专利名称：一种大环糊精的制备方法
技术领域：
—种大环糊精的制备方法，属于食品工业技术领域。
背景技术：
大环糊精具有复杂的空腔结构，并且大环糊精的疏水内腔具有一定的柔性，可以随着客体分子的形状发生相应的变化，对不同大小的客体分子具有不同的俘获能力。此外，大环糊精具有高度的水溶性、低黏度和不回生等特性，因此可以用做食品中不良杂味的去除，作为食品添加剂用于抗回生，或者用于药物载体等等，具有巨大的应用前景。可以预见大环糊精将具有巨大的经济价值。本发明为实现大环糊精的大规模工业化生产奠定了很好的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大环糊精的制备方法。 本发明的技术方案一种制备大环糊精的方法，以土豆直链淀粉为底物，经4-a-糖基转移酶作用、复合酶综合处理得到聚合度范围为18-55的大环糊精，步骤为
1) 土豆直链淀粉的提取称取10.0g土豆淀粉，加入少量无水乙醇浸润，加入370mL的0. 5mol/L氢氧化钠溶液，并置于沸水中加热30min左右，溶液分散均匀后冷却。低速离心除去不溶物，用2mol/L的盐酸调节pH至中性。加入200mL体积比为3 : 1的正丁醇-异戊醇的混合液，在沸水中水浴20-30min，使溶液清澈透明，无结团状。冷却至室温。于2-4t:的冰箱中放置24h，取出，进行以下操作以6000转/min的离心力下高速离心20min。将上述沉淀物全部转移至120mL的正丁醇与水的体积比为1 : 9的正丁醇水溶液中，然后置于沸水浴中搅拌直至溶液分散透明，再逐渐冷却至室温，放入2-4t:的冰箱中24h，取出，离心，将得到的沉淀物重复所述操作共3次后，用无水乙醇浸泡5-6次，并于室温下真空干燥得到土豆直链淀粉。 2)大环糊精的制备称取土豆直链淀粉4g，加入90X的二甲亚砜100mL，沸水浴中加热使其溶解；向该淀粉体系中加入30mL Tris-HCL缓冲溶液(pH7. 5， 0. 05mol/L)，并调节溶液pH为7. 5 ;加入4- a -糖基转移酶纯酶液4mL (40U/mL)，于75。C下反应8h，沸水浴中加热20min终止反应；4°C 、 10000转/min离心10min后收集反应液，向反应液中加入P _淀粉酶(30U/g淀粉)去除未反应的直链淀粉，3(TC反应4h后沸水浴加热10min终止反应；离心去除沉淀后再加入糖化酶(100U/mL)和脱支酶(30U/mL)各2mL，5(TC反应6h后沸水浴加热10min终止反应，4°C 、 10000转/min离心10min后收集上清，加入无水乙醇使得乙醇质量浓度达到60%， 10000转/min离心10min收集沉淀，将沉淀冻干即得经过初步纯化的大环糊精。 3)产物的鉴定用高效阴离子色谱(HPAEC)对大环糊精样品进行了鉴定，操作如下 称取0. Olg大环糊精样品，用超纯水溶解至lmL制成10mg/mL的样品溶液，上样lOii L，采用的色谱条件是Carbo PacTM PA-200col咖n(3*250mm);柱温为30°C ;流速为0. 5mL/min ;检测器采用电化学检测器；洗脱条件采用醋酸钠梯度洗脱法，程序如下0-5min醋酸钠浓度达到70m mol/L，氢氧化钠浓度达到96. 5m mol/L， 5_45min醋酸钠浓度达到320m mol/L，氢氧化钠浓度达到72. 5m mol/L。在此梯度洗脱程序下，大环糊精得到有效分离，经与标准大环糊精进行对比，制备得到大环糊精的聚合度范围为18-55之间。
本发明的有益效果本发明方法首次实现了大环糊精的制备，并且对其进行了初步的纯化及鉴定。大环糊精独特的包埋特性使得其具有巨大的应用前景，本发明为实现大环糊精工业化生产提供了技术支持。
图1样品大环糊精的高效阴离子色谱图。
具体实施例方式
实施例l 1、土豆直链淀粉的提取称取10.0g土豆淀粉，加入少量无水乙醇浸润，加入370mL的0. 5mol/L氢氧化钠溶液，并置于沸水中加热30min左右溶液分散均匀后冷却。低速离心除去不溶物，用2mol/L的盐酸调节pH值至中性。加入200mL体积比为3 : 1的正丁醇_异戊醇的混合液，在沸水中水浴20-30min，使溶液清澈透明，无结团状。冷却至室温。于2-4°C的冰箱中放置24h，取出，以6000转/min的离心力下高速离心20min。将上述沉淀物全部转移至120mL的正丁醇与水的体积比为1 : 9的正丁醇水溶液中，然后置于沸水浴中搅拌直至溶液分散透明，再逐渐冷却至室温，放入2-4t:的冰箱中24h，取出，离心，将得到的沉淀物重复上述操作3次后用无水乙醇浸泡5-6次，并于室温下真空干燥得到土豆直链淀粉。 2、大环糊精的制备称取土豆直链淀粉4g，加入质量浓度90X的二甲亚砜100mL，沸水浴中加热使其溶解；向该淀粉体系中加入30mL Tris-HCl缓冲溶液(pH7. 5，0. 05mo1/L)，并调节溶液pH为7. 5 ;加入4- a -糖基转移酶纯酶液4mL(40U/mL)，于75。