核糖核苷酸标记核酸检测的制作方法

专利名称：核糖核苷酸标记核酸检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸检测领域。具体而言，本发明提供了具有多^卩接序列段的多核苷酸，其中^t^序列段的5'-末端核苷酸 是,列段中独特的并在每个序列段中是相同的，且提供了所述多核苷翻于检测耙核酸的方法。
背景技术：
已知剤艮多检测耙核酸的方法(如SNP基因型分型)。目前可用于SNP基因型分型的均相测定包括TAQMAN， AMPLIFLUOR，染料结合、等位基因选择动态PCR (allele-selective kinetic PCR)以及SCORPION⑧引物测定。这些观啶在每个反应孔中提供一个或至多两iX如果应用四种不同的荧光染料)SNPs(如染料结合动态PCR对于一个SNP需要两个孔)。SNP基因型分型的可用方法在/A^些在反应孔中允许单个SNP基因型分型的方法，至娜些允许单个孔中数千个SNPs基因型分型的方法(如GOLDEN GATE⑧测定，Hlumina)的范围内。目前的基因型分型测定程序不易多重化，这归因于每种类型的等位基因需要不同的染料，并因耐艮制了其改善的可能。GOLDEN GATE^测定需要复杂的分析设备，诸如纤维光学阵列读数器。SNP基因型分型的读取分析仪在从板读数器(任选地，带有包含的PCR机器)至测序仪(如毛细管测序仪)、阵列读数器以及质谱仪的范围内。此外，在质谱仪已用于基因型分型的程度上，目前可用的fOT不允许真实的多重化。

发明内容
本发明提供了用于一个或多个革巴核酸的有效且高灵敏度的并行检测的多核苷酸。所述的多核苷酸设计为具有包含一个、两个或更多^瞎序列段的5'部分，从而序列段或其互补体的质量，鉴别靶核酸鄉E核酸内的耙核苷酸。在一些实施方案中，所述的序列段是等质量的。等质量的序列段可以但不需要具有相同的序列。序列段切割自多核苷酸的互补体，并且其质量被测量，测以鉴另脾巴核酸的存在、不存在或存在的水平。
因此，在第一个方面，本发明提供了包含一个、两个或更多个序列段的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷離含5'部分和3'部分，其中
a) 5'部他含至少一个或至少两W階序列段，其中每个序列段包含至少三个核苷酸碱基，具有相等质量，并且每个序列段的5'-末端核苷酸碱 —个序列段中是独特的并在^h序歹暇中是相同的；并且
b) 3'部^S含至少5个核苷酸，其中所述的多核苷酸的长度少于约100个核苷酸碱基。在一些实施方案中，所述的多核苷酸的长度少于约75、 50或25个核苷酸。
在雌的实施方案中，^h序列段具有相同的核苷辦列。在其它优选的实 案中，5，部分包含至少3、 4、 5、 6、 7或8^K階序列段。在一，选实施方案中，^序列段包含至少3、 4、 5、 6、 7或8个核苷酸。
在同样雌的实施方案中，3'-末端包含可去除的封闭部分，其基本上阻止多核苷酸的延伸。在特别雌的实施方案中，3'-末端包含2'终止子部分。
在另一方面，本发明提供了检测靶核酸的方法。在一些实施方案中，所述的方法包括
a) 将耙核酸与多核苷酸、核苷酸集以及核苷酸^生物催化组分接触，
其中
(0所述的多核苷,含5'部分和3'部分，所述的5'部*含至少一个或至少两个邻接序列段，其中每个序列段包含至少三个核苷酸碱基，并且每个序列段的5'-末端核苷酸碱基在一个序列段中是独特的并在每个序列段中是相同的；并且3'部他含足以与耙核麟交并在扩增条件下延伸的基本上互补的序列段；
(u)所述的核苷,包含至少两种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)形式的核苷酸 ，并且至少一种核苷酸M的大多数是核糖核苷酸(rNTP)形式，其中所
述的核糖核苷酸m与所述多核苷酸^h序列段的独特5'核苷酸碱基互补；以
及
(iii)所述核苷酸M生物催化组^含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷M合活性；
b) 在扩增条件下扩增耙核酸以产生包含与该多核苷酸5'-部分互补的3'序歹暇(即3'-部分)的扩增子，其中所述3'序列段包含至少一个或至少两个序列段，其中齡序列段的3'末端核苷酸碱基是具有和核苷酸集中NTP相同碱基 的核苷一磷酸(NMP);
c) 将針NMP3'的扩增子切害U为片段，其中所述切割释放作为个别片 段的序列段；以及
d) 检测扩增子片段，其中检测的序列段的片段指示耙核,列的扩增， 从而检测耙核,列。
在优选的实施方案中，5'部分序列段是等质量的。
在其它优选的实船案中，至少一种核苷酸碱基的至少80%是核糖核苷酸 (rNTP)的形式。
在其它优选的实施方案中，通过使扩增子经受碱性溶液进行所述切割。 在优选的实施方案中，碱性溶液包含下面的至少一种:NaOH、 KOH、 RbOH、
Mg(OH)2、 Ca(OH)2或NH4OH。在更优选的实施方案中，碱性溶液包含下面的
至少一种NaOH、 KOH或NH(OH。
在同样优选的实施方案中，所述的方法进一步包括将耙核酸序列与多核苷
W"相接触的步骤，其中所述多核苷fet中的^多核苷酸包含等质量的5'部
分序列段。
在其它优选的实施方案中，所述的方法进一步包括将靶核酸与至少一个多 核苷酸相接触的步骤，其中从多核苷酸或其互补微测到序列段片尉旨示革巴核 酸序列中存在多态性核苷酸等位基因。
在其它优选的实施方案中，所述的方法进一步包括将耙核酸与至少两个不
同多核苷酸相接触的步骤，其中所述多核苷酸仅在3'-末端核苷酸鹏上不相同，
其中每个多核苷酸的3'-末端核苷酸i^对应于独特质量的序列段，并且，其中 从至少一个多核昔酸或其互补皿测到序列段片段指示靴核酸序列中多态性核
苷酸的等位基因的存在。
在其它优选的实施方案中，许多不同耙核酸序歹i」与许多不同多核苷酸相接 触，每种不同的多核苷酸包含独特质量的序列段，其中多核苷酸的序列段是许 多不同靶核酸序列之一的鉴定剂(identifier),由此，从至少一个多核苷酸或其 互补体中检测到序列段片段指示许多不同靶核酸序列中至少一个的存在。
在其它优选的实施方案中，所述核苷酸整合生物催化组分包含单个催化结 构域，所述的催化结构域包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸整合活性。根据本发明进一步优选的是，核苷酸整合生物催化组分包含第一和第二催化结构域， 其中第一催化结构域包含脱氧核糖核苷酸整合活性，且第二催化结构域包含核 糖核苷酸M^活性。
在优选的实施方案中，通过质谱分析法进行所述检测。在一靴选的实施 方案中，通过气相离子质谱分析法进行检测或备选地，通过激光解吸电离质谱 分析法进行检测。
在其它优选的实施方案中，多核苷酸包含基本上阻止多核苷酸延伸的封闭 部分，并且其中所述的方法进一步包括在扩增前从多核苷酸中去除封闭部分的 步骤。
在另一方面，本发明提供了反应混合物，如用于进4于上文所述检测的创造 性方法的反应混合物。在 的实施方案中，反应混合物包含
a) 包含5'部分和3'部分的第一多核苷酸，其中所述的5'部，含至少一个 或至少两^卩接序列段，其中每个序列段包含至少三个核苷酸碱基，其中每个 序列段的5'-糊核苷酸^SE—个序歹暇中是独特的并在^^序列段中是相同 的；并且3'部他含足以与靶核麟交并在扩增条件下延伸的基本上互补的序 列段；
b) 核苷酸集，其包含至少两种脱氧核糖核苷酸(dNTP)形式的核苷酸M， 且至少一种核苷酸碱基的大多数是核糖核苷酸(rNTP)的形式，其中所述的作 为核糖核苷酸提供的核苷酸碱基互补于^^序歹煅的独特5'核苷酸鹏；以及
c) 核苷酸齡生物催化组分，其包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷,合活性。
