专利名称：中药中牛种源性成分的pcr鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域，更具体地，涉及中药的鉴定技术领域，特别是指一种中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，非常适合于深度加工型牛种源性产品，尤其是针对因 深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的牛皮胶，操作简单，可用于产品检验部门对市场 假冒伪劣的该种中草药的灵敏快速鉴定。
背景技术：
我国传统中药博大精深，可用作中药的物质种类繁多，其中有一类是利用动物皮、 骨熬制而成的胶类中药，包括阿胶、龟甲胶、鹿角胶等。这些胶类中药十分名贵，是滋阴潜 阳、增强体质的上乘佳品。阿胶本品为马科动物驴(Eqims asinus)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体 胶，作为一种名贵中药，它有着2000多年的历史。早在东汉时期就有其药用记载。阿胶性 平，其功能主要补血滋阴，润燥、止血。用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌痿无力，心烦不眠，虚风 内动，肺燥咳嗽，劳嗽唠血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏，在临床上，阿胶常用于各类妇科 疾病的治疗如痛经、子宫出血、流产和一些慢性病的治疗如失眠、焦虑、眩晕、心烦不安、吐 血尿血等。目前，阿胶系列产品已经拓展到药品、食品和保健品领域，它以其良好的功效在 “补血”市场上占据着重要地位。龟甲胶是以龟科动物乌龟(Chinemys reevesii)的背甲及腹甲为原料，经水煎煮、 浓缩制成的固体胶，性咸、甘、凉，归肝、肾、心经。能够滋阴、养血、止血，主要用于阴虚潮热、 骨蒸盗汗、腰膝酸软、血虚萎黄、崩漏带下等。有研究表明，长期服用龟甲胶有利于增强机体 自身调节，能够延年益寿，也利于阴虚阳亢患者的身体康复。据2005年版中国药典记载，鹿角胶是用鹿角经水煎煮浓缩制成的固体胶，性甘、 成、温，能够温补肝肾，益精养血。用于肝肾不足所致的腰膝酸冷，阳痿遗精，虚劳赢瘦，崩漏 下血，便血尿血，阴疽肿痛等。由此可见，胶类中药主要用于调节身体机能，滋阴潜阳，增强体质，并且对肾虚，贫 血病人具有很好的疗效。因此，该类中药在整个中药市场上占有重要的位置，深受消费者的青睐。近些年来，随着胶类中药市场的不断发展，生产胶类中药的厂家也不断增多，生产 能力以及产品质量参差不齐。以阿胶为例，由于驴的畜牧价值在不断下降，而其经济价值确 未见提高，驴的数量在世界范围内急剧下降，驴皮的供应也逐年紧张，价格不断上涨。市场 上出现了很多不法分子，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、牛皮、 猪皮等，甚至脏皮、烂皮、病死动物之皮等来取代驴皮进行熬制。这类假冒伪劣产品不止没 有任何疗效，还对人体危害极大，影响着人们的身心健康。此外，对于其他胶类中药包括龟 甲胶、鹿角胶等，也存在类似情况，这些伪品严重阻碍了整个胶类中药市场的健康发展。由于胶类中药一旦成形，无论是外观或是色泽等都区别不大，人们难以通过感观 水平的差异来对胶类中药进行真伪鉴别，而只能借助生物学鉴定的手段，通过生物学大分子的差异来对真伪胶类中药进行区分。由于在皮革工业中，一些生产残留的废弃碎牛皮等 边角料的价格极其便宜，市场上的造假者也主要利用这些边角料来取代或部分掺杂来生产 各种伪制胶类中药产品的。因此，如何能够特异性检测到胶类中药中混杂的牛源性成分，而 同时能够与主要的胶类产品如阿胶、龟甲胶、鹿角胶等进行区分变得十分重要。这也是整个 胶类中药打假工作中十分重要的一环。目前，利用DNA分子标记的方法特异性检测产品中牛种源性成分的相关研究已经 取得了一些进展，主要包括利用随机引物扩增RAPD的方法(Martinez I,Yman IM. Species identification in meat products by RAPD analysis. Food Res Int. 1998,31 459-466)，以及基于线粒体DNA特定区域的PCR检测方法等(Girish PS, AnjaneyuluASR, Viswas KN, Shivakumar BM,Anand M,Patel M,Sharma B. Meat speciesidentification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)of mitochondrial 12S rRNA gene. Meat Sci. 2005，70 :107_112)。