专利名称：双温多重pcr鉴定猪早期胚胎性别的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适用于猪早期胚胎性别鉴定的PCR反应技术体系，进一步讲是公 开了一种双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的方法，同时还提供了相应的试剂盒，属家畜 性别控制鉴定技术领域。
背景技术：
家畜的性别控制是指通过人为干预，使雌性繁殖动物按人们的愿望繁衍所需性别 后代的技术，在畜牧业生产中具有重大意义。 目前，家畜性别鉴定方法主要有细胞遗传学方法、H-Y抗原法、性特异性DNA探针 法、PCR法、LAMP法等，主要用于牛、羊或其它经济动物的性别鉴定，经检索未见有关于猪早 期胚胎性别鉴定方法的文献报道。
发明内容
本发明一种双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒，用于猪早期胚胎的性别 鉴定。 本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，建立一种快速、灵敏、准确率高的适用于 猪早期胚胎性别鉴定的双温多重PCR反应体系。 本发明双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒，具体构成如下 1) 1ml细胞裂解液； 2) 1ml组织裂解液； 3)550ul的2XTaq PCR MasterMix ; 4) 120ul的Primer mix，其中含有终浓度为luM的引物 Sry-1 5'-GCTTTCATTGTGTGGTCTCGT-3' Sry-2 5' -CTTGGCGACTGTGTATGTGAAG—3' 和4uM的引物 Gapdh-1 5' -GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTG-3， Gapdh-2 5' -GGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3，； 5)60ul的公猪和母猪100ng/ul的基因组DNA。 本发明试剂盒的制备方法，包括以下步骤 l)样品处理 A :检测样品为猪胚胎或细胞 从待检测的猪早期胚胎中分离细胞，放入PCR管中，加入lOul细胞裂解液，置于 PCR仪中56°C 10min，94。C 5min ;12000rpm离心2min，取上清，保存于-20。C备用； 细胞裂解液1XPCR buffer,0.45% NP_40，60ug/ml的蛋白酶K组成； B :检测样品为猪早期胎儿或未知性别猪组织 取待检测样品lmmX lmm大小组织块，放入PCR管中，加入组织裂解液50ul，置于PCR仪中56。C 50min，94。C 5min ; 12000rpm离心2min，取上清保存于-20。C备用；
组织裂解液100ug/ml的蛋白酶K，20mmole/L Tris-Cl， 5mmole/L EDTA， 400mmole/L NaCl， 1%的SDS ;
2)引物设计 根据猪SRY基因序列设计一对双温PCR扩增引物
Sry-l 5' -GCTTTCATTGTGTGGTCTCGT-3'
Sry-2 5' -CTTGGCGACTGTGTATGTGAAG—3' 根据猪GAPDH基因序列设计一对双温PCR扩增引物作为内部对照
Gapdh-l 5' -GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTG-3，
Gapdh-2 5' -GGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
3)双温多重PCR : 在20ul PCR反应体系中分别加入10ul的2XTaq PCR MasterMix、0. 05uM的 SryPrimer 1禾口 Sry Primer 2、0. 2uM的GAPDH Primer 1禾口 GAPDH Primer 2及50ng 100ng的步骤1获得的基因组DNA，补水至总体积20ul ;
反应条件如下 预变性，94°C ， 5min ;变性，98°C ， 10s ;退火(延伸)，68°C ， 90s ;扩增30个循环；最 后72"延伸5min 12"保存；
4) PCR产物检测 取7ul PCR产物，1. 2%琼脂糖凝胶电泳，120V，电泳30min，凝胶成像系统观察照 相，获得检测电泳图；
5)结果判定 根据检测电泳图中GAPDH扩增产物和SRY扩增产物的条带，检测胚胎性别。
本发明的积极效果在于充分利用了多重PCR的高效性，即在同一PCR反应管内同 时检出多个基因以及其经济简便性，即节省样本使用又提高效率，同时结合双温PCR省时、 反应特异性高的特点，建立了一种适用于猪早期胚胎性别鉴定的多重双温PCR体系。以双 温多重PCR技术体系开发的猪早期胚胎性别鉴定试剂盒，充分发挥了双温多重PCR高效、经 济简便、省时、反应特异性高的特点，实现快速鉴定猪早期胚胎从而为实现猪性别控制，提 高猪养殖业经济效益，节约养殖成本提供便利。
图1为用提取的已知性别猪组织DNA样鉴定性别的电泳图。 其中，琼脂糖凝胶浓度为1. 2% .图中编号说明如下M，Marker 2000 ;1 5均为 公猪组织DNA扩增结果，检出404和309bp带，6 10为母猪组织DNA扩增结果，检出404bp带。
具体实施例方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。
实施例1
1.样品处理
A :若待检测样品为猪胚胎或细胞 从待检测的猪早期胚胎中分离4或者4个以上细胞，放入0. 2ml PCR管中，加入 10ul细胞裂解液，置于PCR仪中56°C 10min，94。C 5min ; 12000rpm离心2min，取上清，保存 于-20。C备用； B :若待检测样品为猪早期胎儿或未知性别猪组织取待检测样品lmmX lmm大小组织块，放入0. 2mlPCR管中，加入组织裂解液50ul， 置于PCR仪中56。C 50min，94。C 5min ; 12000rpm离心2min，取上清保存于-20。C备用；
2.引物设计: 根据猪SRY基因序列(Genbank登录号U49860. 2)设计一对双温PCR扩增引物。 此外，根据猪GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因序列(Genbank登录号AF017079. 1)设 计一对双温PCR扩增引物作为内部对照，以确定PCR扩增的有效性，防止假阴性结果的出 现。 设计引物序列如下