在，的实施方案中，反应混合物包含至少一个耙核酸序列。 在相关的方面，本发明提供了试剂盒。在雌的实施方案中，试剂盒包含
a) 包含5'部分和3'部分的第一多核苷酸，其中所述的5'部他含至少 一个或至少两^K卩接序列段，其中*序列段包含至少三个核苷酸碱基，且每 个序歹暇的5'-末端核苷酸碱驗一个序列段中是独特的并在針序歹暇中是相 同的；并且3'部他含足以与耙核酸杂交并在扩增斜牛下延伸的基本上互补的 序列段；
b) 核苷,，其包含至少两种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)形式的核苷酸 tt，且至少一种核苷酸M的相当大多数是核糖核苷酸(rNTP)的形式，其中所述的作为核糖核苷酸提供的核苷酸f藤互补于每个序列段的独特5'核苷酸 碱基；以及
c) 核苷酸整合生物催化组分，其包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸整 合活性。
反应混合物和试剂盒的实施方案如上文对于多核苷酸和方法的描述以及如 此处所描述。根据本发明的1腿试剂盒例如是这样的试剂盒其中齡5'部分 序列段是等质量的，并且所述多核苷酸的5'部分序列段包含至少三个序歹煅， 更优选的至少四个核苷酸碱基，以及最优选的至少七个核苷酸碱基。在试剂盒 的其它雌实施方案中，所述的3'-末端包含可去除的封闭部分，其基本上阻止 多核苷酸的延伸，更{ 地多核苷酸的3'- 包含2'终止子部分。
在其它方面，本发明提供了扩增子。在一些实施方案中，扩增子包含双链 多核苷酸，所述双链多核苷酸包含
a) 包含5'部分和3'部分的第一链，其中5'部^含至少一个或至少两^P接序 列段，其中每个序列段包含至少三个核苷酸碱基，具有相等质量，并且針序 列段的5'-末端核苷酸碱 —个序列段中是独特的并在每个序列段中是相同 的；并且3，部，含至少五个核苷酸，以及
b) 与第^S补并且包含3'部分的第二链，所述3'部分包含这样的序列段，所 鹏列段包含至少一个或至少两W階序列段，其中每个序列段的3'-末端核苷 酸鹂是NMP。
在另一方面，本发明提供了系统。在一些实施方案中，所述的系统包含至 少一个容器救持物，其包含
a) 包含本发明扩增子的组合物；
b) 至少一个配置来与所述容器或支持物热交流以调节容器内或支持物 上、温度的热调节器；
c) 至少一个转移试剂至容器或支持物和/或从容器^s:持物转移试剂的
试剂转移部件；以及
d) 至少一个配置来检测容器中或支持物上产生的一个或多个序列段质 量的检测器。
在雌的实施方案中，所述的检测器包含气相离子光谱观啶仪。 在 的实施方案中，所述系统包含至少一个控制器，所述控制器可操作
10鹏接于
-实现调节容器中^S:持物上温度的热调节器， -实现转移试剂至容器救持物和/或从容器救持物转移试剂的试剂转移 部件，和/或，
-实现检测容器中鼓持物上产生的序列段质量的检测器。
定义
术语"核酸或"多核苷酸'可互换地应用于对应于核糖核酸(RNA)或脱氧 核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物的聚合物。这包括核苷酸聚合物诸如RNA 和DNA及其修饰形式、肽核酸(PNAs)、锁定核酸(LNATM)等等。在某些实 施方案中，核酸可以是包括多个单体类型，例如包括RNA亚单位和DNA亚单 位两者的聚合物。核酸可以是或可包括如染色体或染色体区段、载体(如表达 载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合^l连反应(PCR)的产物、寡核 苷酸、探针、引物等等。核酸可以是如单链、双链、三链等等并且其不限于任 何特定长度。除非另有指定，除明确指明的任意序列之外，特定核酸序列还任 ^i也包含或编码互补序列。
核酸不限于具有天然存在的多核苷酸序列或结构、天然存在的主链、和/或 天然存在的核苷酸间键的分子。例如，含有一个或多个碳环糖的核酸也包括这 一定义之内(Jenkins等(1995) C/^w. 他v. 169-176页)。为进一步说明， 尽管核酸将通常包含磷酸二酯键，但在一些情况下，包括那些具有另外的主链 的核酸类似物。这^括但不限于磷酰胺(Beaucage等(1993) r欲"/^ra" 49(10):1925及其中的参考文献；Letsinger (1970) J. 0《.Ctew. 35:3800; Sprinzl 等(1977) Ew/:J历oc/^m.81:579; Letsinger等(1986) iVwc/. A:幼/feU4:3487; Sawai等(1984) O^w.丄成805; Leteinger等(1988)J J附.5bc.ll0:4470; 以及Pauwels等(1986) C/ 柳/ca&n》to26:1419)、硫代磷酸酯(Mag等(1991) M^to'cA^i^. 19:1437以及美国专利No. 5,644,048)、 二硫t代磷酸酯(Briu等
111:2321 )、 O-甲基亚磷,键(Eckstein. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach. Oxford University Press(1992))、以及肽核酸 主链和键(Egholm (1992) J. 4m. O 柳.114:1895;Meier等(1992) Ozew. /脱 M 31:麵;Nielsen (1993)油詢365:566;以及Carlson等(1996)淑,380:207)。
另外的类似t/t亥,括具有正电荷主链(Denpcy等(1995) AM &/. USA 92:6097);非离子主链(美国专利Nos. 5,386，023、 5,637，684、 5,602,240、 5,216,141以及4,469,863; Angew(1991)Chem. Intl. Ed. English 30:423; Letsinger 等(1988) J. 乂附.O/ew. 110:4470; Letsinger等(1994)M^feas/6fe &7Vwc/e^<ie 13:1597;第二章和第三章，ASC Symposium Series 580,"Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y S. Sanghvi禾口 P Dan Cook; Mesmaeker 等(1994 )及owg朋/c & A/o/,c/ra/ O^m. 4:395; Jeffs等(1994 )J.说owo/ecw/ar 泌汉34:17; 7^ra/^ah "Z成37:743(1996))以及非核糖主链的那些，包括那些 描述于美国专利Nos. 5,235,033和5,034,506，以及第6和第7章，ASC Symposium Series 580 ， Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed Y S. Sanghvi禾口 P. Dan Cook中的。几禾中核酸类似物还描述于，如Rawls, C & E News 1997年6 月2日，第35页。可进行核糖磷酸主链的修饰以，附加部分(诸如标记部 分)的添加，或改变该針在生理环境下的稳定性和半衰期。