对于一些 DNA 保存比较完 好或者轻度加工的样品检测而言，这些方法是非常有效的。然而，胶类中药来源于各种动物 皮、骨、甲或角等，加工过程包括高温高压的长时间作用，最终的成品DNA含量极少，片段极 短，仅仅依赖于上述的这些方法尚难以达到检测胶类中药中牛种源性成分的目的。定位于牛种动物基因组上的卫星DNA序列1. 711B bovine repeat是由SINE序列 衍变而来的卫星DNA序列，较线粒体DNA而言，其具有拷贝数更高的特点，与此同时，它还具 有良好的种属特异性，大量存在于牛种动物中。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种中药中牛种源性成 分的PCR鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单、灵敏快速、成本低、能有效鉴定种源性产品的 真伪，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的深度加工型牛皮胶的 真伪，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案一种中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特点是，包括下列步骤a)提取所述中药中的DNA ；b)用根据具有牛种动物特异性的卫星序列设计的牛种源性特异性引物对所述 DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；c)电泳所述扩增产物，通过电泳结果判断所述DNA是否扩增出阳性扩增条带，如 果所述DNA扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药源自牛种动物，含有牛种源性成分；如果 所述DNA没有扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药并不源自牛种动物，也不含有任何牛 种源性成分。较佳地，在步骤a)中，所述中药是深度加工型中药。更佳地，所述深度加工型中药是深度加工型牛种源性中药。更进一步地，所述深度加工型牛种源性中药是因深度加工而导致DNA含量极少， 片段破坏极其严重的牛皮胶。更佳地，采用消化液和蛋白酶预处理所述深度加工型中药，再采用针对短片段DNA 的抽提方法提取所述DNA。
较佳地，所述具有牛种动物特异性的卫星序列是1. 71 IB bovine repeat序列。较佳地，所述具有牛种动物特异性的卫星序列是GenBank Accesion No.V00116代 表的序列。更佳地，所述牛种源性特异性引物包括SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2所示的核苷
酸序列。
较佳地，所述阳性扩增条带的长度在IOObp以下。采用本发明的方法，能够快速检测胶类中药中是否混杂有牛种源性成分，从而分 辨真伪，且由于其采用基于种属特异性的卫星DNA序列，特异性好，大小适中，并且相对 rDNA，mtDNA而言，其拷贝数更高，属于高度重复序列，比较适合DNA破坏严重的样品的PCR 检测。因此，尽管深度加工型胶类中药DNA含量极少，破坏极其严重，但本发明基于卫星DNA 的PCR检测方法完全能够达到检测目的，特异性检测牛种源性成分。此外，本发明并不需要 十分昂贵的仪器和繁琐的操作，常规PCR即可完成检测，操作简单、成本低、灵敏快速、能有 效鉴定深度加工型胶类中药产品的真伪。
图1是采用基于牛特异性卫星DNA序列设计的种属特异性引物进行PCR反应获得 的扩增产物电泳图，用于检测各种肉源性成分中的牛种源性成分。其中M. DNAMarke^L驴 肉基因组DNA，2.马肉基因组DNA，3.牛肉基因组DNA，4.猪肉基因组DNA，5.龟肉基因组 DNA, 6.鹿肉基因组DNA，7.空白对照。图2是采用基于牛特异性卫星DNA序列设计的种属特异性引物进行PCR反应获得 的扩增产物电泳图，用于检测各种胶类中药中的牛种源性成分。其中M. DNA Marker, 1.阿 胶DNA，2.马皮胶DNA，3.牛皮胶DNA，4.猪皮胶DNA，5.龟甲胶DNA，6.鹿角胶DNA，7.空白 对照。图3是采用基于牛特异性卫星DNA序列设计的种属特异性引物进行PCR反应获得 的扩增产物的测序比对结果，用于验证扩增产物的可靠性。其中1.牛肉基因组扩增产物， 2.牛皮胶DNA扩增产物，3.牛种动物基因组卫星DNA序列1.711B bovine r印eat序列片 段。