条带转化为遗传学标记，然后利用关联分析软件进行连锁不平衡分析，确定与性状相关联的基因并克隆基因。本发明的克隆水稻复杂性状相关基因的方法，能够高效、低成本、快速地发现与复杂性状关联的基因。本发明的方法对加快植物复杂性状相关基因的克隆具有重要意义。
文档编号C12N15/10GK102094001SQ200910200208
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者余舜武, 吴金红, 廖凤贤, 罗利军, 黎佳佳 申请人:上海市农业生物基因中心