专利名称：：氯嘧磺隆降解菌和基于该菌的土壤生物修复菌剂及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种氯嘧磺隆农药残留降解菌及应用该菌制备的土壤生物修复菌剂及应用，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
背景技术：
：氯嘧磺隆是1984年美国杜帮公司研制磺酰脲类除草剂，主要用于大豆田防除一些杂草。这类除草剂具有较高除草活性、对人畜毒性较低。但有些品种如氯嘧磺隆在土壤中的残留时间比较长，对后茬敏感作物如玉米、高粱、油菜、瓜类、马铃薯、甜菜等具有明显药害作用，限制了它的使用。氯嘧磺隆的环境行为包括土壤吸附，生物积累，蒸发和生物降解。以前研究集中在氯嘧磺隆在环境中水、土壤和植物体以及毒性。因此，研究解决氯嘧磺隆残留毒害问题对扩大它在生产上应用，减少对后茬作物及环境造成的污染具有重要意义。目前除草剂残留药害问题对植物的生长影响很大，有些作物产生药害后生长缓慢，停滞发育，影响作物产量，甚至许多杂草也出现了抗性突变等问题。大量研究证明利用微生物的代谢途径可以对污染物进行消除，而且是一种很好环境生物技术，其中投加高效降解菌株是生物修复中最常见最有效的一种方法。微生物对于农药的降解具有重要的作用，目前已分离得到许多能降解或转化农药的微生物类群，并对微生物降解农药的作用方式和降解机制等进行了研究，已经证实了是环境污染治理的重要途径之一，且显示出良好的应用前景。但是，微生物修复在实际应用中受到很多因素影响，所以降解率往往偏低，影响了该技术的发展。
发明内容本发明的目的之一是提供一种氯嘧磺隆农药残留降解菌，其分类命名为克雷伯氏菌2N3(KlebsiellajilinsisH.Zhang2N3)，该菌株是革兰氏阴性的克雷伯氏菌，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址是中国湖北省武汉市武昌珞珈山，邮编430072)的保藏编号是CCTCCNO:M209248，保藏日期2009年11月3日。该降解菌菌株在平板培养基上生长的菌落形态为直径1.01.2mm,圆形，边缘整齐，有光泽，微黄色，半透明，细菌细胞体为椭圆形，并带有菌毛和鞭毛，氧化酶试验是为阳性，V.P试验为阳性，葡萄糖发酵试验为阳性，该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为FJ422735。所述平板培养基的配方是NaCl15g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、琼脂1520g，加lOOOmL蒸馏水配制而成。本发明的另一个目的是提供一种基于上述2N3菌株的土壤生物修复菌剂，其由如下步骤制备1)在前面所述的氯嘧磺隆降解菌2N3的斜面试管菌种中，用接种环沾少许菌体接种于平板培养基上，35°C培养10h后；然后再用接种环沾少许菌体接种于LB培养基中，30°C振荡培养至对数期；所述LB培养基是将10gNaCl、5g酵母粉和5g胰蛋白胨，加入到lOOOmL蒸馏水中配制而成；2)将上述步骤培养好的菌种接入种子瓶，用量为1015mL菌种/1000mL种子瓶培养基，振荡培养至对数期，1000mL的种子瓶培养基的重量百分含量是葡萄糖0.60.8%,MgS047H200.050.07%,K2HP040.20.4%,NaCl0.10.2%,CaC030.30.5%、酵母膏0.020.04%，余量为水，种子瓶培养基的pH值为6.07.0；3)将上述步骤培养好的菌种，加入到由麦麸、木屑、玉米粉、稳定剂硅藻土组成的发酵培养基中，用量为1015mL菌种/1000g发酵培养基，同时把810mL的营养液加入到1000g发酵培养基中，在35°C下进行通风发酵36h，并将发酵物在35°C下进行通风干燥，粉碎后进行包装，即得到基于上述2N3菌株的土壤生物修复菌剂；每100g发酵培养基的组成按重量百分比是麦麸7885%、木屑712%、玉米粉48%、稳定剂硅藻土48%；每100ml营养液的组成按重量百分比是葡萄糖0.50.7%，KH2P040.050.08%,MgS047H200.020.04%，K2HP040.050.07%，NaCl0.020.04%，余量为水，pH值自然。