专利名称：：一种具有降解四溴双酚a能力的苍白杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物
技术领域：
，特别涉及一种具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌及其在环境修复中的应用。
背景技术：
：溴代阻燃剂(BFRs)由于其具有较高的持久性、亲脂性、环境稳定性、难降解性和生物放大作用等特性，容易在人和动物体内累积，并能够通过食物链传递，使处于高位营养级的生物受到毒害，最终导致对人体健康的危害。国外已经开始关注溴代阻燃剂在自然界中的降解，已有研究表明不同的溴代阻燃剂可以在一定的条件下光降解或生物降解，利用从环境中筛选的优势微生物能有效地去除环境中的溴代阻燃剂。四溴双酚A是一种典型的溴代阻燃剂。四溴双酚A的生物降解特性已经成为研究的焦点。而苍白杆菌属是由Holmes等在1988年建立的新属。细菌染色为革兰氏阴性，专性好氧，接触酶阳性，不水解明胶，能利用各种氨基酸、有机酸和碳水化合物为碳源。至今尚未筛选出苍白杆菌属中具有降解四溴双酚A的菌株。
发明内容为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌。本发明的另一目的在于提供所述具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌，名称为苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)T，于2009年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM209246;所述具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌具有如下的形态和生理生化特性该苍白杆菌菌体的形态特性a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的苍白杆菌的细胞染色为革兰氏阴性，杆状，菌体大小为0.40.8X1.62.2iim，周生鞭毛；b.菌落的形态特性在LB固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，无色，透明，菌落直径为12mm;c.主要的生理生化特征专性好氧，严格呼吸代谢，接触酶、氧化酶阳性，吲哚试验阴性，不水解明胶，在半固体LB培养基上穿剌接种运动阴性。所述具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌的16SrDNA序列如SEQID:No.1所示。所述具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌应用于修复环境，所述的苍白杆菌可降解环境中，如大气、水体和土壤中的四溴双酚A。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果(1)本发明首次从广东省贵屿地区土壤中筛选到具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌。3(2)本发明的苍白杆菌降解四溴双酚A的能力强，底物浓度为2mg/L条件下降解84h，降解率可达96.2%。图1是本发明的苍白杆菌T在电子显微镜下的形态图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1本发明所述的具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌从广东省贵屿镇电子垃圾高风险区的污泥中进行分离、纯化而得。其分离纯化方法如下所用的驯化培养基为无机盐培养基(g/U(K2HP044.35，KH2P041.70，NH4N032.10，MgS040.20，MnS040.05，FeS047H200.01，CaCl2*2H200.03)。首先将3g污泥加入含四溴双酚A10mg/L的无机盐培养基，37°C驯化7天后，以5%接种量移入含四溴双酚A20mg/L的无机盐培养基接着驯化一周，以此类推逐步提高四溴双酚A的浓度进行驯化，四溴双酚A的使用浓度分别为30mg/L、40mg/L、50mg/L。驯化结束后以5%的接种量接入牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏3.Og/L，蛋白胨10.Og/L，NaCl5.0g/L，pH7.4-7.6)培养12h，取0.1ml菌悬液(稀释10—110—7)涂布在以四溴双酚A为唯一碳源的固体琼脂平板(K2HP044.35g/L，KH2P041.70g/L，NH4N032.10g/L，MgS040.20g/L，MnS040.05g/L，FeS047H200.01g/L，CaCl22H200.03g/L，琼脂粉1.80g/L，四溴双酚AlOmg/L)直到平板上出现单一的纯菌落为纯菌。挑选生长速度快、边缘规则的菌落。将挑选得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下(1)菌体的形态特性a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的苍白杆菌的细胞染色为革兰氏阴性；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，菌体大小为0.40.8X1.62.2iim，周生鞭毛，如图l所示；b.菌落的形态特性在LB固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，无色，透明，菌落直径为12mm;c.主要的生理生化特征专性好氧，严格呼吸代谢，接触酶、氧化酶阳性，吲哚试验阴性，不水解明胶，在半固体LB培养基上穿剌接种运动阴性。上述结果表明本发明所筛选的细菌与苍白杆菌属的生理生化特性很相似。(2)采用DNA提取方法提取细菌总DNA。采用细菌的16SrDNA通用引物扩增其16SrDNA基因，测序结果如下(SEQID:No.1):tggagccgtgtcgacagcctaccatgcagtcgagcgcgtagcaatacgagcggcagacgg60gtgagt朋cgcgtggg朋tctecccatcacteggg朋t朋ctcaggg朋3cttgtgct朋120taccctatacgaccgagaggtgaaagatttatcggtgatggatgagcccgcgttggatta180gctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccatagctggtctgagaggatga240tcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaata300ttggac朋tgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtg￡lgtg￡ltg￡l￡lggccctagggt360tgtaaagctctttcaccggt3Cggt朋CCgg3g朋g朋gCcccggctaac420ttcgtgccagcagccgcggtgggctagcgttgttcggatttactgggcgt■3朋gCgC3Cgtaggcgggctgggtg朋EltCccggggctcaaccccggaac540tgcctttgatactgttagtcttgagtetgg3卿ggtg3gtggaattccgElgtgt卿gg600tgaaattcgtagatettcgg3gg^C3CC3gtggcg朋ggcgggctcactggtgcattac660tgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagca3朋C3gg3ttagataccctgggtagtccac720gccgtaatcgatg朋tgttegccgttggggagtttactcttcggtggcgc3gCt朋CgC3780ttaaacattccgcctggggagtecggtcgcctc朋3gg朋ttg3Cggggg840cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcg朋gc朋cgcgcag朋ccttaccagcc900cttgacatcccgatcgcggttegtgg卿cactttccttcagttcggctggatcggagac960aggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggttaagtcccgcaacga1020gcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagttgggcactct朋ggggactgccggtg1080ateagccgag3gg朋ggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggcte1140cacacgtgct3C朋tggtggtgacagtgggC3gCg3gC3Cgcgagtgtgagctaatctcc12003朋3gCC3tCtcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatg朋gttgg朋tcgcte1260gteatcgcggatcagcatgccgcggtg^tacgttcccgggccttgtacacaccgcccgt1320cacaccatgggagttggttttecccg33ggcgctgtgcta3CCgC33gg3ggcacgcgac1380cacggtagggtcagcgatctggcgtg卿tCgg朋CC3朋gttttegggggc1432将长为1432bp的16SrRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌株与Ochrobactrumsp.CGL-x有最高的同源性达98.1%，其中与最相似的模式菌株OchrobactrumintermodiumCCUG2469T的同源性为96.2%。