专利名称：来源于人苍白杆菌的epsp合酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属微生物基因工程领域，具体涉及一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基 因及其应用。
背景技术：
草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，广泛用于果园、胶园、非耕地、 免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。1974年在美国注册登记 以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种之一。但是 该除草剂同样是一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用。为在农业生产中使用 草甘膦，必须培育出具有草甘膦抗性或者降解性的农作物。草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate)毒性作用机理是竞争性抑制 莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(简称EPSP合成酶)的活性。EPSP合 成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成过程 中的一个关键酶，该酶由aroA基因编码，目前使用的有潜在的生物安全性问题。目前种植抗除草剂转基因作物的国家越来越多，面积也迅速增加，种植面积不断 扩大，占全球种植转基因作物的78%以上。根据2002年资料表明，耐草甘膦大豆依旧是美 国、阿根廷、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、乌拉圭和南非等七国的主要商品化转基因农作物。 耐草甘膦除草剂大豆在全球范围内种植3650万公顷，占全球总转基因农作物种植面积的 62%。然而现在主要研究的抗草甘膦基因主要是I型的，因而发掘新型的II类的EPSP合 成酶基因将是必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及 其应用，并对该基因进行功能验证，以证明它具有相对较高的草甘膦耐受性。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其 编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。所述来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因长3100bp，含1353个碱基，编码的氨基酸 451 个。所述来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因应用于草甘膦耐受性中。所述来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因采用人工方法合成，具体包括以下步骤1)抗草甘膦菌株的筛选采集草甘膦频繁使用果园地里土壤中的样品，用0. 9% (w/v)氯化钠溶液混合，之 后将样品涂布于含有60mM草甘膦的LB固体培养基中培养Mh。将长出来的菌株再次涂布 于含有200mM草甘膦LB固体培养基中培养Mh，最后将仅有的一个生长很好的菌株挑选出 来进行进一步研究。
2)菌株总DNA的提取及鉴定将分离获得的细菌单株在IOml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl, IOg/ L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH = 7. 5)中培养过夜(16小时)，菌体培养液以60001 重力加速 度离心5min，得到菌体沉淀。这些沉淀在_20°C下冷冻lh。之后使用TE(10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 8.0)溶液清洗一次。加入浓度为10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的无菌 水悬浮，在37°C下摇床培养Ih。加入0. 5M EDTA, 10% (w/v) SDS和浓度为5M的NaCl轻轻 振荡混勻。再加入浓度为20mg/mL蛋白激K(Takara日本)，反应物在37°C下培养lh。用与 培养菌液液体体积相当1倍体积的苯酚氯仿异戊醇05 24 1)提取DNA。水相用 与相当水相体积1/2倍体积的氯仿异戊醇04 1)萃取。振荡混勻后离心5min。水相 中加入与水相体积相当(倍体积的异戊醇。振荡混勻后离心15min。取沉淀，用70% (ν/ν) 酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA储存于4°C下备用。以 16SR(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)禾口16SF(5，-ACGGCTACCT TGTTACGACTTC-3，)为扩增引物，以菌株的 DNA 为模板进行 16S rDNA的PCR扩增。随后对PCR产物进行凝胶回收，克隆和测序。3)基因组文库的构建菌株DNA用Sau3A I酶切，经琼脂糖凝胶回收2-41ADNA片断备用。此片断经过末 端去磷酸化连接到同样去磷酸化的PACYC184质粒载体。上述连接产物转入E. coli DH5 α 电击感受态细胞，涂布与LB固体培养基，37°C下培养24h后进行质粒大抽。