本发明的另一个方面，是提供一种包含氯嘧磺隆农药残留降解菌2N3(KlebsiellajilinsisH.Zhang2N3)的土壤生物修复菌剂在用于土壤生物修复中的应用。具体实验是，首先称取土壤1000g，加入由氯嘧磺隆原药制成的水溶液，使土壤中氯嘧磺隆的浓度为20mg/kg(即配制成被氯嘧磺隆污染的土壤)，然后按重量百分比为10%比例，将含有2N3菌株的土壤生物修复菌剂散施于土壤中，充分混合，放于25°C的暗培养箱中恒温培养，定时取样测定氯嘧磺隆在土壤中的残留。结果参见图1。选取小麦、玉米、黄瓜种子为供试作物。配制含氯嘧磺隆浓度为20mg/kg土壤(每盆1000g土壤)，加入适量的水，使含水量为20%左右，将2N3菌株的土壤生物修复菌剂按重量百分比为10%比例散施在土壤中充分混合，放于25°C的暗培养箱中恒温培养15d，分别以不加菌、不加氯嘧磺隆做对照处理，以上处理培养选取清水浸种催芽萌发一致的小麦、玉米、黄瓜种子，播种于不同处理土壤中，分别在不同时间测定出苗率和株高。结果参见图2、图3。有益效果1、土壤降解实验表明，该菌剂具有生产成本低、降解效果好、使用方便，适合于消除土壤中的农药残留，对保护生态环境和生产绿色食品具有重要意义。土壤中施用该菌剂对氯嘧磺隆降解率达到82.6%。2、生物修复实验表明，以小麦、玉米、黄瓜为供试作物，在土壤中施用该菌剂后出苗率分别提高40%、30%、41%，株高也分别提高了18%、17%、12%。图1:2N3菌剂对土壤中氯嘧磺隆降解的影响曲线；图2:2N3菌剂对小麦、玉米、黄瓜出苗率的影响曲线；图3:2N3菌剂对小麦、玉米、黄瓜株高的影响曲线；图4不同pH条件下2N3菌株对氯嘧磺隆的降解曲线；图5不同温度条件下2N3菌株对氯嘧磺隆的降解曲线；图6不同初始浓度下2N3菌株对氯嘧磺隆的降解曲线；图7氯嘧磺隆诱导作用对菌株2N3降解氯嘧磺隆的影响。具体实施例方式实施例1氯嘧磺隆降解菌的富集、分离、纯化及菌悬液的制备取Ig污泥样品(生产氯嘧磺隆农药厂排水口污泥)加入盛有50mL无机盐培养基的三角瓶中，从配制的浓度为250mg/L的氯嘧磺隆溶液中取4mL直接加到三角瓶中作为微生物生长的唯一氮源(5mg/L)，在摇床上培养2d(30°C，60r/min)后转接至含氯嘧磺隆20mg/L的无机盐培养基中培养2d后，然后在含浓度为250mg/L的氯嘧磺隆平板培养基上接入上述培养2d的无机盐培养基0.ImL,涂布后于35°C培养箱中培养2d，挑出单菌落在平板培养基上重复移种划线34次进行纯化，将纯化后2N3菌株用接种环沾取少许接种于50mL的LB液体培养基中，30°C、200r/min的摇床中震荡培养12h，取适量菌液离心，弃去上清液，用等量磷酸缓冲溶液洗涤沉淀，用50mL的磷酸缓冲溶液悬浮，得2N3菌悬液备用。所述的无机盐培养基配方按重量百分比是葡萄糖5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H200.2g,K2HPO40.5g,NaCl0.2g，加IOOOmL蒸馏水，pH值自然。从上述纯化好的菌株中获得一种氯嘧磺隆农药残留降解菌，该降解菌是克雷伯氏M2N3(KlebsiellajilinsisH.Zhang2N3)，其在CCTCC的保藏编号是M209248。