专利名称：来源于谷氨酸棒杆菌的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及具有启动子活性的核苷酸片段及其应用。
背景技术：
棒杆菌属于革兰氏阳性菌。 一些棒杆菌作为工业微生物在生物工程领域里广泛 应用，可以用来生产多种化学物质，例如氨基酸和核苷酸，L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨 酸、L-色氨酸、肌苷酸等。氨基酸和核苷酸可用作药品、食品、食品添加剂、动物饲料。经 过物理和/或化学方法诱变处理得到的棒杆菌突变株具有较强的合成上述有用物质的能 力，而通过遗传工程和/或代谢工程对棒杆菌野生菌株或突变株进行改造，可以获得具有 更高生产强度的菌株。这种遗传工程的基本操作即是在棒杆菌中表达涉及多种代谢途径 的基因。通常基因都是在启动子控制下表达，其表达强度依赖于启动子元件。已经在棒 杆菌基因组、棒杆菌带有的质粒以及棒杆菌噬菌体中分离出33个具有启动子活性的核苷 酸片段，这些核苷酸片段中包括一些已知基因的启动子。例如，amt、 argS、 fda、 g即基因 等((P6tek M et al. ， Journal ofBiotechnology 104:311-323,2003)。来自大肠杆菌、 链霉菌和枯草芽孢杆菌的启动子能够在棒杆菌属细菌中表达，说明棒杆菌中的mRNA聚 合酶既可以识别来自革兰氏阳性细菌，又可以识别来自革兰氏阴性细菌中的多种启动子 (Martin J F et al. ， Nature Biotechnology 5(2) : 137-146， 1987)。大肠杆菌trp操纵子 的operator-r印ressor系统在谷氨酸棒杆菌中仍然有功能，并可以被喷哚乙酸(IAA)所诱 导。Tsuchya等利用大肠杆菌的lac和A噬菌体PKPt operator-r印ressor系统，在棒杆 菌中表达了氯霉素乙酰转移酶(Tsuchiya M & Morinaga Y， NatureBiotechnology 6(4): 428-430,1988)。 Liebl等使用tac启动子和lacl构建了可诱导的大肠杆菌_谷氨酸棒 杆菌穿梭表达载体，大量表达了金黄色葡萄球菌的核酸酶(Liebl W et al.， Journal of Bacteriology 174(6) :1854-1861， 1992)。已知trc启动子可以在棒杆菌属细菌中显示活 性(Patek M et al. Journal ofBiotechnology 104:311-323,2003)。在谷氨酸棒杆菌中 构建的表达系统大都使用了大肠杆菌中的强启动子，例如Ptrp、PlacUV5、Ptac等。
但是，由于大肠杆菌的启动子在棒杆菌中有泄漏阻遏，以及有关诱导物在较低浓 度下不易穿过棒杆菌的细胞壁等原因，因而在实际生产中其应用还很有限。仍然需要从谷 氨酸棒杆菌中筛选可受各种物理化学因子诱导的严谨的启动子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种启动子。 本发明提供的启动子是从谷氨酸棒杆菌基因组分离得到的核苷酸片段并且具有 启动子活性。本发明中的术语"启动子"系指DNA上一段序列，RNA聚合酶结合到该序列上， 可以起始基因的转录。 所述启动子的核苷酸序列是如下1)或2)或3):
1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；
2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序 列； 3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序 列。 所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7.2，7%SDS)中，65t:预杂交30min ;弃预杂交液，加入杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓 冲液，pH7.2，7% SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65t:杂交12hr ;弃杂交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7. 2， 5% SDS) ，65。C洗膜2次，每次30min ;加入洗膜液 II (20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7. 2， 1% SDS) ，65。C洗膜30min。本发明的启动子活性片段还包括与来自SEQ ID NO. 1的片段的核苷酸序列互补的
核苷酸序列。这里使用的术语"互补的"系指遵循碱基配对原则产生的之意。 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方
法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得
到的启动子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活