这样就构建成 了包含有目的基因的基因组文库。4)筛选草甘膦抗性转化子将大抽质粒转入大肠杆菌ER2799 (NEB公司)分别涂布与含有50、100、150mM草甘 膦的LB固体培养基中培养48h，发现有一个菌落能在含有150mM草甘膦的LB固体培养基上 生长，对其进行测序。5)草甘膦耐受试验及蛋白表达纯化以 Pl (5，-gagagaggatccatgtcccattctgcatc-3，)和P2(5，-gagctctcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3，)为弓丨物，以 ρAroA-O. anthropi 为 模板进行EPSP合酶基因AroA-O. anthropi的PCR扩增。PCR产物经BamH I和Mc I酶切 后连接如同样经BamH I and Sac I酶切的pYPX251载体。将大肠杆菌ER2799，ER2799 (携带 p251-AroA_0. anthropi 质粒)及 ER2799 (携带 p251-AroA-E. coli质粒)接种到含0_150mM草甘膦的M9液体培养基上进行耐受性试验。以 P5(5， -gagagaccatggatgtcccattctgcatc-3，)和P6(5，-gtctcgagtcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3，)为弓丨物，以人工合成的 EPSP 基 因的阳性克隆为模板进行EPSP合酶基因的PCR扩增。PCR产物经Nco I和)(h0 I酶切后连 接入同样经Nco I和Bio I酶切的ρΕΤ48ει载体(Novagen公司)。然后将此质粒转入大肠 杆菌 BL21(DE3) (Novagen 公司)，转化子用 HisTrap HP kit (Amersham Biosciences)试剂 盒进行蛋白表达纯化，并进行EPSP酶活测定和动力学参数的测定。本发明的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保 持着与PEP较强的亲和性，这些特征将为用于转基因作物的培育提供可能。
图1为本发明的EPSP合酶的草甘膦耐受性实验结果，其中A代表在草甘膦浓度为OmM时大肠杆菌(Escherichia coli) ER2799 (携带 p251-AroA-O. anthropi 质粒)、ER2799 (携带 p251-AroA_E. coli 质粒)和大肠杆菌 ER2799 生长情况；B代表在草甘膦浓度为50mM时大肠杆菌ER2799 (携带p251-AroA_0. anthropi质 粒)、ER2799 (携带p251-AroA-E. coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况；C代表在草甘膦浓度为IOOmM时大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-O. anthropi质 粒)、ER2799 (携带p251-AroA-E. coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况；D代表在草甘膦浓度为150mM时大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA-0. anthropi质 粒)、ER2799 (携带p251-AroA-E. coli质粒)和大肠杆菌ER2799生长情况。图2为本发明的EPSP合酶与I型的来自于大肠杆菌的EPSP合酶和II型的来自 于农杆菌CP4的EPSP合酶的氨基酸序列的比较。图3为本发明的EPSP合酶与典型的I型和II型EPSP合酶的系统发育比较结果。图4为本发明的EPSP合酶3D结构及其与来自于农杆菌CP4的EPSP合成酶的3D 结构的比较。图5为本发明的EPSP合酶的SDS-PAGE电泳图，其中的1代表用HiS1TrapHP试剂 盒纯化的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶蛋白；2代表在大肠杆菌BL21(DE!3)过量表达的来 源于人苍白杆菌的EPSP合酶蛋白、3代表蛋白分子量MARKER。
具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案 而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范 围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨 姆布鲁克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)实施例1高耐受草甘膦的DNA片断克隆1、草甘膦频繁使用水稻地里土壤样品的采集从一年至少使用四次并且连续使用十年以上的果园的土壤中采集土壤样品。2、抗草甘膦菌株的筛选称取草甘膦频繁使用果园土壤样品lg，加入0.9% (w/v)氯化钠溶液lml，5000转 /分震荡混勻，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0. 9% (w/v)氯化钠溶液1ml，5000转 /分震荡混勻，冰上IOmin静置，吸取150 μ 1溶液涂布与含有60mM草甘膦的LB固体培养基 中培养Mh。将长出来的单菌落接种与加入1.6mlLB液体培养基的试管中培养48h， 然后吸取150 μ 1的培养液再次涂布与含有200mM草甘膦的LB固体培养基中培养Mh，最后 将仅有的一个生长良好的菌落人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)选出来进行进一步研究。