C下反应8h，沸水浴中加热20min终止反应；4°C、 10000转/min离心10min后收集反应液，向反应液中加入P _淀粉酶(30U/g淀粉)去除未反应的直链淀粉，3(TC反应4h后沸水浴加热10min终止反应；离心去除沉淀后再加入糖化酶(100U/mL)和脱支酶(30U/mL)各2mL， 5(TC反应6h后沸水浴加热10min终止反应，4°C 、 10000转/min离心10min后收集上清，加入无水乙醇使得乙醇质量浓度达到60%， 10000转/min离心10min收集沉淀，将沉淀冻干即得经过初步纯化的大环糊精。 3.产物的鉴定用高效阴离子色谱(HPAEC)对大环糊精样品进行了鉴定，具体操作如下 称取0. Olg大环糊精样品，用超纯水溶解至lmL制成10mg/mL的样品溶液，上样10ii L，采用的色谱条件是Carbo PacTM PA-200col咖n(3*250mm);柱温为30°C ;流速为0. 5mL/min ;检测器采用电化学检测器；洗脱条件采用醋酸钠梯度洗脱法，具体程序如下0-5min醋酸钠浓度达到70m mol/L，氢氧化钠浓度达到96. 5m mol/L， 5-45min醋酸钠浓度达到320m mol/L，氢氧化钠浓度达到72. 5m mol/L。
制备所得大环糊精样品是含有不同聚合度的环糊精的混合物。利用HPAEC(高效阴离子交换色谱)对不同聚合度环糊精进行了分离鉴定，结果如图l所示。从图l可以看出，样品大环糊精的聚合度范围和标样大环糊精的聚合度相似，都为20-50之间。
权利要求
一种大环糊精的制备方法，其特征在于，以土豆直链淀粉为底物，经4-α-糖基转移酶作用、复合酶综合处理得到聚合度范围为18-55的大环糊精，步骤为1)土豆直链淀粉的提取称取10.0g土豆淀粉，加入少量无水乙醇浸润，加入370mL的0.5mol/L氢氧化钠溶液，并置于沸水中加热30min，溶液分散均匀后冷却，低速离心除去不溶物，用2mol/L的盐酸调节pH至中性，加入200mL体积比为3∶1的正丁醇-异戊醇的混合液，在沸水中水浴20-30min，使溶液清澈透明，无结团状，冷却至室温，于2-4℃的冰箱中放置24h，取出，进行如下操作以6000转/min离心20min，将沉淀物全部转移至120mL的正丁醇与水的体积比为1∶9的正丁醇水溶液中，然后置于沸水浴中搅拌直至溶液分散透明，再逐渐冷却至室温，放入2-4℃的冰箱中24h，取出，离心，将得到的沉淀物重复所述操作共3次后，用无水乙醇浸泡5-6次，并于室温下真空干燥得到土豆直链淀粉；2)大环糊精的制备称取土豆直链淀粉4g，加入90％的二甲亚砜100mL，沸水浴中加热使其溶解；向该淀粉体系中加入pH 7.5，0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液30mL，并调节溶液pH为7.5；加入40U/mL的4-α-糖基转移酶纯酶液4mL，于75℃下反应8h，沸水浴中加热20min终止反应；4℃、10000转/min离心10min后收集反应液，向反应液中加入30U/g淀粉的β-淀粉酶去除未反应的直链淀粉，30℃反应4h后沸水浴加热10min终止反应；离心去除沉淀后再加入100U/mL的糖化酶和30U/mL的脱支酶各2mL，50℃反应6h后沸水浴加热10min终止反应，4℃、10000转/min离心10min后收集上清，加入无水乙醇使得乙醇质量浓度达到60％，10000转/min离心10min收集沉淀，将沉淀冻干即得经过初步纯化的大环糊精；3)产物的鉴定用高效阴离子色谱HPAEC对大环糊精样品进行鉴定，操作如下称取0.01g大环糊精样品，用超纯水溶解至1mL制成10mg/mL的样品溶液，上样10μL，采用的色谱条件是Carbo PacTM PA-200column 3*250mm；柱温为30℃；流速为0.5mL/min；检测器采用电化学检测器；洗脱条件采用醋酸钠梯度洗脱法，程序如下0-5min醋酸钠浓度达到70m mol/L，氢氧化钠浓度达到96.5m mol/L，5-45min醋酸钠浓度达到320m mol/L，氢氧化钠浓度达到72.5m mol/L；在此梯度洗脱程序下，大环糊精得到有效分离，经与标准大环糊精进行对比，制备得到大环糊精的聚合度范围为18-55。
全文摘要
一种大环糊精的制备方法，属于食品工业技术领域。本发明从土豆淀粉中提取得到直链淀粉；然后用4-α-糖基转移酶作用直链淀粉生产大环糊精，并对制备的大环糊精进行了初步纯化及鉴定。本发明制备的大环糊精经鉴定聚合度范围为18-55之间，在国内首次制备得到了大环糊精，并且为大环糊精在工业中应用提供了技术依据。
文档编号C12P19/18GK101696441SQ20091021317
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月19日 优先权日2009年10月19日
发明者徐学明, 王金鹏, 田耀旗, 谢正军, 金征宇 申请人:江南大学;