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。本发明以鉴定牛皮胶为例，为了检测胶类中药中可能混杂的牛种源性成分， 并与其他各类动物源性成分进行区分，基于牛种动物卫星DNA序列1.711B bovine repeat (GenBank Accesion No. VOOl 16)优化设计引物如下根据牛特异性卫星DNA序列设计引物，理论目标条带大小64bp，用于检测胶类中 药中牛种源性成分。其序列如下上游引物Bovine up =SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列下游引物Bovine down =SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列各实施例提取胶类中药的DNA的具体步骤如下1、胶类中药的预处理将胶块锤击成颗粒状，取出若干加入一只50ml无菌离心管中，并向其中加入消化缓冲液，该缓冲液pH 8.0，由10mmol/L Tris-HCl，25mmol/LEDTA， 1 OOmmo 1/L NaCl, 0. 5% SDS构成，然后将离心管置于50°C _60°C水浴中保温，其间不时轻微 搅拌混勻，直到颗粒状物质全部溶解。待溶液冷却至室温后，加入蛋白酶K溶液，混勻，56°C 保温1小时，其间不时轻微摇勻。2、胶类中药DNA的提取向上述胶类中药预处理液中加入PN缓冲液，混勻，分若干 次加入硅吸附柱中，离心，将溶液中DNA小心的吸附于吸附柱的硅膜上，再于吸附柱中加入 PE缓冲液洗涤吸附柱膜，除去附着在膜上的少量蛋白及脂类物质，完毕之后用热的PH 8. 0 的TE缓冲液将吸附柱膜上的DNA洗脱收集下来并置于_20°C保存。提取得到的DNA可用紫 外分光光度法定量。上述提取操作过程中所用试剂、耗材皆来自商业化试剂(德国QIAGEN公司)，包括 PN 缓冲液(Cat. No. 19071)、PE 缓冲液(Cat. No. 19065)、硅吸附柱(Cat. No. 28304)。用上述方法提取得到各个胶类制品DNA样之后，利用上述引物进行常规的PCR操 作，将产物加于2% -3%的添加了荧光染料的琼脂糖凝胶中电泳，紫外下观察，根据是否出 现阳性扩增条带判断待检测样品中是否含有牛种源性成分，从而完成对这些样品的检测。实施例1检测各种肉基因组中所含有的牛种源性成分1材料和试剂材料各种肉类包括驴、马、牛、猪、龟、鹿的基因组DNA提取液(lng/yL)。试剂PCR预混酶 Premix Ex-Taq Hot Start Version (购于 TAKARA，Cat. No. DRR030A) ；DNA 荧光染料 10000 XGelRed =DNA 荧光染料(购于 Biotium，Cat. No.41000)。2检测方法取各种肉基因组DNA提取液备用，使用根据牛特异性卫星DNA序列1. 71 IBbovine repeat所设计的引物进行PCR反应，引物用无菌水溶解至浓度10 μ M备用。25 μ L反应体 系的具体加样情况如下Premix Εχ-Taq Hot Start Version 12. 5 μ L，弓 | 物 Bovine up 0.5以1，弓|物 Bovinedown 0. 5 μ L,基因组DNA提取液1 μ L，无菌双蒸水10. 5 μ L ；(在该反应体系中，上游及下游引物终浓度皆0.4 μ Μ,各种肉类DNA模板量lng。)扩增条件94°C6min -MV 30s, 50°C 30s, 72°C 30s (30 循环)；72°C 7min ；4°C ⑴。PCR操作结束后，用IXTAE电泳缓冲液制备2. 5%琼脂糖凝胶并按照参考比例混 入荧光染料GelRed 。按照比例将10 μ 1的PCR产物与上样缓冲液均勻混合，加入凝胶孔 中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶 块置于凝胶成像仪上观察并拍照。结果见图1，由于引物根据牛特异性卫星DNA序列设计，泳道3具有阳性条带，而其 它泳道均没有出现阳性条带，可见该方法能够特异性检测牛种源性成分，而与其他各种动 物源性成分包括驴、马、猪、龟、鹿等进行区分。实施例2检测胶类中药中所含有的牛种源性成分1材料和试剂材料阿胶(山东东阿股份有限公司生产)DNA提取液(lOng/μ ；马皮胶(山东 东阿股份有限公司研究所采用马皮熬制)DNA提取液(lOng/μ ；牛皮胶(山东东阿股份有限公司研究所采用牛皮熬制)DNA提取液(lOng/μ ；猪皮胶(山东东阿股份有限公司 研究所采用猪皮熬制)DNA提取液(lOng/μ ；龟甲胶(山东东阿股份有限公司生产)DNA 提取液(lOng/yL)；鹿角胶(山东东阿股份有限公司生产)DNA提取液(lOng/yL)。