3、菌株总DNA的提取及鉴定将实施例2中分离获得的细菌单株在IOml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/ L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH= 7. 5)中培养16h，菌体培养液以6000转/分速度 离心5min，得到菌体沉淀。这些沉淀在_20°C下冷冻lh。之后使用TE(10mM Tris_HCl，lmM EDTA，pH = 8. 0)溶液清洗一次。加入含有20 μ 1浓度为10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich) 的无菌水悬浮，在37°C下摇床培养lh。加入50 μ L 0. 5Μ EDTA, 50 μ 1 10% (w/v) SDS和 50 μ 1浓度为5Μ的NaCl轻轻振荡混勻。再加入10 μ 1浓度为20mg/mL蛋白激K (Takara日 本)，反应物在37°C下培养lh。用与培养菌液液体体积相当1倍体积的苯酚氯仿异戊 醇05 24 1)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2倍体积的氯仿异戊醇Q4 1) 萃取。振荡混勻后离心5min。水相中加入与水相体积相当1倍体积的异戊醇。振荡混勻后 离心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得 总DNA储存于4°C下备用。以抽提的总DNA为模板，利用人苍白杆菌的16sRNA特异性引物进行扩增。扩增的 引物为 16SR(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 16SF(5，_ACGGCTACCT TGTTACGACTTC-3，)。 以KOD Plus (Toyobo日本)为TaqDNA聚合酶，扩增条件依次为94 "C 30s, 55 "C 30s， 72°C 120s，扩增30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶(大连宝生物工程公司)，72°C 延伸90s，扩增片段长1500bp。PCR结束后，(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10 μ 1直接与T/ A克隆载体相连(大连宝生物工程公司)，4°C连接过夜。再将该载体转化入DH5 α感受态 中。利用ABI Prism Big Dye的ΑΒΙ3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast 程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与人苍白杆菌中的16s rRNA有99 %的 同源性，从而证实分离菌株为人苍白杆菌。4、人苍白杆菌基因组文库的构建人苍白杆菌DNA用Sau3A I酶切在10 μ 1反应体系进行部分酶切试验，Sau3A I 酶按 1 100 稀释，37 °C 分别酶切 lOmin，20min, 30min, 40min, 50min, 60min 后加入 10X loading buffer 1 μ 1终止反应，电泳检测最适酶切反应时间。而后选择相同的体系 酶切30min进行大量酶切。经0. 7% (w/v)琼脂糖凝胶电泳后，切下长度为2-41Λ的DNA 片段，用凝胶试剂盒(上海生物工程公司)回收。质粒载体pACYC184(NEB公司)用BamHI 完全酶切后SAP碱性磷酸酯酶进行末端去磷酸化，以减少载体自连。上述回收后的菌株 DNA(200ng)和末端去磷酸化的质粒载体pACYC184 (150ng)用2U的T41igase在4°C下连接 16h。连接产物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇离心洗涤，最后用10 μ 1的超纯水 溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，电击参数为电脉冲为2. 5 μ F， 电压2. 5kV，电阻200 Ω，电击时间为4. 5. S。复苏后，将菌液涂布于LB (含有50 μ g/mL氨苄 青霉素)平板上，37°C培养12-1他。而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行 质粒提取。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。5、筛选草甘膦抗性转化子将大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799 (NEB公司)涂布与含有50mM草甘膦的M9 平板上培养48h，发现有三个菌落生长良好。将这三个菌落分别接种到含有100mM、150mM草甘膦的M9平板上培养，发现只有1个克隆能在含150mM草甘膦的M9平板上生长，其所含 的质粒命名为pAroA-0. anthropi,即本发明的EPSP合酶。从该克隆抽提的质粒pAroA-0. anthropi再次转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)中，将转化子用无菌牙签点与含150mM草甘 膦的M9固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性， 表明抗草甘膦特性确实是由于转入本发明的pAroA-0. anthropi EPSP合酶引起的。