除了天然存在的通常发现于核酸的杂环碱基(如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧 啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外，核酸类似物还包括那些非天然存在的杂环或其它 修饰的碱基。为了说明，任选地包括用于核苷酸中作为解链温度(Tm)调节物 的某些碱基。例如，这些鹏中的一鲍括7-脱氮嘌呤(如7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等)、吡唑[3，4-d]嘧啶、丙'J^S-dN (如丙炔基-dU、丙'^S-dC等) 等等。参见例如美国专利No. 5,990,303。其它fW性杂环M^括如次黄嘌 呤、肌苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、 肌昔和黄嘌呤的8-M^衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、 2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的7-脱氮-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞
嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞啼啶；5-
丙'J^S胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶(5-bromovinyluracil); 5-MM嘧啶；5-繊嘧
啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿喷啶；5-乙
'^S尿嘧啶；5-丙'^S尿嘧啶等等。许多非天然存在的 也描述于例如Seela 等(1991 ) //e/v (3^.爿cto 74:1790,Grein等(1994)历cwg A/ed C/iew. Leff.4:971-976，以及Seela等(1999)//e/v CA,m.爿cto 82:1640。修饰的碱凝口核 苷酸的其它实例也描述于例如美国专利Nos. 5,484,908、 5,645，985、 5,830,653、6,639,059、 6,303,315以及美国专利申请公开No. 2003/0092905。
"核苷酸指的是核苷的酯，如核苷的磷酸酯。为了说明，核苷酸可包括l、 2、 3个或更多共j條接至所述核苷的糖部分(如5'位、3'位、2'位等等)的磷 酸基团。
"核苷酸整合生物催化剂"指的是催化核苷酸整合入核酸的催化剂。核苷酸 整合生物催化剂通常是酶。"酶"是基于蛋白质的催化剂，其发挥作用以减少涉 及其它化合物或'底物'的化学反应的活化能。"核苷M合酵'指的是催化核苷酸 M入核酸的酶。实例性核苷1 ^,括，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、 终端转移酶、逆转录酶、端粒酶、多核苷酸磷酸化酶等等。其它的生物催化剂 可以是基于DNA的("DNA核酵0或基于RNA的("核酶')。"耐热酵'指的 是对热稳定的酶，当经，择的时间段的升高的温度时是热抗性的，并保留足 够的催化活性。例如，当经受实现双链核酸变性所需时间的升高纟显度时，耐热 聚合謝呆持足够的实现随后的弓卿延伸反应的活性。核酸变性必需的加热条件 是本领域所熟知的，并且例示于题为"PROCESS FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID SEQUENCES"、1987年7月28日授权给Mullis的美国专利No. 4,683,202， 以及题为"PROCESS FOR AMPLIFYINQ DETECTINQ AND/OR-CLONING NUCLEIC ACID SEQUENCES"、 1987年7月28日授丰又给Mullis等的美国专利 No. 4,683,195中。本发明所使用的耐热聚合酶通常适合在温度循环反应诸如 PCR或5'-核酸酶反应中应用。对于耐热聚合酶，酶活性指的是以正确的方式催 化核苷酸聚合以形成互补于模板核酸的弓l物延伸产物。
示例性的核苷酸齡生物催化齐抱括，如G46E E678G CS5 DNA聚合酶、 G46EL329AE678GCS5 DNA聚合酶、G46EL329AD640G S671F CS5 DNA聚 合酶、G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶、G46EE678GCS6 DNA聚合酶、AZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、Hffi热菌(77^^t^ 聚合酶、TMA-25聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、E678G TMA-30聚合酶、TthDNA聚合酶、栖热菌属(7^emmO物种SPS-17聚合酶、 E615G Taq聚合酶、栖热菌属Z05R聚合酶、T7 DNA聚合酶、科恩伯格 (Komberg) DNA聚合酶、克列诺(Klenow) DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、 微球菌DNA聚合酶、a DNA聚合酶、逆转录酶、AMV逆转录酶、M- MuLV 逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、大肠杆菌(EcW) RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7RNA聚合酶、RNA聚合 酶n、末端转移酶、多核苷酸磷酸化酶、核糖核苷酸齡DNA聚合酶，等等。
术语"序列段"指的是本发明多核苷酸的5'-部分的多核苷酸子序列(即5' 尾)。5'-部分包含一个、两个或更多个序列段，每个序列段具有位于5'-末端的 独# ，它们在一种多核苷酸5'-尾J^t于所有序列段是相同的。序列段可具 有约3-10个或更多碱基的长度，例如，约3-8、 3-6、 4~6、 4-8或7-8 M的长 度，并且5'-部分可包含2个至约10个或更多序列段。序列段可以是但不需要 是等质量的。等质量的序列段可以是但不需要具有相同的序列。共享相同核酸 序歹啲5'-尾中的序歹煅是重复。
术语"5'-末端"和"3'-末端"可互换指代多核苷^h的核苷酸位置，其处于5'-端或3'-端(即5'-或3'-^ )，鄉巨离核酸或其子序列^的一个或两个核 苷酸鹏位置(即，处于距5，-或3，-末端(-1)或(-2)的位置)。
术语"封闭部分"或'封闭基团"指的是附着至多核苷酸3'-末端的化学基团或 部分，其阻止核酸的延伸，如通过至少一个核苷M合生物催化齐啲延伸。示 例性的封闭部分包括在3'-末端核苷酸鹏的2'位的取代基即2'终止子核苷酸。
"2'终止子核苷酸"指的是在核苷酸糖部分2'位包含封闭基团(BG)的核苷 酸类似物。2'终止子核苷酸可以是不可被一个或多个核苷酸齡生物催化剂延伸 的。那就是， 一旦2，终止子核苷酸被^入核酸(如在核酸的3，终末端)，封闭 基团就阻止通过至少一个核苷酸整合催化齐啲核酸的进一步延伸。示例性的封 闭基团是磷酸基团。示例性的2'终止子核苷,括2'-单磷酸-3'-羟基-5'-三磷酸 核苷和2，-单磷酸-3，-羟基-5，-二磷酸核苷。2'终止子核苷酸详细描述于，例如美 国专利公开Nos. 2007/0219361和2007/0154914。
术语"耙核酸'指的是任何包括待检子序列的核酸。耙核酸可以是DNA或 RNA。靶核酸可以是任意来源，包括基因组DNA、 mRNA、 cDNA。革巴核酸可 以是天然存在的或合成的(如扩增子、载体等等)。耙核酸可以是但不需要是纯 化或分离的。取决于检测测定的性质，靶核酸可以是来源于植物或动物组织， 或取自反应混合物。耙核酸在长度上没有限制，尽管耙核酸可以在由目前的方 法检测或鉴定之前暴露于限制性内切核酸酶。对于本发明方法的目的而言，靶 核麟用本领域己知的方法制备。