试剂PCR预混酶 Premix Ex-Taq Hot Start Version (购于 TAKARA，Cat. No. DRR030A) ；DNA 荧光染料 10000 XGelRed =DNA 荧光染料(购于 Biotium，Cat. No.41000)。2检测方法取各种胶DNA提取液(lOng/μ 备用，使用根据牛特异性卫星DNA序列 1. 71 IBbovine repeat所设计的引物进行PCR反应，引物用无菌水溶解至浓度10 μ M备用。 25 μ L反应体系的具体加样情况如下Premix Taq Hot Start Version 12. 5 μ L, ^I^Bovine up 0. 5 μ L, ^I^Bovine downO. 5 μ L，模板5 μ L,无菌双蒸水6. 5 μ L ；(在该反应体系中，上游及下游引物终浓度皆0.4 μ Μ，待检测胶类DNA模板量 50ngo )扩增条件:94°C6min -MV 30s, 50°C 30s, 72°C 30s (40 循环)；72°C 7min ；4°C ①。PCR操作结束后，用IXTAE电泳缓冲液制备2. 5%琼脂糖凝胶并按照参考比例混 入荧光染料GelRed 。按照比例将10 μ 1的PCR产物与上样缓冲液均勻混合，加入凝胶孔 中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶 块置于凝胶成像仪上观察并拍照。结果见图2，由于引物根据牛特异性卫星DNA序列设计，所以仅泳道3具有阳性条 带，可见尽管由胶类中药中得到的DNA含量极少，利用针对牛特异性卫星DNA序列设计的引 物，通过PCR能够检测出胶类制品中的牛种源性成分，而在其它样品中没有扩增出阳性条 带。接着对该实施例中的牛肉基因组扩增产物以及牛皮胶扩增产物进行连接载体并测序， 将所得到的测序结果进行比对，结果见图3，同源性良好，并且与所设计的产物序列相符，进 一步验证了检测结果的可靠性。因此利用这种方法能够特异性检测到胶类中药中可能混杂 的牛种源性成分。上述试验结果表明，针对牛特异性卫星DNA序列设计引物，能够特异性检测到胶 类中药中的牛种源性成分，得到清晰的条带。尽管该牛种源性成分特异性卫星DNA序列从 未被用于实际加工产品的牛种源性特异性检测，但由于它具有牛种动物特异性，同时属于 高度重复序列，拷贝数较线粒体DNA多，根据该序列设计引物，通过PCR检测完全有可能特 异性检测到深度加工型胶类中药中的牛种源性成分。因此，利用牛特异性卫星DNA序列能 够识牛种源性成分，达到检测深度加工型胶类中药中可能混杂的牛种源性成分的目的。卫星DNA序列相对rDNA及mtDNA而言，拷贝数高，特异性好。所以，本发明对待检测样品的初始DNA模板质量要求较低，尽管从深度加工胶类中药中提取得到的DNA浓度极 低，破坏极其严重，但是，利用本发明进行检测，依然能够得到较为理想的结果。本发明的基 于牛特异性卫星DNA序列的PCR检测方法能够适用于深度加工的各类胶类中药的牛种源性 成分检测。这也是本发明最大的特点和优势。并且该法并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的 操作，常规PCR即可完成检测。因此，这种基于牛特异性卫星DNA序列所构建的深度加工型产品检测方法是从深度加工型胶类中药中鉴定牛种源性成分的关键。这一点在利用分子生物学技术鉴别深度加工型胶类中药的领域意义重大，它能够用于市场上大部分胶类中药产品的真伪鉴别。目前 特异性检测胶类中药中牛种源性成分的分子鉴别技术国内外尚未见报道。综上所述，本发明的中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法操作简单、灵敏快速、成 本低、能有效鉴定牛种源性产品的真伪，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、 片段极短的深度加工型牛皮胶的真伪，适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出 各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的 而非限制性的。序列表<110>华东理工大学，山东东阿阿胶股份有限公司<120>中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法<160>2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . . (18)<223> 根据牛种动物卫星DNA序列 1. 711B bovine repeat (GenBank Accesion No.VOOl 16)设计的上游引物<400>1gtttgcagga agaaagcc18<210>2