Sry-l 5' -GCTTTCATTGTGTGGTCTCGT-3'
Sry-2 5' -CTTGGCGACTGTGTATGTGAAG-3'
Gapdh-l 5' -GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTG-3，
Gapdh-2 5' -GGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
3.双温多重PCR : 在20ul反应体系中分另U力Q入10ul的2XTaq PCR MasterMix、0. 05uM的 SryPrimer 1禾卩Sry Primer 2、0. 2uM的GAPDH Primer 1禾卩GAPDH Primer 2、50ng 100ng 的步骤1获得的基因组DNA，补水至总体积20ul。
反应条件如下 预变性，94°C ， 5min ;变性，98°C ， 10s ;退火(延伸)，68°C ， 90s ;扩增30个循环；最 后72"延伸5min 12"保存。
4. PCR产物检测 取7ulPCR产物，1. 2 %琼脂糖凝胶电泳，120V，电泳30min，凝胶成像系统观察照 相，电泳图参见附图1。
5.结果判定 检测电泳图中是否同时出现404bp的GAPDH扩增产物(见序列表SEQ ID2)和 309bp的SRY扩增产物(见序列表SEQ ID1)两条带，如果电泳图中两条带同时出现说明 待检测胚胎为雄性胚胎或待检测组织来源为雄性个体，如果只出现404bp (GAPDH扩增产物 带)，说明待检测胚胎为雌性胚胎或待检测组织来源为雌性个体。
实用例 随机选取5头公猪、5头母猪，采取肝组织，按实施例所述1处理，用本发明试剂盒 检测，获得附图1 ;从图中可见，1 5公猪样品均出现404bp的GAPDH扩增产物和309bp的 SRY扩增产物条带，6 10母猪样品只出现404bp的GAPDH扩增产物条带，能够准确反映猪 的性别。 序列表
SEQ ID1TACACAGTCGCCAAG
SEQ ID2
ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCC
权利要求
一种双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒，具体构成如下1)1ml细胞裂解液；2)1ml组织裂解液；3)550ul的2×Taq PCR MasterMix；4)120ul的Primer mix，其中含有终浓度为1uM的Sry-1 5′-GCTTTCATTGTGTGGTCTCGT-3′Sry-2 5′-CTTGGCGACTGTGTATGTGAAG-3′和4uM的Gapdh-1 5′-GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTG-3′Gapdh-2 5′-GGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′；5)60ul的公猪和母猪100ng/ul的基因组DNA。
2. 权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤1) 样品处理A :检测样品为猪胚胎或细胞从待检测的猪早期胚胎中分离细胞，放入PCR管中，加入lOul细胞裂解液，置于PCR仪中56°C 10min，94。C 5min ;12000rpm离心2min，取上清，保存于-20。C备用;细胞裂解液1XPCR buffer,0. 45% NP_40，60ug/ml的蛋白酶K组成；B :检测样品为猪早期胎儿或未知性别猪组织取待检测样品lmmX lmm大小组织块，放入PCR管中，加入组织裂解液50ul，置于PCR仪中56°C 50min，94。C 5min ;12000rpm离心2min，取上清保存于-20。C备用；组织裂解液100ug/ml的蛋白酶K，20mmole/L Tris-Cl， 5mmole/LEDTA， 400mmole/LNaCl， 1%的SDS ;2) 引物设计根据猪SRY基因序列设计一对双温PCR扩增引物Sry-l 5' -GCTTTCATTGTGTGGTCTCGT-3'Sry-2 5' -CTTGGCGACTGTGTATGTGAAG-3'根据猪GAPDH基因序列设计一对双温PCR扩增引物作为内部对照Gapdh-l 5' -GATGGCCCCTCTGGGAAACTGTG-3'Gapdh-2 5' -GGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'3) 双温多重PCR :在20ul PCR反应体系中分别加入10ul的2XTaq PCR MasterMix、0. 05uM的SryPrimer 1禾口 Sry Primer 2、0. 2uM的GAPDH Primer 1禾口 GAPDHPrimer 2及50ng lOOng的步骤1获得的基因组DNA，补水至总体积20ul ;反应条件如下预变性，94t:，5min ;变性，98"C， 10s ;退火(延伸)，68。C，90s ;扩增30个循环；最后72"延伸5min 12"保存；4) PCR产物检测取7ul PCR产物，1. 2%琼脂糖凝胶电泳，120V，电泳30min，凝胶成像系统观察照相，获得检测电泳图；5)结果判定根据检测电泳图中GAPDH扩增产物和SRY扩增产物的条带，检测胚胎性别。
全文摘要
本发明一种双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的方法及试剂盒，建立一种快速、灵敏、准确率高的适用于猪早期胚胎性别鉴定的双温多重PCR反应体系，用于猪早期胚胎的性别鉴定。以双温多重PCR技术体系开发的猪早期胚胎性别鉴定试剂盒，充分发挥了双温多重PCR高效、经济简便、省时、反应特异性高的特点，实现快速鉴定猪早期胚胎从而为实现猪性别控制，提高猪养殖业经济效益，节约养殖成本提供便利。
文档编号C12Q1/68GK101724696SQ20091021777
公开日2010年6月9日 申请日期2009年10月28日 优先权日2009年10月28日
发明者于浩, 李小平, 李莉, 欧阳红生, 王铁东, 赖良学, 逄大欣, 闫森, 高飞 申请人:吉林大学