6、草甘膦耐受实验以 Pl (5，-gagagaggatccatgtcccattctgcatc-3，)和P2(5，-gagctctcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3，)为弓丨物，以 pAroA-0. anthropi 为 模板进行EPSP合酶基因AroA-O. anthropi的PCR扩增。以KOD Plus (Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s，扩增30个循环。循环结束后， 加入2U的rtaq酶(大连宝生物工程公司)，72°C延伸90s，扩增片段长1353bp (如下)。选 择pG251 (CN1338515NCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamH I (大连宝生物工程公 司)酶切并进行胶回收。对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱 性磷酸酶进行失活操作后Sambrook分子克隆手册1989，再与外源的DNA片段(即长度 为1353bp的EPSP合酶基因AroA-0. anthropi)连接。连接前，将回收的部分酶解的细菌基 因组DNA片段与pG251载体DNA，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源 DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16°C，连接时间为10-1池。再将该载体转化 入DH5a感受态中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，确定 重组质粒即(p251-AroA-0. anthropi)的正确性。采用同样的方法用以下引物P3 (5，-CGGGATCCGTTAATGCCGAAATTTTGCTTAATC-3，)禾口P4 (5，-CGGAGCTCAGGTCC GAAAAAAAACGCCGAC-3，)扩增大肠杆菌的EPSP合酶基因AroA-E. coli,同样连接到pG251得到 p251-AroA-E. coli 重组质粒。将大肠杆菌ER2799(携带 p251-AroA_0. anthropi 质粒)和 ER2799 (携带 p251-AroA-E. coli质粒)接种到含0_150mM草甘膦的M9液体培养基中，经过37°C、3Mi的 摇床培养后，测定培养物的0D660进行耐受性试验，同时以无插入片断的质粒的大肠杆菌 ER2799为阴性对照。结果将大肠杆菌ER2799(携带p251-AroA_0. anthropi质粒)和ER2799(携带 p251-AroA-E. coli质粒)接种到含0_150mM草甘膦的M9液体培养基中，经过37°C、3他的摇 床培养后，发现阴性对照在M9中几乎不能生长；而ER2799 (携带p251-AroA_E. coli质粒) 在50mM草甘膦的M9液体培养基中严重受到抑制；而ER2799 (携带p251-AroA-O. anthropi 质粒)在含有150mM草甘膦的M9液体培养基中还能生长(参见图1)。实施例2高耐受草甘膦的DNA片断的序列分析及EPSP合酶功能验证1、高耐受草甘膦的DNA片断的序列分析利用逐步序列测定方法对实施例1中所筛选获得的高耐受草甘膦质粒pAroA-0. anthropi，即本发明的EPSP合酶基因全序列进行DNA测序。分析结果表明插入的片断大 小为3100bp，其中包含了一个1353的阅读框，其序列如SEQID NO 1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1353个碱基，编码的氨基酸451个，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。氨基酸序列同源性分析结果表明AroA-0. anthropi氨基酸序列与II型的来自 于农杆菌CP4的EPSP合酶有82. 89%的同源性(参见图2)，而与I型的来自于大肠杆菌 的EPSP合酶的同源性不足30%，说明AroA-O. anthropi EPSP合酶属于II的EPSP合酶。 AroA-O. anthropi EPSP合酶与典型的I型和II型EPSP合酶的系统发育比较结果参见图 3。用在线软件Swiss-model对AroA-O. anthropi EPSP合酶进行3D结构预测(参 见图4)，结果表明其3D结构与来自于农杆菌CP4的EPSP合酶的3D结构非常相似。但是 它们之间有一个区域存在着非常明显的氨基酸差异，这个区域位于高度保守的Glu-3M和 Arg-357附近。Glu-3M和Arg-357是一个由12个氨基酸0347-358)组成的一个环的一部 分，这个环不但影响着PEP或者glyphosate结合，而且影响着这个球状结构从“开放”到“关 闭”状态。实施例3高耐受草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成以基因合成方法Nucleic Acids Research，2004，32，e98将上述高耐受草甘膦 的EPSP合酶基因克隆。