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . . (18)<223> 根据牛种动物卫星DNA序列 1. 711B bovine repeat (GenBank Accesion No.VOOl 16)设计的下游引物<400>2tgcatagagg ataatggg18
权利要求
一种中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤a)提取所述中药中的DNA；b)用根据具有牛种动物特异性的卫星序列设计的牛种源性特异性引物对所述DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；c)电泳所述扩增产物，通过电泳结果判断所述DNA是否扩增出阳性扩增条带，如果所述DNA扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药源自牛种动物，含有牛种源性成分；如果所述DNA没有扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药并不源自牛种动物，也不含有任何牛种源性成分。
2.根据权利要求1所述的中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，在步骤 a)中，所述中药是深度加工型中药。
3.根据权利要求2所述的中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述深度 加工型中药是深度加工型牛种源性中药。
4.根据权利要求3所述的中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述深度 加工型牛种源性中药是因深度加工而导致DNA含量极少，片段破坏极其严重的牛皮胶。
5.根据权利要求2所述的中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，采用消化 液和蛋白酶预处理所述深度加工型中药，再采用针对短片段DNA的抽提方法提取所述DNA。
6.根据权利要求1所述的中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述具有 牛种动物特异性的卫星序列是1.711B bovine r印eat序列。
7.根据权利要求1所述的中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述具有 牛种动物特异性的卫星序列是GenBank Accesion No. V00116代表的序列。
8.根据权利要求7所述的中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述牛种 源性特异性引物包括SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述阳性 扩增条带的长度在IOObp以下。
全文摘要
本发明提供了一种中药中牛种源性成分的PCR鉴定方法，包括下列步骤a)提取所述中药中的DNA；b)用根据具有牛种动物特异性的卫星序列设计的牛种源性特异性引物对所述DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；c)电泳所述扩增产物，通过电泳结果判断所述DNA是否扩增出阳性扩增条带，如果所述DNA扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药源自牛种动物，含有牛种源性成分；如果所述DNA没有扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药并不源自牛种动物，也不含有任何牛种源性成分。本发明操作简单、灵敏快速、成本低、能有效鉴定种源性产品的真伪，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的深度加工型牛皮胶的真伪，适于大规模推广应用。
文档编号C12Q1/68GK101812508SQ20091020077
公开日2010年8月25日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者吕品, 周祥山, 尤金花, 张元兴, 田守生, 秦玉峰 申请人:华东理工大学;山东东阿阿胶股份有限公司