性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。 这里使用的术语"同源性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同源性"包括与本发 明的启动子核苷酸序列具有优选地75%或更高，更优选地85%或更高，甚至更优选地90% 或更高，以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％ )表示，其可 以用来评价相关序列之间的同源性。 含有上述的启动子的重组载体也属于本发明的保护范围之内。 上述重组载体是上述的启动子插入载体pAKC6多克隆位点制成的重组载体。 含有上述的启动子的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。 含有上述的启动子的重组菌也属于本发明的保护范围之内。 上述重组菌是含有上述启动子的原核细菌，所述原核细菌是如下1)或2)或3):
1)棒杆菌属细菌
2)埃希氏菌属细菌 3)棒杆菌属或埃希氏菌属细菌经诱变得到的突变菌株。 本发明的启动子活性片段除了在棒杆菌属细菌中具有活性外，还在埃希氏菌属细 菌中具有活性。本发明中所指的棒杆菌属细菌可以是该属的任何细菌，例如谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032，钝齿棒杆菌AS 1. 542和北京棒杆菌AS 1.299等等。但是，棒杆菌属细菌不限 于此，还包括由棒杆菌属细菌经各种物理的或化学的方法诱变得到的突变菌株。本发明中 所指的埃希氏菌属细菌包括大肠杆菌。 本发明的另一目的在于提供上述的启动子在棒杆菌属或埃希氏菌属细菌中启动 目的基因表达中的应用。 上述目的基因可为氯霉素乙酰转移酶基因。 含有上述启动子的重组棒杆菌或埃希氏菌通过常规技术可以生产氨基酸和核苷 酸等，如L-谷氨酸丄-赖氨酸丄-苏氨酸丄-色氨酸、肌苷酸等可用作药品、食品、食品添加 剂或动物饲料。
实验证明来自SEQ ID NO :1的启动子活性片段在棒杆菌属细菌中具有与trc启 动子(SEQ ID NO :2)相当的活性。
图1为鸟枪法克隆谷氨酸棒杆菌10147基因组中启动子活性片段。
图2为带有trc启动子的启动子探针载体构建图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。 术语"tac"启动子系将大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子的-35区与大肠杆菌乳糖 操纵子的-10区，乳糖操纵子中的操作基因部分以及SD序列融合而成，-35区与-10区间 隔16个碱基。已知tac启动子是非常强的启动子。术语"trc"启动子系在"tac"启动子 的-35区和-10区之间插入一个碱基构建得到，其-35区与-10区的间隔为17个碱基。已 知在大肠杆菌中trc启动子的活性是tac启动子的90X。 (Brosius J et al. ，The Journal of Biological Chemistry 260(6) :3539-3541)。 LB培养基每升培养基含胰蛋白胨10g，酵母粉5g， NaCl 10g，用蒸馏水定容至1升。 实施例1、获得具有启动子活性的DNA片段
—、培养谷氨酸棒杆菌10147并提取基因组DNA
1、细菌的培养 挑取谷氨酸棒杆菌10147 (棒状类细菌电击转化中多种条件对转化效率的影响沈 天翔等生物工程学报11(3) :245-279 1995)(该菌株可在中国科学院微生物研究所得到， 具体见保证函)单菌落接种于3ml LB培养基的试管中，置于3(TC的摇床上300rpm过夜培 养，该培养液作为种子液。取种子液400 i！ L接种于30mlLB培养基的三角瓶中，置于30°C的 摇床上300rpm过夜培养。 2、谷氨酸棒杆菌10147基因组DNA的提取 10000rpm离心5min收集步骤1中过夜培养的菌体，用5ml溶液I (50mmol/L葡萄 糖，25mmol/L Tris-HCl pH8. 0， 10mmol/L EDTA pH8. 0)洗菌两遍。菌体用4. 5ml溶液I悬 浮，加溶菌酶至其终浓度为10-15mg/ml，悬浮液于37t:处理l_2h。加0. 5mll0% SDS，振荡 混匀至透亮。然后加lml 5M NaCl，于4t:放置lh。剧烈振荡离心管多次，至溶液呈乳白色。 13500rpm，4。C离心30min。等体积酚仿抽提3次，14000rpm，离心10min，取上清。加2倍体 积无水乙醇，用玻璃棒搅出丝状沉淀，该沉淀即是基因组DNA。然后用70%乙醇洗涤一遍， 将沉淀风干后溶于lml TE(10mM Tris-HClpH8. 0， lmM EDTA pH8. 0)中，加适当RNase处理 RNA。 二 、筛选获得启动子片段 采用鸟枪法，利用启动子探测载体从谷氨酸棒杆菌10147基因组DNA中筛选具有 启动子活性的DNA片段，筛选启动子的过程参见图1。 用限制性核酸内切酶Sau3A I完全酶切谷氨酸棒杆菌10147的基因组DNA，将CN A Sau3A I片段与经过限制性核酸内切酶Bgl 1I酶切的启动子探测载体pAKC6(谷氨酸棒杆 菌/大肠杆菌穿梭型启动子探针载体的构建李开等，微生物学报200747 (2) :191-196)连接 (Sau3A I和Bgl II属于同尾酶)，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(Sambrook J，Fritsch E，Maniatis T分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫，等译.