术语"扩增劍牛"指的是扩增反应(如PCR扩增、RT-PCR扩增)的割牛，
14所述的扩增反应允许可延伸多核苷瞰例如，引物)与靶核苷酸的杂交，以及可延 伸多核苷酸的模板依赖的延伸。如本发明所〗顿的，"扩增条件"鹏于扩增靶
核酸的充足^f牛是本领域熟知的。参见例如K^Pr/mwJI^orato^Mwwa/, Dieffenbach和Dveksler,编辑,20(B, Cold Spring Harbor Press;以及尸O 尸ratoco&， Bartlett和Stirling,编辑,20(B, Humana Press 。


图1示例说明了本发明的多核苷酸以及方法的示意^。在lt际例性实施 方案中，多核苷酸包含具有3个相同序列段(即"重复")的5'-部分或5'-尾 (5'-NTAATAATAAT-3';SEQ ID NO:l )。所述的多核苷酸用于检测耙核酸内的多 态性核苷酸。所述的核苷,可包含约50%至100%的核糖核苷酸，所述的核糖 核苷酸互补于每个序列段的5'-末端位置的核苷酸(如rATI^A)。核糖核苷酸被 整合入互补于多核苷酸的扩增子链。使扩增子经受片段化，从而释放序列段。 接着，检测释放的序列段的质量。核糖核苷酸也将齡入耙核酸的互补链(3，-^ATTATTATTA-5，;SEQIDN0:2)。因此，革巴核酸的扩增链也将在核糖核苷酸 被M^的位置经受切割。
图2示例说明了应用于此以及实施例1所描述的方法在H19基因内SNP的 C等位基因的成功基因型分型。"GTCTTA"指的是询问弓,(interrogating primer) 中重駄聚体的反向互补核辦列。"噪声表明没有检观倒可辨另啲信号。
图3示例说明了应用于此以及实施例1所描述的方法在H19基因内SNP的 T等位基因的成功基因型分型。"GCTCTA"指的是询问引物中重复六聚体的反 向互补核,列。"噪声表明没有检测到可辨别的信号。
图4示例说明了应用于此以及下面的实施例1所描述的方法在H19基因内 SNP的C和T等位基因的成功并行基因型分型。"噪声表明没有检测至何辨别 的信号。
图5示例说明了应用80%或90%核糖核苷酸(此处是rATP)以及脱氧核糖 核苷酸dU和dC对HIV转录物的成功鉴定。未从不具有纟鎌的样品中获得信号。 参见实施例2。 "CCUA"指的是上游引物中重复四聚体的反向互补核酸序列 (4xCCUA=SEQ IDNO:6)。 "GUGA"指的是下游引物中重复四聚体的反向互补 核Mi^列(4xGUGA=SEQIDNO:7)。"噪声表明没有检观倒可辨别的信号。
图6示例说明了应用80%或90%核糖核苷酸(此处是rATP)以及脱氧核糖核苷酸dU和5-Me-dC对HIV转录物的成功鉴定(4xCmeCmeUA= SEQ ID NO:8; 4xGUGA=SEQIDNO:7)。未从不具有模板的样品中获得信号。参见实施例2。
"噪声表明没有检测到可辨另啲信号。
图7总结了图5和图6示例说明的测i辦品的结果(4xCmeCmeUA: SEQ ID NO:8; 4xCCUA=SEQ ID NO:6)。
图8A-C示例说明了 N0S1_361的SNP R的ATP核糖-PCR的7-聚体区域 的质谱。A，对应于纯合子A的3片段GTTTCTA(3xGTTTCTA-SEQIDNO:9)。 B，对应于杂合子AG的3片段GTTTCTA和GTTTTTA(3xGTTTTTA= SEQ ID NO:IO)。 C，对应于纯合子G的三片段GTTTTTA。
具体实施例方式
1、导言
本发明提供了多重检测程序，其要求最小数目的反应步骤并允许方便和真 实的多重化。该禾旨利用M^核糖核苷酸碱基的反应(如包含四种核苷酸(A、 C、 G、 T)至少之一全部或部分作为核糖碱基(ribobase) (rNTP)的扩增反应)。 采用了对耙核Mf寺异的引物。弓卿中的一个或两个具有5'-尾，所述5'-尾带有一 个、两个或更多^^勺3-10个或更多个鹏的序列段，并且带有位于齡序列段 5'-末端的与核糖碱基互补的碱基。序列段可以但不需要是等质量的。扩增导致 引物序列包括其5'部他括入扩增子(即扩增产物)。扩增子也将包含齡的核 糖碱基。为了通过质谱分析法进行分析，使扩增产物经历片段化，例如，通过 暴露于碱。所述的鹏择性地切害螺在齡的核糖碱基3'的DNA主链。因此， 扩增产物中的弓l物序列的整合，以游列段，使得可通过检测序列段的不同质 量而检测产物的存在。弓l物的使用转化为具有拷贝并扩增的序列段的质量的产 物的存在。
为用于多重化，用于多个革E核酸(如不同的等位基因)的引物尾端具有不 同的5，部分序列段，其在切害U后生成不同质量的产物。所有新合成的DNA含有 整合的核糖碱基并因而在经受碱的时候产生片段。为方便解释，可设计整个系 统，从而使得从引物以及其他核酸的杂交部分通常出现的质量信号不同于5'-尾 序列段或其互补体的质量。单个尾中的序列段可以是等质量的，并且可以是相 同序列的(即重复)。重餅歹暇的重复导致了鹏衍生自弓卿与耙核酸退火或 拷贝耙核酸的部分的序列的信号的清晰信号。根据权禾腰求1的方法，其中每个5'部分序列段是等质量的，因而是本发明的 实施方案。
禾聘允许单个孔中具有最少数目的反应步骤的10个或更多个样品的有效多
重基因型分型。所述的步骤通常需要DNA模板和主混合物(mastermix)的混
合。在热循环之后，加入碱溶液，且测量片段化的序列段的质量，例如，通过
质谱分析法。可采用任意已知用于质量测量的方法。当应用质谱分析法时，任
一种类的质谱仪都适合用于分析。
弓,可任逝也包含可去除的3'-末端封闭剂(即，"热启动")以使得相同的
耐热DNA聚合酶能实现'热启动'，从而提高特异性以及允许更^f呈度的多重化。
在实施目前方法的一个实例中，核糖PCR (ribo PCR)可用对于旨耙核 酸(如^SNP，每个等位基因)的DNA样品、两个正向引物以及一个反向 引物实施。正向弓卿设计为特异于一个耙核酸(如一个SNP， 一个等位基因)， 其3'-末端或3'-末端倒数第二个^S特异互补于耙核社的识别碱基。針正向 弓卿具有特异的5'-尾，其包含一个、两个或更多个具有相同质量的序歹暇，其 中針序列段的5'-末端鹏互补于PCR扩增混合物中的核糖核苷酸(NTP)。 序列段的质量设计为在不同的等位基因、SNP以及其他可检测耙核酸中是不相 同的并且可区别的。
为生成具有可区别质量的序列段，弓l物的5，-尾可包含，例如，约2-10个约 为3-10个^^长度的序列段，或约4-7 ^i勺为4^6个^^长度的序列段，或约 2-3个约为7-8个 长度的序列段。
核糖陽PCR (Ribo-PCR)或核糖扩增(ribo國amplification)是具有脱氧核苷酸 以及至少一个核苷酸(核糖核苷酸或rNTP)的混合物的PCR反应或扩增反应。 这种反应的例子是包含dGTP、核糖核苷酸rTTP (即5-甲蟇UTP)、 dCTP以 及dATP，以及在合适缓冲液中有效整合及延伸核糖核苷酸的DNA聚合酶的 PCR混合物。所述的反应可fflil任意延伸反应包括热循环反应来实施。热循环 之后，可以用碱处理反应混合物。所述的碱可以是强碱，例如NaOH或KOH。 所述的碱切害螺在齡的核糖M3'的DNA主链，并导致片段的生成。革巴核酸 的存在导致特异于耙核酸的正向弓嫩的应用并且因此存在扩增的5'-尾序列。拷 贝并切害啲尾的互补体具有独特的质量。所述的质量用于确定测试样品中靶核 酸的存在。对应于被切割的互补，歹啲质量信号的存在被用于鉴定测试样品
17中靶核酸的存在。为用于多重化，应用了许多不同的尾序列，旨尾序列具有
切割后产生特定质量的DNA的M组成。 2、多核苷酸
本发明的多核苷酸包含5，-部分或5，-尾，所述5'-部分或5，-尾包含一个、两 个或更多个串联序列段，以及设计为足够互补以与靶核酸退火以允许核苷酸基 于模板延伸的3'部分。