设计的引物如下1. AroA-I :Tm = 54，60merATG，TCC，CAT, TCT，GCA，TCC，CCG，AAA, CCA，GCA，ACC，GCC，CGC，CGG，TCG，GAG， GCA，CTT，ACG，GGC2. AroA-2 :Tm = 54，60merACG，ATG，CGA，GAT，GGA，TTT，GTC，ACC，CGG，AAT，GCG，AAT，TTC，GCC，CGT，AAG， TGC, CTC, CGA, GCG3. AroA-3 :Tm = 54，60merGAC, AAA, TCC, ATC, TCG, CAT, CGT, TCC, TTC, ATG, TTC, GGC, GGC, CTT, GCA, TCG, GGT，GAA，ACC，CGC4. AroA-4 : Tm = 54，60merGGT，ATT，GAT，GAC，GTC，TTC，GCC，TTC，CAG，AAG，GCC，GGT，GAT，GCG，GGT，TTC， ACC，CGA，TGC，AAG5. AroA-5 :Tm = 54，60merGGC, GAA, GAC, GTC, ATC, AAT, ACC, GGT, CGC, GCC, ATG, CAG, GCC, ATG, GGC, GCG, AAA, ATC，CGC，AAG6. AroA-6 :Tm = 54，60merGCC，GTT，GCC，GAC，GCC，ATT，GAT，GAT，CCA，GGC，ATC，GCC，ATC，CTT，GCG，GAT， TTT，CGC，GCC，CAT7. AroA-7 :Tm = 54，60merATC，AAT，GGC，GTC，GGC，AAC，GGC，TGC，CTG，TTG，CAG，CCC，GAA，GCA，GCG，CTC， GAC，TTC，GGC，AAT8. AroA-8 :Tm = 54，60merGCC，GAC，AAG，GCC，CAT, GGT，GAG, GCG，CGC，ACC，GGT，TCC，GGC，ATT，GCC，GAA，
8GTC, GAG, CGC, TGC9. AroA-9 :Tm = 54，60merCTC，ACC，ATG，GGC，CTT，GTC，GGC，ACC，TAT，GAC，ATG，AGA，ACC，TCC，TTT，ATC， GGC, GAT, GCC, TCG10. AroA-IO :Tm = 54，60merCAA，CGG，GTT，CAG，CAC，GCG，ACC，CAT, CGG，GCG，CTT，GGA，AAG，CGA，GGC，ATC， GCC，GAT，AAA, GGA11. AroA-11 : Tm = 54，60merGGT，CGC，GTG，CTG，AAC，CCG，TTG，CGT，GAA，ATG，GGC，GTT，CAG，GTG，GAA，GCA， GCC, GAA, GGC, GAC12. AroA-12 :Tm = 54，60merATT，GGC，CGT，CTT，GGG，GCC，GAT，CAG，CGT，CAG，CGG，CAT, GCG，GTC，GCC，TTC， GGC, TGC, TTC, CAC13. AroA-13 :Tm = 54，60merATC, GGC, CCC, AAG, ACG, GCC, AAT, CCG, ATC, ACC, TAT, CGC, GTG, CCG, ATG, GCA, TCC，GCA，CAG，GTC14. AroA-14 :Tm = 54，60merGCC，CGG，CGT，GTT，GAG, ACC，GGC，GAG, CAG，CAC，GGC，GGA，TTT，GAC，CTG，TG C, GGA, TGC, CAT, CGG15. AroA-15 :Tm = 54,60merGCC, GGT, CTC, AAC, ACG, CCG, GGC, GTT, ACC, ACC, GTC, ATC, GAG, CCG, GTC, ATG, ACC，CGC，GAC，CAC16. AroA-16 :Tm = 54,60merCGA，AAG，ATC，GGC，GCC，AAA, GCC，CTG，CAG，CAT, CTT，TTC，GGT，GTG，GTC，GCG， GGT，CAT, GAC，CGG17. AroA-17 :Tm = 54,60merGGC，TTT，GGC，GCC，GAT，CTT，TCG，GTT，GAA，ACC，GAC，AAG，GAC，GGC，GTG，CGC， CAT, ATC，CGC，ATC18. AroA-18 :Tm = 54,60merTAC，GTC，GAT，GGT，CTG，GCC，GAT，AAG，CTT，GCC，CTG，TCC，GGT，GAT，GCG，GAT， ATG，GCG，CAC，GCC19. AroA-19 :Tm = 54,60merATC，GGC，CAG，ACC，ATC，GAC，GTA，CCG，GGT，GAT，CCA，TCG，TCA，ACG，GCT，TTC， CCG，CTC，GTT，GCC20. AroA-20 :Tm = 54,60merGTT, GCG, GAT, GGT, AAC, ATC, CGA, ACC, TTC, GAC, CAG, AAG, GGC, GGC, AAC, GAG, CGG，GAA，AGC，CGT21. AroA-21 : Tm = 54，60merTCG，GAT，GTT，ACC，ATC，CGC，AAC，GTG，CTG，ATG，AAC，CCG，ACC，CGT，ACC，GGC，CTG, ATC, CTG, ACG22. AroA-22 :Tm = 54,60merGGC, ATT, GAG, CAC, TTC, GAT, ATC, GGC, GCC, CAT, TTC, CTG, CAA, CGT, CAG, GAT, CAG，GCC，GGT，ACG23. AroA-23 :Tm = 54，60merGAT, ATC, GAA, GTG, CTC, AAT, GCC, CGT, CTT, GCC, GGC, GGC, GAG, GAT, GTC, GCC, GAT, CTG, CGC, GTG24. AroA-24 : Tm = 54，60merTTC, CGG, CGG, AAC, GAC, AAC, GCC, CTT, CAG, CTT, CGA, GGC, CTT, CAC, GCG, CAG, ATC，GGC，GAC，ATC25. AroA-25 :Tm = 