第二版.北京科学出版社， 1989)，转化液涂布于含60 ii g/mL氯霉素的LB平板进行初筛；于37。C温箱培养24h后，用 牙签挑取转化子点种于含400 ii g/mL氯霉素的LB平板进行复筛，于37。C温箱培养24h ;从 能够生长的转化子菌落中提取质粒，使用SEQ ID N0:3和4引物进行PCR反应分析，反应 条件94。C 2min ;94。C 30s，55。C lmin，72。C 3min，30个循环；72。C 10min。挑取插入片段小 于600bp的转化子，然后从这些转化子中提取质粒电击转化谷氨酸棒杆菌10147的感受态 细胞(Liebl W et al. ，Brosius J et al. ，FEMS Microbiology Letters, 65 (3) :299—304， 1989)，转化液涂布于含50 i！ g/mL卡那霉素的LB平板以筛选转化子。将转化子点种于含 30 g/mL氯霉素的LB平板以筛选带有插入片段的转化子，于3(TC温箱培养24h，从能生长 的菌落中提取质粒，再次进行PCR反应分析。同时以pAKC6为对照进行相同操作。结果，得 到30个具有启动子功能的活性片段。该结果表明，根据本发明的实施方案的启动子活性片 段在大肠杆菌和棒杆菌属细菌中都显示活性。
实施例2、检测分析启动子片段
—、启动子活性片段的DNA序列测定 提取实施例l(二)中的30个具有启动子功能的活性片段的质粒DNA，分别使用人 工合成引物SEQ ID N0:3进行启动子活性片段的DNA序列测定，得到30个DNA序列。本专 利涉及的启动子序列是SEQ ID N0:1。
二、总蛋白含量的测定
1)粗酶液的制备 制备序列SEQ ID NO :1所示的DNA片段。 将该片段与经过内切酶Bgl 1I酶切处理的启动子探测载体pAKC6连接，采用氯化 钙法(Sambrook J， Fritsch E， Maniatis T分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫，等译.第 二版.北京科学出版社，1989)转入大肠杆菌DH5a ，筛选阳性克隆，使用引物SEQ ID NO: 3和SEQ ID N0:4进行PCR、测序鉴定。测序结果表明扩增的目的片段的序列与SEQ ID NO :1相同。 提取上述阳性克隆的质粒DNA，电击转化谷氨酸棒杆菌10147的感受态细胞，然后 将转化液涂布于含30 g/mL氯霉素的LB平板上筛选转化子，提取质粒，PCR鉴定后，将鉴定 正确后的谷氨酸棒杆菌单菌落接种于液体LB培养基，置于3(TC摇床培养16h， lOOOOrpm离 心5min收集菌体，用100mmol/L Tris-HCl (pH7. 8)洗涤两遍，悬浮。超声波破碎细胞(条件 溶液体积300ii L，功率280w，工作10s，间隔30s， 30次循环)，于4°C ， 13500rpm离心15min， 取上清用于粗酶液的测定。 以带有pAKC6以及pAKC6-trc的谷氨酸棒杆菌为对照，进行同样的实验。
其中pAKC6-trc是启动子trc与pAKC6的连接，连接过程参见图2，具体步骤如下
参照质粒pXC99E(Kirchner 0 & T塞h A， Journal Biotechnology, 104 (1-3): 287-299,2003)的DNA序列，人工合成启动子trc，合成时在其两侧分别添加Kpnl和Hind III的酶切位点，序列见SEQ ID No. 2。将该片段与经内切酶Kpnl和Hindi 11双酶切的启动子探测载体pAKC6连接，电击转化谷氨酸棒杆菌10147的感受态细胞，得到含有已知启动 子trc的重组载体pAKC6-trc作为阳性对照。
2)总蛋白含量的测定 采用考马斯亮蓝法(Bradford M， Analytical Biochemistry, 72 (1-2) :248-254， 1976)，以牛血清白蛋白(组分V)为标准蛋白。 蛋白显色试剂称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇中，然后加入 100ml 85%磷酸，最后定容到1L，用滤纸过滤后于棕色瓶中保存备用。 蛋白标准溶液称取25mg牛血清白蛋白(组分V)溶于25ml蒸馏水中配制成lmg/ ml的标准溶液。 标准曲线量取100 y L蛋白溶液(lmg/ml的蛋白标准溶液与蒸馏水以不同比例组 成)与5ml蛋白显色试剂混匀，静置5min后测定0D595，根据测定值制作标准曲线。
测定先取10iiL待测样品用90iiL蒸馏水稀释到0. lml，加到试管中，然后加入 5ml蛋白显色试剂，振荡摇匀，静置5min后测定0D595 。 测定结果如表1所示，含有序列1的谷氨酸棒杆菌表达出的总蛋白量与含有序列
2(trc启动子)的谷氨酸棒杆菌表达出的总蛋白量接近。 表l.谷氨酸棒杆菌转化子中插入片段的大小和启动子活性
在pAKC6中的片段片段大小 (bp)蛋白浓度 (mg/mU谷敏酸棒杆菌10M7 的氣n素乙酰转移, 活性(U/rag)
Mo朋0tj 290. 15
(p皿C6对照)
2.613. 99
序歹ij 22953. 9026, 33