a 5,-部分
5，-部分或5，-尾包含一个、两个或更多个串联(即邻接的)序列段，M序 列段包含独特的核苷酸碱基(即在该段中仅用一次)，其位于每个序列段的5，-末端。在 的实 案中，5'-部分或5'-尾中的每个序列段具有相等的质量。 在另一个优选的实施方案中，5'-部分或5'-尾中的每个序列段具有相同的(意味 着同样的)的核苷li^列。将具有相同的核苷,列的串辦列段称为重复。 独特的核苷酸碱基可接着最后一个(第二个職三个鄉四个，等等)串辦 列段。例如，具有3个相同质量、每一个4个核苷酸长度的序列段的5'-部分或 5'-尾的序列可以是5'-TAGCTAGCTAGCT-3，(SEQIDNO:3)，其中核苷酸 "T"互补于反应混合物中的核糖碱基。
如同上文的示例，在一些实施方案中，5'-部分或5'-尾的3'-末端核苷酸碱 基互补于反应混合物中的核糖鹏。因为碱性溶液切害螺在齢的核糖M 3' 的键，包括在5'-部分的3'-末端，互补于反应混合物中核糖M的核苷酸^S使 得所有序列段释放。保留在切割的扩增子3'-末端的是齢的具有2'或3'磷酸的 核糖鹏。参见图l。如果5'-部分仅包含一个序列段，贝腰求位于5'-部分3'-末端的互补于反应混合物中核糖碱基的核苷酸碱基。如果两个鞭多个序列段 具有不同质量，则也要求位于5'-部分3'-末端的互补于反应混合物中核糖 的 核苷酸碱基。然而，如果靶互补部分的末端5'-核苷酸也是相同盼'独特"核苷酸 鹏，或者如果5'-部始有两个或更多个相等质量的序列段，贝啦于5'-部分3'-末端的互补于反应混合物中核糖M的核苷酸M是任选的。
在雌的实船案中，附加的核苷酸 &含于5'-部分的5'-末端。附力啲 5'-末端核苷酸碱基可以是任意的碱基。示例性的具有附加5'-末端核苷酸 的 5'-部分可以是5'-NTAGCTAGCTAGCT-3'(SEQIDNO:4)。包括附加的5:末端 核苷酸碱基增加了释放的片段质量的均匀性与准确性。这是因为，当碱性溶液切割紧在齡的核糖碱基3'的键时，2'或3'磷酸部分保持附着于核糖 。参 见图1 。当应用不进行模板非 性延伸的核苷,合生物催化剂时，包含在5'-部分5'-末端的附加核苷酸碱基找到了用途。
在其它雌的实施方案中，5'-部分或5'-尾中的序列段具有相同的质量但序 列不同。例如，具有3个相同质量、每一个四个核苷酸长度的序列段的5'-部分 或5'-尾的序列可以是5'-TAGCTCAGTGCAT-3'(SEQIDNO:5)，其中所述的核 苷酸M^'T'互补于反应混合物中的核糖碱基。
在进一步4，的实施方案中，5'-部分或5'-尾中的序列段可以是不同长度 (如3、 4和/或5个核苷酸碱基)和不同质量的，但当扩增子进行切割时，齡 5，-部分或5，-尾产生可被例如质谱分析法鉴定的可区分的"特征"模式。
5'-部分或5'-尾可包含有如所需的2到约10个序列段，或更多个，例如， 约2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10或更多个串联序列段。每个序列段可以是约3 个到约10个核苷酸M长度，或更长，例如，约3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10或 更多个核苷酸碱基长度。通常，序列鹏长，需要包含于5'-尾中的就越少。相 忠也，序列鹏短，将包含于5'-尾内的就越多。例如，5'-尾可以包含约24个 约7-8个核苷酸鹏长度的序列段，或约4-6 ^^勺4-6个核苷酸m长度的序列 段，或约5-8个约3-5个核苷酸碱基长度的序列段。
多核苷酸用作耙核膨赵申以及扩增反应中的引物。位于每个5'-尾序列段的 5'-末端的独特核苷酸碱基互补于包括在反应混合物中的核糖核苷酸itt，所述 反应混合物用于被本发明的多核苷酸杂交的耙核酸的延伸或扩增。
b, 3,-部分
多核苷酸的3'-部分被设计为具有足够互补以与耙核,列杂交并延伸的核 ,列。3'-部分如所需的至少是5个核苷酸鹏长度，且可以更长，例如，约 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45或50个核苷酸碱基长度。3，画部分的3，陽末端 或3'-末端的(-1)爽-2)位核苷酸 ，可根据本领域已知的方法，用于区分耙核 酸中的特定等位基因或SNPs。示例性的例如用于弓卿延伸或热循环的反应^f牛 包括约50mMA42-羟-U-二羟甲基乙基]甘氨酸-KOH (丁ricine-KOH)， pH7.5， 100mMKOAc， 3.0mMMg(OAc)2，以及200nM的各种dNTP;退火或杂交 鹏 可以为约5(TC-70°C，例如为约60^5"C。
在iM的实施方案中，3'-部分的3'-末端任选地具有封闭基团^m闭部分，
19其可鄉也阻止多核苷酸的延伸。示例性的可3l^t闭部他括附着于3'-鄉核苷 酸的2'位置的取代基(即2'终止子)。在特别优选的实施方案中，2'-终止子部分 是磷酸或磷酸类似物，例如甲基氨基磷酸。
通常，在糖部分2'位置利用的封闭基团(BG)可包括各种不同的实施方案。
的，例如，所述的BG是负电荷基团柳駄^IR基团。为进一步解释说明， BG任iMki^自如CN、 N02、 N3、卣基团、醚基、縫、羧酸基团、酯基团、 氨基基团、OCH3、 OCH2COOH、 O-甲硅烷醚基团、酮基基团、O内酯基团、 0-烷基基团、O-环烷基基团、0-| ;希基基团、O-'鹏(alkynl)基团、氮基甲酸 酯基团、 胺基团、醐安基团及其组合。更特别地，BG任;^i也包含式(I):
其中Q是O、 S或NH; X是H、 OH、 CH3、 BH3、 F或SeH;并且Z是O、 S或Se。为进一步解释说明，BG任选地包含式(m):
其中Q是O、 S或NH; X是O、 S或NH; Z是O、 S或Se;并且R是烷 基基团、链烯基基团或炔基基团。在另一个示例性雌的实施方案中，BG包含 式(IV):
在其它 的实 案中，BG包含式(E):Z
X——L-R
其中Q是O、 S或NH; X是O、 S或NH; Z是O、 S或Se; L是 -CONH(CH2)nNH-、國國CO(CH2)nNH-誦、或-CONH(CH2CH20)nCH2CH2NH-; n 是大于零的整数，并且R是NH2、 SH、 COOH、猝灭部分、报道部分、生物素 或亲和部分。
示例性有用的2'-终止子核苷飽括2'-单磷酸-3'-羟基-5'-三磷酸核苷以及 2，-单磷酸-3，-羟基-5，-二磷酸核苷。2'-终止子可逆封闭基团详细描述于，例如美 国专利公开Nos. 2007/0219361以及2007/0154914。
本发明的多核苷酸可任选地含有非天然存在的核苷酸主链键、核苷酸碱基 以及核苷酸碱基类似物，如本发明所述。多核苷酸可以是单链^5l链的。在优 选的实施方案中，多核苷酸在它们的全长均是单链。多核苷酸可以含有但时常 不含有任何标记，例如附着的荧光团、放射性同位素、酶或其它鉴定剂。多核 苷酸可以是分离的、合成的或重组的。多核苷酸，包括5'-和3'-部分，可以是任 意长度的并且通常是约200个核苷酸颇短，例如，约150、 125、 100、 75、 50 或25，或更少的核苷酸长度。
3、检测方法
a 4吏革巴核酸与本发明的多核苷酸接角虫
实施检测方法的第一步涉及将耙核酸与本发明的多核苷酸、核苷酸集以及 核苷M合生物催化组分接触。 i.核苷,
用于本方法的核苷 包含至少一个核糖核苷酸 形式的 (如A、U、 G或C或另一个核糖核苷酸，rNTP)。在一些实施方案中，核苷麟含有至少 两个核糖核苷酸碱基形式的碱基。所述的一个或多个作为核糖核苷酸 被包 括的MS，可以是全部(如100%的核糖核苷酸)或部分地(如少于100%的核 糖核苷酸，如碱基的残余部分是脱氧核苷酸或dNTP)作为核糖核苷酸^S被包 括在核苷酸集中的。在 的实施方案中， 一个或多个核苷酸tt以大部分作