综合上述的生理生化特性、16SrRNA基因序列结果，本发明所筛选的细菌应归属苍白杆菌属，且为该属的一个新种，命名为苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)T。所述菌株于2009年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM209246。实施例2本发明筛选得到的苍白杆菌T对四溴双酚A具有降解能力在1L的去离子水中加入K2HP044.35g，KH2P041.70g，NH4N032.10g，MgS040.20g，MnS040.05g，FeS047H200.Olg，CaCl22H200.03g，100ml/瓶分装在250ml的摇瓶中，12rC条件下灭菌30min后取出，在无菌条件下加入四溴双酚A，四溴双酚A的浓度依次为2mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L禾P25mg/L。将斜面保存的苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)T接种至LB培养基中培养中，在30°C，220r/min的摇床中活化菌体15h，以5%的接种量接入含四溴双酚A的无机盐培养基中，3(TC下降解，采用液相色谱测定降解率，液相色谱条件为80%甲醇，18%水，2%乙酸，流速为lml/min，四溴双酚A的检测波长为210nm。在四溴双酚A不同初始浓度时降解84h后测定降解率，结果如表1所示表1不同初始浓度的四溴双酚A的降解率5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>从表l中可以看出，本发明筛选得到苍白杆菌T对四溴双酚A的降解能力强，最高可达96.2%。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING〈110〉中国科学院广州地球化学研究所〈120>—种具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌及其应用〈130>1〈160>1〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>1432〈212>DNA〈213>苍白杆菌(Ochrobact進sp.)〈400〉1tggagccgtgtcgacagcctaccatgcagtcgagcgcgtagc朋tecgagcggc卿cgg60gtgElgt朋CgcgtgggaatctecccatcacCtC3ggg朋3cttgtgctaa120taccctatacg3CCg卿ggtg朋3gatttatcggtgatggatgagcccgcgttggatte180gctagttggtggggte朋ggcctaccaaggcgacgatccatagctggtctg卿gg3tg3240tcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacggg￡lggC￡lgC￡lgtgggg朋te300ttggac朋tgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtg￡lgtg￡ltg￡l￡lggccctagggt360tgtaaagctctttcaccggtgaagateatgacggteaccgg3g朋g朋gCcccggctaac420ttcgtgccagcagccgcggt朋tecg朋gggggctegcgttgttcggatttactgggcgt4803朋gCgC3Cgteggcgggct朋t朋gtC3ggggtg朋EltCccggggctcaaccccggaac540tgcctttgatactgttegtcttgagtetggEl卿ggtgElgtggaattccgElgtgt卿gg600tgaaattcgtagatettcgg3gg朋C3CC3gtggcg朋ggcgggctcactggtgcattac660tgacgctgaggtgcg皿agcgtggggagca3^C3ggattagateccctgggtegtccac720gccgtaatcgatgaatgttagccgttggggagtttectcttcggtggcgcagcteacgca780tte^cattccgcctggggagtecggtcgc^gattea^ctca皿gg^ttgacggggg840cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagcc900cttgacatcccgatcgcggttegtggagacactttccttcagttcggctggatcggagac960aggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacga1020gcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagttgggcactctaaggggactgccggtg1080ateagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggcte1140cacacgtgctacaatggtggtgacagtgggcagcgagcacgcgagtgtgagctaatctcc1200aaaagccatctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagttggaatcgcta1260gtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtecacaccgcccgt1320cacaccatgggagttggttttacccgaaggcgctgtgcteaccgcaaggaggcacgcgac1380cacggtegggtragcgatctggcgtg皿gtcgg皿cca皿gttttegggggc143权利要求一种具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)，其特征在于所述苍白杆菌的名称为苍白杆菌T，于2009年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM209246。2.权利要求1所述的具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌在修复环境中的应用。3.根据权利要求2所述的具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌在修复环境中的应用，其特征在于所述苍白杆菌降解大气、水体或土壤中的四溴双酚A。全文摘要本发明公开了一种具有降解四溴双酚A能力的苍白杆菌及其在环境修复中的应用。本发明通过对电子垃圾高风险区的污泥进行分离，得到一株对四溴双酚A具有良好降解能力的苍白杆菌，将此苍白杆菌命名为苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)T，于2009年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM209246。本发明分离得到的苍白杆菌T降解环境中四溴双酚A的能力强，降解率可达96.2％，可将其应用于降解环境中四溴双酚A，达到环境修复的目的。文档编号C12R1/20GK101717740SQ20091021374公开日2010年6月2日申请日期2009年12月11日优先权日2009年12月11日发明者安太成,李桂英,祖蕾申请人:中国科学院广州地球化学研究所