(pAKC6-trc对照) 二、氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性的测定 通过对启动子探测载体pAKC6上的报告基因氯霉素乙酰转移酶酶活的测定，比较 本发明的启动子活性片段与常用于谷氨酸棒杆菌中的trc启动子在谷氨酸棒杆菌10147中 的活性。 参照方法(Shaw W V， Method in Enzymology， 43 :737-755,1975)进行，1. Oml反 应体系含lOOmM Tris-HC1(PH7.8)，0. lmM acetyl-CoA， 0. 4mg/ml 5， 5' - 二硫(2-硝基苯 甲酸)[DTNB]，适量体积的粗酶液；将反应混合液在水浴中加热到37t:后，加入氯霉素使其 终浓度为O. lmM，混匀，立即测定OD^ ;以未加氯霉素的反应液为对照。每个样品测定三次， 取平均值作酶活曲线。 CAT活性单位的定义一个活力单位(U)为在上述反应条件下，每分钟乙酰化 lymol氯霉素所需的酶量。 结果如表1所示，根据本发明实施方案的启动子活性片段能在棒杆菌细菌中有效 表达氯霉素乙酰转移酶基因。具体地，SEQ ID N0:1启动子活性片段在棒杆菌中显示出高 活性，该活性与trc启动子(SEQ ID NO :2)的活性相当。
序列表 〈 110〉中国科学院微生物研究所 〈120〉来源于谷氨酸棒杆菌的启动子及其应用 〈130〉CGGNAL92374 〈160>4 〈210>1 〈211>261 〈212>DNA 〈213〉谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 〈400>1 gatcggctaa aatgaacacc atgcctgacc aaccgctcaa ccaggacgga ttccctaccg 60 catccaaagg ggtggaaccc gacaacctcc ccgaccgcgt tctcgtggac ggacttaaac 120 caaagcatca gcagcttcgt gaaattttgg aggaaatctg caccacccag cttcagcctg 180 gggacatgct gcctggtgag cgcatcctgg aagaaaagta tggcgtcagc cgaattacgg 240 ttcgtcgggc gattggtgat c 261 〈210>2 〈211〉295 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉 〈400>2 ggtaccgcga attgatctgg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt 60 aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata 180 acggttctgg caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtetaat 240 gtgtgg朋tt gtgagcggat aac朋tttca cacagg;aaac agaccatgga agctt 295 〈210>3 〈211>25 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉 〈400>3 aaaaggtgtc aacctcgata atttg 25 〈210>4 〈211>25 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉
〈223〉
〈400>4 gaacggtctg gttataggta cattg 2权利要求
一种启动子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。
2. 含有权利要求l所述的启动子的重组载体。
3. 根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是权利要求1所述的启动子插入载体pAKC6多克隆位点制成的重组载体。
4. 含有权利要求l所述的启动子的转基因细胞系。
5. 含有权利要求l所述的启动子的重组菌。
6. 根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是含有权利要求1所述启动子的原核细菌，所述原核细菌是如下1)或2)或3):1) 棒杆菌属细菌2) 埃希氏菌属细菌3) 棒杆菌属或埃希氏菌属细菌经诱变得到的突变菌株。
7. 权利要求l所述的启动子在棒杆菌属或埃希氏菌属细菌中启动目的基因表达中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种启动子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。本发明的提供的启动子可以用在以棒杆菌属或埃希氏菌属细菌为工业微生物的生物工程领域中。实验证明来自SEQ ID NO1的启动子活性片段在棒杆菌属细菌中具有与trc启动子(SEQ ID NO2)相当的活性。
文档编号C12N1/21GK101698846SQ20091021096
公开日2010年4月28日 申请日期2009年11月12日 优先权日2009年6月29日
发明者丁久元, 刘桂明, 张英姿, 李开, 王宇, 赵 智 申请人:中国科学院微生物研究所