21为核糖核苷酸(rNTP)存在，即 150%，如60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%，以及以小部分作为脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在(即少于50%)。在特 别优选的实施方案中，至少一种核苷酸碱基的至少80%是核糖核苷酸的形式。 一个或多个核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸一起被包括在内以完成完整的核苷酸 集(A、 T、 C和G核苷酸存在)。 ii.生物催化组分
本发明的方法采用的核苷,合生物催化组分包含脱氧核糖核苷酸和核糖 核苷M合活性。在优选的实施方案中，相同的催化结构域可催化脱氧核糖核 苷酸禾啦糖核苷酸齡活性。在其它雌的实施方案中，生物催化组分包含至 少两个催化结构域， 一个具有脱氧核糖核苷酸整合活性，另一个具有核糖核苷
适合用于本发明方法的示例性生物催化组分包括，但不限于，作为修饰的 Z05、 CS5、 CS6或Taq聚合酶的聚合酶。CS5、 CS6嵌合聚合酶进一步描述于， 如美国专利申请公开No. 2004/0005599。栖热菌属(7 2emm)物种Z05已在PCT 国际专利公开No. WO 92/06200中公开。示例性的修饰酶包括，如G46EE678G CS5DNA聚合酶、G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶、G46EL329AD640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329AT606S D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46EE678GCS6DNA聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶等等。 例如相对于缺乏一个或多个这些突变的酶，这些修饰的酶包括增强核糖核苷酸 齡的、以及增强核糖核苷酸2'-斷布类似物齡的、禾口/或减少或消除5'-3'外 切核酸酶活性的突变，。
涉及有用的核苷酸整合生物催化剂的其它细节也在如美国专利申请Na 11/873,896以及美国专利Nos. 5,939,292、 4,889,818、 5,374,553、 5,420,029、 5,455,170、 5,466,591、 5,618,711、 5,624,833、 5，674,738、 5，789,224、 5,795,762、 7,148,049以及7,179,590中提供。
可通过各种方法，如位点定向诱变、化学修饰等，来完成具有如整合核糖 核苷酸以及2'-终止子核苷酸的增强效率或其他所需性质的修饰酶的生产。更具 体地，位点定向诱变通常通过位点特异性弓,指导的诱 完成。这种技术可 采用除了代表所需突变的都艮错配外互补于待诱变的单链噬菌体DNA的合成 寡核苷酸引物来实施。简而言之，合成的寡核苷酸用作引物以指导互补于质粒或噬菌体的链的合成，并且将所得的双链DNA转化进入支持噬菌体的宿主细 菌。所得的细菌可舰如DNA序列分析或探针杂交来测定，以鉴定那些携带所 需突变基因序列的噬菌斑。为进一步解释说明，也可利用许多其它的修饰核酸 的方法，诸如"重组PCR"方法。
在本发明的实践方面(如生产修饰的酶、实施测序反应等等)，任i^t也应用 ^f生物学以及重组DNA的许多常规技术。这些技术是公知的并且解释于，例 如，Q/w加尸ratoco^ /" Mo/ecw/ar 5,o/ogy,1997-2007(F.M.Ausubel编辑),Wiley Interscience;Sambrook等,2001jM /ecw/ar C/o"/"- /aZ)orato y Mo^wa/,第三 脱Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y;Berger禾卩Kimmel, GW<afe to M /ecw/ar C7o"/"g 7fec/2"—es A/e&Ofis1 ￡h^>wo/ogv巻152 Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger)^DA64 C7cra) g:^4尸rac"ca/ ^4pjwoac/7,巻I禾卩 n,1985(D.N.Glover ed);(9//gowwc/eofefe S>^/2a^,1984(M.L.Gait ed); 7Viwc/e/c爿c/d /^^r/<^a^'ow, 1985,(Hames禾口 Higgins);rraracn)^o" <m/ 7h3m7af/ow, 1984(Hames禾口 Higgjns eds.);4幽a/ Ce〃 Q^,，1986(R.I.Freshney ed); //w膨緣!ze(i Oto朋d E^was,1986(IRL Press); Perbal,1984^4尸rac"c"/ Gw/(ie to M /ecw/ar C7ow/"g;系 歹U 5Mef/20<is 五"^ymo/ogv(Academic Press,Inc.);Ge"e 7hm^r Kctora Afomma//^ Ceto,1987(J.H.Miller禾卩MPCalos编辑，Cold Spring Harbor Laboratory); A/e^o^fe ￡> ^vmo/ogy巻154禾口巻155(分另lj为Wu禾口 Grossman,以 及Wu，编辑)。
ni.多核苷酸
用于本方法的5'-加尾的多核苷酸如上文和此处描述。在 的实施方案中， 耙核酸与许多(如两个或更多个)5'-加尾的多核苷酸相接触。在其它优选的实 施方案中，这些许多多核苷酸中的每一个通过具有包含一个、两个或更多个等 质辦列段的5'-部分分另哋可识别。在此情况下，齡5'-加尾的多核苷,补 序列的扩增子或互补体的片段化产生不同的质量信号或牛寺征质量概况。在迸一 步优选的实施方案中，多核苷酸作为一个或多个弓卿对与耙核酸相接触。弓卿 对中的一个或两个多核苷酸可包括包含串联序列段的5'-尾。还可以提供作为一 个或多个弓l物对与耙核酸接触的多重多核苷酸，其中弓l物对中的每个弓卿包含 含有相同质量的串联序列段的5'-部分。在此情况下，用于产生扩增子的引物对 中每个引物的5'-部分的互补体的片段化生产更大(如，约两倍)强度的单质量信号。备选地，引物对中的每个弓卿可包含一个序列段，引物对中每个引物中 的序列段是相同质量的。
在方法的 实施方案中，5'-加尾的多核苷酸可包含具有不同质量的一个 序列段以产生可检测的切害U产物。 iv.耙核酸
革巴核酸可来源于任意来源，如来源于动物、植物、细菌鹏毒的组织样品，
或者可以是例如从反应混合物合成的。耙核酸可以是，如基因组DNA、染色体 或染色体节段、mRNA、 cDNA、载体(如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA 聚合物、聚合酶链反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针、引物等等。靶核酸 可以是，如单链、双链、三链等等，并且不限于任何特定的长度。用于本发明 方法的靶核酸时常地将包含一个或多个单核苷酸多态性(SNP)、插入、缺失、 置换或其它辨别特征。革巴核酸通常在样品中提供。
在优选的实施方案中，以辨别一个或多个SNPs的目的接触革E核酸(即实施 的方法)。在这样的应用中，采用了至少两个不同的等位基因-辨别性5'-加尾的 多核苷酸，它们的3'-部分不相同，从而使得它们特异性地与特定等位基因退火， 并且，它们的5'-部分也不相同，从而使得一个或多个序列段具有对应于并独特 地鉴别被3'-部分结合的等位基因的质量。