54，60merGGC, GTT, GTC, GTT, CCG, CCG, GAA, CGC, GCT, CCG, TCG, ATG, ATC, GAT, GAA, TAT, CCG，GTT，CTG，GCC26. AroA-26 :Tm = 54，60merGTC, CAT, CAC, GGT, TTC, GCC, TTC, CGC, GAA, GGA, CGC, GGC, GAT, GGC, CAG, AAC， CGG，ATA，TTC，ATC27. AroA-27 :Tm = 54，60merGAA，GGC，GAA，ACC，GTG，ATG，GAC，GGT，CTC，GAC，GAA，CTG，CGC，GTC，AAG，GAA， TCG, GAT, CGT, CTG28. AroA-28 :Tm = 54，60merATC，GAC，GCC，ATT，GGC，TTC，AAG，GCC，GCG，TGC，AAC，CGC，TGC，CAG，ACG，ATC， CGA，TTC，CTT，GAC29. AroA-29 :Tm = 54，60merCTT，GAA，GCC，AAT，GGC，GTC，GAT，TGC，ACC，GAA，GGC，GAG, ATG，TCG，CTG，ACG， GTC, CGT, GGT, CGC30. AroA-30 :Tm = 54，60merGGT, TGC, GAC, TGT, GCC, ACC, GCC, CAG, TCC, CTT, GCC, GTC, GGG, GCG, ACC, ACG, GAC，CGT，CAG，CGA31. AroA-31 : Tm = 54，60merGGC，GGT，GGC，ACA，GTC，GCA，ACC，CAT, CTC，GAT，CAC，CGC，ATC，GCG，ATG，AGC， TTC，CTC，GTC，ATG32. AroA-32 :Tm = 54，60merGCT, GTC, GTC, AAC, CGT, CAC, CGG, CTT, TTC, CGA, TGC, AAG, GCC, CAT, GAC, GAG, GAA, GCT, CAT, CGC33. AroA-33 :Tm = 54，60merCCG，GTG，ACG，GTT，GAC，GAC，AGC，ACC，ATG，ATC，GCC，ACG，TCC，TTC，CCC，GAA， TTC，ATG，GAC，ATG34. AroA-34 : Tm = 54，34merTCA，GTC，CCG，GCA，TCA，TGT，CCA，TGA，ATT，CGG，GGA，A
利用PCR进行EPSP合酶基因扩增，在100 μ 1反应体系中，AroA-2-AroA_33共32 个引物的添加量为2ng，外侧引物AroA-I和AroA_34添加量为30ng，扩增条件为94°C预热 Imin ;94°C，30s，50°C，30s，72°C，2min，使用的 Taq DNA 聚合酶为 KOD FX taq 酶 CToyobo 公 司，日本)，共25个循环。 PCR结束后，1 %琼脂糖胶回收，取10 μ 1直接与Τ/Α克隆载体相连(大连宝生物公 司)。4°C连接过夜，高效转化DH5ci感受态中。获得阳性克隆。实施例4高耐受草甘膦的EPSP表达上述人工合成的EPSP基因的阳性克隆用引物P5 (5，-gagagaccatggatgtcccatt ctgcatc-3，)禾口 P6(5，-gtctcgagtcatcgcgcgtcgctcagttcgat-3，)进行 PCR 扩增，以 KOD Plus (Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为:94°C 30s，55°C 30s，72°C 90s，扩增 30个循环。循环结束后，加入2U的rtaq酶(大连宝生物工程公司)，72°C延伸90s，扩增片 段长1353bp。PCR产物用Nco I and Xho I酶切后，连入相同酶切的载体pET48a(NEB公 司)得到重组质粒pET-AroA-0. anthropi并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3) (Novagen公司)， 将转化子涂布在LB固体培养基中培养24h。用凝胶-蛋白纯化试剂盒Hi sTrap HP (Amersham Biosciences公司)对其进行蛋白表达纯化，SDS-PAGE电泳检测。经SDS-PAGE电泳检测， 蛋白大小约48kDa，与预测值相符(参见图5)。实施例5EPSP酶活测定和动力学参数的测定1.测定方法无机磷标准曲线IOmM无机磷按1 10稀释，分别取O、1、2、3……20μ1与1.5ml Eppendorf离心管中，加入纯水至100 μ 1混勻，加入MAT溶液0. 8ml混勻，计时三分钟后加 入SC溶液100 μ 1迅速混勻，室温静置20min后测定0D660值。重复三次。以无机磷浓度 为横坐标，0D660值为总纵坐标作图得到无机磷标准曲线。1)酶活测定蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法(Bradford，1976)。在冰上 与1.5ml Eppendorf离心管中加入以下溶液IOmM PEP溶液2 μ 1，10mMS3P溶液2 μ 1，0. 5M HEPES 溶液 2 μ 1，ImM(NH4)6MO7O24 · 4Η20 溶液 2 μ 1 和双蒸水 12 μ 1 混勻，与 28°C温浴 5min 后各管样品间隔2s加入5μ 1纯化蛋白并计时，2min后再间隔2s依次加入200 μ 1 MAT溶 液，显色:3min后再间隔2s依次加入20 μ 1 34% SC溶液迅速混勻，室温显色20min后测定 0D660值。对照除不加纯化蛋白外，其余同样品管。