其是革兰氏阴性，在平板培养基上生长的菌落直径1.01.2mm,圆形，边缘整齐，有光泽，微黄色，半透明，细菌细胞体为椭圆形，并带有菌毛和鞭毛，氧化酶试验为阳性，V.P试验为阳性，葡萄糖发酵试验为阳性，该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为FJ422735。实施例2:降解条件1、pH值对菌株2N3降解氯嘧磺隆的影响按体积百分比为2%接菌量，将实施例1制备的2N3菌悬液接入氯嘧磺隆浓度为100mg/L的无机盐培养基中，分别调节培养基的pH值为5、6、7、8、9、10，在30°C、200rpm摇床振荡培养，分别在4、8、10、12、24、36h测定氯嘧磺隆的含量。所述无机盐培养基为葡萄糖5g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H200.2g、K2HPO4O.5g、NaCl0.2g，加IOOOmL蒸馏水，pH值自然。pH值对菌株降解氯嘧磺隆的实验结果表明，当pH值大于8.0时，随着pH值升高，氯嘧磺隆降解效率逐渐下降。当pH值为6.07.0时，12h氯嘧磺隆降解率可达到94.094.3%，表明该菌能适应弱酸性和中性的培养基。结果参照图4。2、温度对菌株2N3降解氯嘧磺隆的影响温度实验中，选用五种不同温度10、20、30、35、401，于5001^三角瓶中加入2001^无机盐培养基，加入氯嘧磺隆使其浓度为100mg/L，按体积百分比为2%接入实施例1制备的2吧菌悬液，分别在10、20、30、35、401、200印111摇床震荡培养，分别在4、8、10、12、24、3611取样测定氯嘧磺隆的含量。所述无机盐培养基为葡萄糖5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H200.2g，K2HPO40.5g，NaCl0.2g，加IOOOmL蒸馏水，pH值自然。在1040°C培养条件下，分别测定菌株2N3对氯嘧磺隆的降解率。菌株2N3降解氯嘧磺隆的最适温度为3035°C，12h降解率可达到92.596.6%。但是1020°C的时候，菌株2N3对氯嘧磺隆降解率只有20.837.1%，表明低温影响菌株对氯嘧磺隆的降解能力。结果参照图5。3、氯嘧磺隆的初始浓度对菌株2N3降解氯嘧磺隆的影响在无机盐培养基中加入氯嘧磺隆溶液，使其最终浓度分别为20mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L，以体积百分比为2%的接菌量接入实施例1制备的2N3菌悬液，301、200印111摇床振荡培养，分别在4、8、10、12、24、3611取样测定氯嘧磺隆降解率。结果参见图6和表1。表1:2N3菌株降解氯嘧磺隆一级动力学方程<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实验结果表明氯嘧磺隆初始浓度20mg/L时，氯嘧磺隆降解率达到83.5%；氯嘧磺隆初始浓度100mg/L时，氯嘧磺隆降解率达到92.5%；氯嘧磺隆初始浓度高于200mg/L时，生物降解速度随氯嘧磺隆浓度的提高而有所下降，当浓度是400mg/L时，降解率只有36.5%，当氯嘧磺隆初始浓度为20mg/L、100mg/L、200mg/L时，符合农药降解动力学方程。从表1中可以看出，当氯嘧磺隆浓度为100mg/L时降解速率常数是0.5978，半衰期是1.2h，所以100mg/L是最佳降解浓度。所述无机盐培养基为葡萄糖5g，KH2P040.5g,MgSO4·7Η200.2g,K2HPO40.5g,NaCl0.2g，加IOOOmL蒸馏水，pH值自然(按上述用量配制后，不需要再对PH进行调节)。4、诱导作用对氯嘧磺隆降解的影响将菌株2N3分别接种在硝酸铵浓度为20mg/L、氯嘧磺隆浓度为20mg/L的无机盐培养基上培养12h，分别将培养12h的菌液按体积百分比为2%定量接种于氯嘧磺隆浓度为100mg/L无机盐培养基中，30°C、200rpm摇床振荡培养，分别在4、8、10、12、24、36h取样，测定氯嘧磺隆浓度。