在其它优选的实施方案中，以检测靶核酸中一个或多个稀有突变的目的接 触靶核酸。在这样的应用中，存在一个或多个具有特异性与靶核酸中特定位置 的突变退火的3'-部分的多核苷酸(具有特异性与野生型在相同位置退火的3'-部分的多核苷酸，可任选地存在于相同或分开的反应中)。当评估耙核,列中 的一个突变时，可以应用一个、两个或更多个区分不同突变的5'-加尾的多核苷 酸，其在3'-部分不同，从而使得它们特异性与野生型或一个或多个突翅退火， 并且，它们在5'-部分也不同，从而使得一个或多个序列段具有这样的质量，所 舰量对应于并独特地鉴别被3'-部分结合的等位基因。在评估一个耙核酸中的 两个或更多个突变的应用中，具有特异性检测耙核酸中第一位置的突变的3'-部 分的多核苷酸，可以具有全部是第一质量的5'-部分序歹煅；具有特异性检测耙 核酸中第二位置的突变的3'-部分的多核苷酸，可以具有全部是第二质量的5'-部分序列段。备选地，多核苷酸5'-部分序列段的质量可以彼此不同，作为独特 的鉴定剂操作。在其它 的实施方案中，如那些涉及多重扩增^伸的，作为两个或更
多个弓,对提供多核苷酸。在第一引物对中，引物对中的齡弓l物的5'-部始 有第一质量的序列段;第二弓卿对中針弓l物的5'-部始有第二质量的序歹峨， 其可检测地不同于第一质量；第三弓,对中針弓胸的5，-部船有第三质量的 序列段，其可检测地不同于第一和第二序列段的质量；后续引物对中每个引物 的5'-部，含具有可检测地不同于前面所有的或其它弓l物对的质量的序列段。 弓l物对的数目以及扩增或延伸反应受反应混合物中游离核苷酸碱基可用度的限 制。在一M^的实驗案中，反应混合物可包含有2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20或更多引物对。这种策略允许多个耙核酸或单个耙核酸当中的多个 靶的并行检测。
b.扩增革E核酸以生产扩增子
l扩增方法
可采用一个或多个本发明的多核苷酸，应用本领域已知的任意的多核苷酸 延伸或扩增的方法来扩增耙核酸。应用聚合M反应(PCR)的任意己知变化， 包括RT-PCR、定量PCR、多重以及实时PCR的扩增在本发明的方法中是有用 的。扩增也包括了等温扩增方法和本领域已知的多核苷ME伸方法。实施PCR 的规程是本领域所熟知的，且其描述于，例如PO 尸hmerv4I^orato^M朋^^ Dieffenbach禾口 Dveksler,编辑,2003,Cold Spring Harbor Laboratory Press;爿-Z q/" 0/07 故加've尸C尺,Bustin，编辑,2004,Intemational University Line; EdwardsrRea/-7l, 尸C7 .vlw _&扁如/ Gw/cfe，2004，Taylor& Francis; Wea/ 7 ,尸C尺Do喊ed.,2006, Taylor & Francis;尸CA尸rotoco&:爿Gw/<afe to Me^o<iy朋c/ ^4p/ //caft'ora, Innis,等,编 辑，1990,Academic Press, San Diego;PO Srrategz^,Innis,等,编辑,1995,Academic
编辑，1999,Academic Press,San Dieg。耙核酸扩增跑正伸足够的时间量或足够 数目的循环以产生可检测量的扩增子。
如上文所讨论那样，可扩增一个或多个耙核酸，或者可扩增单个耙核酸中 的一个或多个耙位置。由于基本上对具有可区别质量的序列段的不同5，-部分的 数目没有限制，所以方法特别适合于多重扩增测定。 一个或多个用于扩增靶核 酸或耙核酸中特异位置的多核苷酸可具有不同的带有唯一可识别质量序列段的 5'-部分。用作引物对的多核苷酸对可具有带有相同质量的序列段的5'-部分。在
25具体的实施方案中，序列段共有相同的序列。多重扩增测定可并行确定至少5、 10、 20、 25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100个颇多个不同革巴核酸鄉巴核 酸中的位置的存在(或不存在)，如同所需的那样。
本发明的扩增以及多核苷酸延伸反应采用生物催化单位(如聚合酶)，其包 括齡核糖核苷I^A待延伸核勝连的酶活性(如，"核糖-PCR"、"核糖-扩增"或'核 糖-延伸(ribo-extension)")。示例性的具有核糖核苷酸整合活性的生物催化单 位包括G46E CS6R DNA聚合酶以及KB17 DNA聚合酶，其可从Roche Molecular System获得，并描述于，例如Mauger等^wcfe/c爿c/A 仏warc/2(2007)35(8):e62以及Mauger等^wc/e/c爿c她尺e犯arc/2 (2006)34(3):el8。 可用的其它生物催化组分在上文以及此 行了讨论。也可参见美国专利No. 5，939，292。
ii.扩增子产生
耙核苷,歹啲扩增将产生双链的扩增子，其中互补于多核苷酸5'-部分的 扩增《将包括含有一个或多个序列段的3'-部分，其中序列段的3'-^核苷酸 M^含有^的核糖核苷单磷酸(rNMP)。
c.切割jf增子
可应用本领域已知的任意方法切割扩增子的序列段。在根据本发明的ttit 实施方案中，通过使扩增子经受碱(即碱性溶液)，在整合的NMP3，的键切割 扩增子。扩增子tt^暴露于碱性溶液以被切割，特别地是暴露足以实现切害蝤 合的NMP3'的键的时间段和温度。通常，温度越高，碱处理所需的时间,短。 例如，切割或片段化步骤可在7(TC施行约1.5小时，或在约55。C施行约8小时 (即过夜)。碱鹏纟鹏可以低至冷冻、鹏(如4"C)以及高至邻近沸点纟鹏(如 约95。C)。在优选的实施方案中，碱性溶液可以是pH大于约8.5的任意溶液， 例如，pH至少是约9.0、 9.5、 10.0、 10.5、 11.0、 11.5、 12.0、 12.5、 13.0顿高。 在一些实施方案中，碱性溶液将包含至少约0.2M、 0.3M、 0.5M、 0.8M、 1.0M 或更多的碱性化合物。
碱性溶液将通常含有至少一种强碱。在一些实施方案中，可采用弱碱，例 如，如果以较高浓度包含在碱性溶液中的话。通常，碱性溶液将包含至少一个 具有约5.0或更小pKb的碱性化合物，例如，约4.5、 4.0、 3.5、 3.0、 2.5、 2.0、 1.5、 1.0、 0.5或更小的pKb。示例性的用于在M的NMP3'的键片段化扩增子的碱性化合物包括，例如NaOH、 KOH、 RbOH以及NH4OH， tfci^NaOH、 KOH 或NH4OH。其它的自碱性化合物也可^ffl。参见例如Mauger等Wwcfe/"d^/ i^earc/z(2007)35(8):e62以及Mauger等^wc/e/c爿c/A Ae犯arc/z (2007)34(3):el8的
碱鹏呈序。
d.检测扩增子片段
可应用本领域已知的任何方法来检测扩增子片段或切割且释放的序列段。 在 的实施方案中，通过质量鉴定来检观彻割的片段。序列段也可在切割之 前或之后例如用荧光团或放射性同位素进行可1^测地标记。可在5'-末端或3'-末端或在从头到尾的任意的核苷酸 标记片段。示例性的检测方法包括但不
限于质谱分析法、电泳分离、时间分辨荧光检测、自旋共振检测以及带有之
后的检测的与固相(如阵列)杂交。
在 的实施方案中，采用质谱分析法检测从扩增子释放的切害啲序列段。
质谱分析法方法是本领域所熟知的。任何质谱分析法技术均可应用，包括例如