样品管与对照管的0D660值相减后，对 照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得 到酶的酶活力(nkat/mg)。2)半抑制量(IC50)测定上述反应液中添加OUOAlO^lO^lUOUOOjOOmM草 甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度(nkat/mg)为Y 轴作图。3) Km (PEP)测定将S3P溶液浓度恒定于ImM，在不同PEP浓度(0. 05、 0. 067,0. 1,0. 2,0. 5,1. OmM)下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V_v/[S] (Eadic-Hofstee)法作图。4) K^glyphosate)测定在不同草甘膦浓度(O、10、50、100 μ M)下测定PEP浓度为0. 05,0. 067,0. 1,0. 2,0. 5,1. OmM时EPSP的酶反应速度。采取双倒数作图，得到1/V_1/[S] 直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦的浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线 与X轴的交点即为Kjglyphosate)值。2.测定结果本发明的EPSP合酶活性为84. 52士0. 12nkat/mg，其动力学参数如下表1所示。表1本发明的EPSP合酶的动力学参数
—~ 动力学参数测定值
IC50 (glyphosate； mM) 0.8638 ±0.007^(PEP； mM)_0.43±0.11
K1 (glyphosate； μΜ)_121.34±8.8
K/Km_0,307 ±0.099根据该动力学参数可知本发明的EPSP合酶不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还 保持着与PEP较强的亲和性，这些特性为将本发明的EPSP合酶用于转基因作物的培育提供 了可能。附本申请中所涉及到的核苷酸/氨基酸序列表<110>上海市农业科学院<120>来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其应用<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>SEQ ID No 1<211>1353<212>DNA<213> 人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)<400>ATGTCCCATTCTGCATCCCCGAAACCAGCAACCGCCCGCCGCTCGGAGGCACTTACGGGC60
GAAATTCGCATTCCGGGTGACAAATCCATCTCGCATCGTTCCTTCATGTTCGGCGGCCTT120
GCATCGGGTGAAACCCGCATCACCGGCCTTCTGGAAGGCGAAGACGTCATCAATACCGGT180
CGCGCCATGCAGGCCATGGGCGCGAAAATCCGCAAGGATGGCGATGCCTGGATCATCAAT240
GGCGTCGGCAACGGCTGCCTGTTGCAGCCCGAAGCAGCGCTCGACTTCGGCAATGCCGGA300
ACCGGTGCGCGCCTCACCATGGGCCTTGTCGGCACCTATGACATGAGAACCTCCTTTATC360
GGCGATGCCTCGCTTTCCAAGCGCCCGATGGGTCGCGTGCTGAACCCGTTGCGTGAAATG420
GGCGTTCAGGTGGAAGCAGCCGAAGGCGACCGCATGCCGCTGACGCTGATCGGCCCCAAG480
ACGGCCAATCCGATCACCTATCGCGTGCCGATGGCATCCGCACAGGTCAAATCCGCCGTG540
CTGCTCGCCGGTCTCAACACGCCGGGCGTTACCACCGTCATCGAGCCGGTCATGACCCGC600
GACCACACCGAAAAGATGCTGCAGGGCTTTGGCGCCGATCTTTCG GTTGAAACCGACAAG660
GACGGCGTGCGCCATATCCGCATCACCGGACAGGGCAAGCTTATC GGCCAGACCATCGAC720
GTACCGGGTGATCCATCGTCAACGGCTTTCCCGCTCGTTGCCGCC CTTCTGGTCGAAGGT780
TCGGATGTTACCATCCGCAACGTGCTGATGAACCCGACCCGTACC GGCCTGATCCTGACG840
TTGCA GGAAA TGGGCGCCGATATCG AAGTG CTCAA TGCCC GTCTT GCCGG CGGCG AGGAT 900
GTCGC CGATC TGCGCGTGAAGGCCT CGAAGCTGAAGGGCG TTGTC GTTCC GCCGG AACGC960
GCTCC GTOGA TGATCGATGAATATC CGGTTCTGGCCATCG CCGCG TCCTT’ CGCGG AAGGC1020
GAAAC CGTGA TGGACGGTCTCGACG AACTGOGCGTCAAGG AATCG GATOG TCTGG CAGCG1080
GTTGC ACGCG GCCTTGAAGCCAATG GCGTCGATTGCACCG AAGGC GAGAT GTCGC TGACG1140
GTCCG TGGTC GCCCCGACGGCAAGG GACTGGGCGGTGGCA CAGTC GCAAC CCATC TCGAT1200