激光解吸电离质谱分析法(如基质辅助激光解吸电离质谱分析法(MALDI)， 以及表面增强激光解吸电离质谱分析法SELDI)、气相离子光谱测定法、气相层 析质谱分析法、串联质谱分析法以及其他质谱分析法技术。质谱分析法方法是 本领域所熟知的，并描述于例如Gross^oxs S,/r騰吵:」7MooA:,2006, Springer Verlag; 以 及 Dass斥"6famewtoZy q/" Co"tew/ ora^v Mks1 ^ec加膨吵,2007,Wiley Interscience。
检测的扩增子片段可以是AAS补于或扩增自多核苷酸5'-部分的扩增子的切 割的序列段。当然，应当理解可切害啲序列段可从扩增子长度从头至幅产生。 在碱性条件下，紧在已齡核糖核苷酸处3'的HJS行切割。在雌的实施方案 中，扩增子片段可从扩增的耙核酸检测(如，AAS补于多核苷酸3'-部分的序列 段)。如所需的，可检测从多核苷酸的5'-部分和/或3'-部分或其互补体切害啲序 列段。来自检测的扩增子片段的信号产生指示待鉴定耙核酸的,寺征。
4、反应混合物
本发明也提供了本发明方法涉及的反应混合物。可产生上文所描述的任意 反应混合物。示例性的反应混合物包括，例如 一个或多个本发明的多核苷酸， 其包括包含一个、两个或更多个串辦列段的5'-部分或5'-尾，以及设计为足够 互补以与耙核酸退火的3'-部分；包含dNTP的核苷,，其中至少一种M的
27大多数是核糖核苷酸；以及具有核糖核苷酸整合活性的生物催化组分。在一些实施方案中，反应混合物包含一个或多个革巴核,列。本发明的反应混合物还可包含通过本发明方法所生产的扩增子，所述的扩增子包含具有互补于本发明多核苷酸5'-部分的序列段的3'-部分，其中每个序列段的3'-末端核苷酸 是核苷一磷酸(NMP)。本发明的反应混合物ttit包含含有与多核苷酸相同的5'位置的扩增子。反应混合物中的许多多核苷酸可以作为多核苷酸对提供，如引物对，其中每个多核苷酸对中的每个多核苷IM^包含等质量的5'位置序列段。反应混合物中组分的实M案在上文以及此处描述。
在优选的实施方案中，反应混合物包含两个或更多个引物对。在第一引物对中，引物对中的每个弓嫩的5'-部分包含具有第一质量的序列段；第二引物对中齡弓l物的5'-部他含具有第二质量的序列段，其可检测地不同于第一质量-,第三弓,对中每个弓卿的5，-部他含具有第三质量的序列段，其可检测地不同于第一和第二序列段的质量；后续弓卿对中針弓卿的5'-部他含具有可检测地不同于前面所有的或其它弓l物对的质量的序列段。在特别优选的实施方案中，反应混合物可包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20或更多引物对。
在其它优选的实施方案中，反应混合物包括核苷酸集，其包含非常规或非天然存在的核苷酸鹏或标记的核苷酸碱基，如带有荧光团^^鄉性同位素。反应混合物也可如需要的那样包含缓冲组分和盐。在其它优选的实施方案中，反应混合物包含碱性组分，如上文所述，例如NaOH或KOH。与此处描述的方法相一致， 一般已将含有高浓度的碱性组分(如约0.1M-0.2M或更高)的反应混合物进行扩增。
进一步im地，反应混合物包含由本发明的方法所生产的扩增子以及碱性组分，如本文所描述。5、试剂盒
本发明还提供了用于本发明方法的试剂盒。 一般地，为使用方便，试剂盒进行了区室化并含有提供实施本发明方法的组分的容器，例如， 一个或多个本发明的核苷酸，其包括包含一个、两个或更多个串辦列段的5'-部分或5'-尾，以及设计为足够互补以与耙核酸退火的3'-部分；包含dNTPs的核苷酸集，且其中至少一种減基的大多数是核糖核昔酸；以及具有核糖核苷酸整合活性的生物
催化组分。在^她的实施方案中，试剂盒包含一个或多个耙核,列，包括对照核酸序列(用于阳性和/或阴性对照)。试剂盒可以提供实施分离的对照反应的试剂，包括对照多核苷酸和对照靶核酸序列。试剂盒中许多多核苷酸可以作为多核苷fet如弓l物对而提供。试剂盒中组分的实施方案如上文和此处所述。
在4，的实旅方案中，试剂盒包含两个或更多个引物对。在第一引物对中，引物对中的齡弓胸的5'-部她含具有第一质量的序列段；第二引物对中齡弓卿的5，-部他含具有第二质量的序歹暇，其可检测地不同于第一质量；第三弓嫩对中齡弓嫩的5'-部分包含具有第三质量的序列段，其可检测地不同于第一和第二序歹暇的质量；后续弓l物对中針弓嫩的5'-部他含具有可检测地不同于前面所有的或其它引物对的质量的序列段。在特别优选的实施方案中，试剂盒可包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20或更多引物对。
还可以包括一个或多个附加的提供附加试齐啲容器。这样的附加容器可包括被熟练技术人员识别的、用于根据上文所述方法的引物延伸或扩增程序的任意试剂或其它成分，包括用于如核酸扩增程序(如PCR、 RT-PCR)、 DNA测序禾，或DNA标记程序所用的试剂。在其它的非互斥的变体中，试剂盒包括一个或多个提供游离核苷酸(常规的和/或非常规的)的容器。在具体的实歸案中，试剂盒包括a^t代磷酸酯dNTPs、 dUTP、 dTTP禾口/或标记的dNTPs诸如，如荧光素-或花,染料家族dNTPs。在其它的非互斥变体中，试剂盒包括一个或多个提供适合弓l物延伸反应的缓冲液的容器。在 的实施方案中，试剂盒包含碱性组分，如上文所述，例如NaOH或KOH。
6、 扩增子
本发明还提供了本发明方法产生的扩增子。PCR扩增子，例如，通常皿链的并且包含互补于本发明多核苷酸的链。扩增^&含互补于本发明多核苷酸5'-部分的3'序列段，其中所述扩增子的3'序列段包含至少一个、两个或更多个序列段，其中所述序列段的3'-末端核苷酸鹏是具有与用于生产扩增子的核苷自中的NTP相同的itt的核苷一磷酸(NMP)。
7、 系统
本发明进一步提供了自动实施本发明方法的系统。所述系统包含至少一个包含组合物的容器或支持物，所述组合物含有本发明的多核苷酸或扩增子或反应混合物；配置以在一个或几个温度与包含所述多核苷酸或扩增子的组合物热交流的热调节器(如核酸热循环纟几器；培养箱)；至少一个转移试剂至容^l^:
29持物或从容器或支持物转移试剂的试剂转移装置；以及至少一个配置以检测片段化的序列段质量的检测器(如质谱仪；荧光计)。在雌的实施方案中，系统包含至少一个与热调节器、试剂转移装置和配置以检测质量的1^测器的至少一个可操作交流的控制器。
实施例
下面的实施例提供来解释说明而不限制本发明。实施例1-用于高通量SNP基因型分型的Flag-标签
制备含有人类H19基因中SNP的扩增子用于分析。靶序列是gtgagga卿ggagtaggyGCCCAGGCATCGTGCagacagggcgacatcagc(SEQ IDNO:ll)(小写字母指示与弓l物退火的序列，'y'指示SNP位置，C或T)。在20^1的总体积中实施PCR，其中2^1来源于稀释至10ng/Ml的基因组DNA样品。PCR扩增含有下述组分50mM A42-羟-l,l-二羟甲基乙基]甘氨酸,pH7.5、 100mMKOAc、 2.75mMMg(OAc)2、以及1.6%的存储缓冲液，其依次含有50%体积比的甘油、100mM KC1、 O.lmM EDTA、 20mM Tris pH8.0、 ImM DTT以及0.5yoTween20。还包括在PCR内的是各0.2mM的5-甲基-dCTP和dGTP、0.4mMdUTP、 0.18mMrATP、 0.02mM dATP以及0.1mM焦磷酸。核苷酸MS混合物含有90%rATP和10%dATP。 PCR扩增中应用的酶是0.02U/|nl尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)以及20nMGLTDSEDNA聚合酶。参见例如，PCT
发明者D·H·盖尔芬德, F·莫杰, I·G·古特, K·A·鲍尔 申请人:法国国家基因中心;霍夫曼-拉罗奇有限公司