CACCG CATCG CGATGAGCTTCCTCG TCATGGGCCTTGCAT CGGAA AAGCC GGTGA CGGTT1260
GACGA CAGCA CCATGATCGCCACGT CCTTCCCCGA ATTCA TGGAC ATGAT GCCGG GACTG1320
GGCGC CAAGA TCGAACTGAGCGACG CGCGATGA1353
<210>SEQID No 2
<211>451
<212>PRT
<213>人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)
<400>
1METSerHisSerAlaSerProLysProAlaThrAlaArgArgSerGluAla LeuThrGly
21GlulieArglieProGlyAspLysSerlieSerHisArgSerPheMETPhe GlyGlyLeu
41AlaSerGlyGluThrArglieThrGlyLeuLeuGluGlyGluAspVallie AsnThrGly
61ArgAlaMETGlnAlaMETGlyAlaLyslieArgLysAspGlyAspAlaTrp lielieAsn
81GlyValGlyAsnGlyCysLeuLeuGlnProGluAlaAlaLeuAspPheGly AsnAlaGly
101ThrGlyAlaArgLeuThrMETGlyLeuValGlyThrTyrAspMETArgThr SerPhelie
121GlyAspAlaSerLeuSerLysArgProMETGlyArgValLeuAsnProLeu ArgGluMET
141GlyValGlnValGluAlaAlaGluGlyAspArgMETProLeuThrLeulie GlyProLys
161ThrAlaAsnProlieThrTyrArgValProMETAlaSerAlaGlnValLys SerAlaVal
181LeuLeuAlaGlyLeuAsnThrProGlyValThrThrVallieGluProVal METThrArg
201AspHisThrGluLysMETLeuGlnGlyPheGlyAlaAspLeuSerValGlu ThrAspLys
221AspGlyValArgHislieArglieThrGlyGlnGlyLysLeulieGlyGln ThrlieAsp
241ValProGlyAspProSerSerThrAlaPheProLeuValAlaAlaLeuLeu ValGluGly
261SerAspValThrlieArgAsnValLeuMETAsnProThrArgThrGlyLeu lieLeuThr
281LeuGlnGluMETGlyAlaAsplieGluValLeuAsnAlaArgLeuAlaGly GlyGluAsp
301ValAlaAspLeuArgValLysAlaSerLysLeuLysGlyValValValPro ProGluArg
321AlaProSerMETlieAspGluTyrProValLeuAlalieAlaAlaSerPhe AlaGluGly
341GluThrValMETAspGlyLeuAspGluLeu ArgValLysGluSerAspArg LeuAlaAla
361ValAlaArgGlyLeuGluAlaAsnGlyValAspCysThrGluGlyGluMET SerLeuThr
381ValArgGlyArgProAspGlyLysGlyLeuGlyGlyGlyThrValAlaThr HisLeuAsp
401HisArglieAlaMETSerPheLeuValMETGlyLeuAlaSerGluLysPro ValThrVal
421AspAspSerThrMETlieAlaThrSerPheProGluPheMETAspMETMET ProGlyLeu
441Gly AlaLyslieGluLeuSer Asp Ala Arg -
权利要求
1.一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根据权利要求1所述的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因，其特征在于，其编码的 蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.根据权利要求1或2所述的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因采用人工方法制备 而成。
4.根据权利要求1或2所述的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因在草甘膦耐受性中 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其应用，所述EPSP合酶基因含1353个碱基，编码的氨基酸451个；所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明的来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因采用人工方法合成，与已报道的来源于农杆菌CP4的EPSP合酶基因具有很高的同源性，且具有较高的草甘膦耐受性，可用于转基因作物的培育中。
文档编号C12R1/01GK102108363SQ20091020067
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊爱生, 田永生, 赵伟, 金晓芬, 高峰 申请人:上海市农业科学院