所述无机盐培养基为葡萄糖5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H200.2g，K2HPO40.5g,NaCl0.2g，加IOOOmL蒸馏水，pH值自然。菌株2N3在含有硝酸铵的培养基上培养后，将其接种到含有氯嘧磺隆的无机盐培养基中培养12h，菌株对氯嘧磺隆的降解能力仅为24.5%，而经过氯嘧磺隆诱导后菌株培养12h，氯嘧磺隆的降解率达到92.5%。这说明底物氯嘧磺隆对其菌株2N3降解活性具有诱导作用，在不含有氯嘧磺隆的环境中长期培养，所获得的菌株则可能会丧失其对氯嘧磺隆的降解代谢活性，说明降解菌2N3以氯嘧磺隆为唯一氮源降解。结果参照图7。综上研究表明，环境温度和pH值对KlebsiellajilinsisH.Zhang2N3的降解特性影响较大，当PH值为6.07.0、温度为3035°C时，KlebsiellajilinsisH.Zhang2N3菌株对氯嘧磺隆的降解率最高，超过这个范围，降解率明显下降。同样，在弱酸性至中性条件下，KlebsiellajilinsisH.Zhang2N3菌株对氯嘧磺隆具有较好的降解效果。研究发现，KlebsiellajilinsisH.Zhang2N3菌的降解能力由氯嘧磺隆诱导而产生，氯嘧磺隆诱导的最适合浓度为100mg/L。在此条件下，12h降解率可达92.5%。当氯嘧磺隆初始浓度达到200mg/L以上时，菌株降解氯嘧磺隆能力逐渐下降。这是由于氯嘧磺隆降解达到一定浓度后会强烈抑制菌体生长或是对底物的代谢，也是由菌株的生理结构及特性所决定。当氯嘧磺隆初始浓度为20mg/L、100mg/L、200mg/L，菌株2N3对氯嘧磺隆的降解能力是符合一级动力学方程。实施例3菌剂制备试验在氯嘧磺隆降解菌2N3的斜面试管菌种中用接种环沾少许菌体接种于平板培养基上，35°C培养IOh后，再用接种环沾少许菌体接种于LB培养基中，30°C振荡培养至对数期，所述平板培养基的配方按重量百分含量是=NaCl15g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、琼脂15g，加入IOOOmL蒸馏水；所述LB培养基按重量百分含量是NaCl10g、酵母粉5g、胰蛋白胨5g，加入IOOOml蒸馏水；将培养好的菌种IOmL接入种子瓶，振荡培养至对数期，IOOOmL种子瓶的培养基为葡萄糖8g、MgS04·7Η200.7g,K2HPO44g、NaCl2g、CaC035g、酵母膏0.4g，加入IOOOmL水，培养基的pH值6.07.0；将上述培养好的菌种15mL加入到由麦麸、木屑、玉米粉、稳定剂(硅藻土)组成的IOOOg的发酵培养基中，同时加入IOmL的营养液，在35°C下进行通风发酵36h，将发酵物在35°C下进行通风干燥，粉碎后进行包装，包装制成产品，即得到基于上述2N3菌株的土壤生物修复菌剂。IOOOg发酵培养基配方是麦麸800g、木屑100g、玉米粉50g、稳定剂(硅藻土)50g；IOOml营养液配方是葡萄糖7g、KH2PO40.8g、MgSO4·7Η200·4g、K2HPO40.7g、NaCl0.4g、余量为水，pH值自然。实施例4:生物修复降解菌菌剂的生物修复作用对敏感作物影响小麦、玉米、黄瓜种子作为供试作物，选取清水浸种催芽萌发一致的小麦、玉米、黄瓜种子备用。配制氯嘧磺隆溶液放入花盆中(每盆IOOOg土)，加入适量的水，使含水量为20%左右，将实施例3制备的2N3菌剂施在土壤中。处理一取风干土(过20目筛)1.0kg，加入适量的水，使含水量为20%。处理二取风干土(过20目筛)1.0kg，加入氯嘧磺隆溶液，充分拌勻后制成氯嘧磺隆浓度为20mg/kg的含药土壤，再加入重量百分比为10%的基于上述2N3菌株的土壤生物修复菌剂，混勻。处理三取风干土(过20目筛)1.0kg，加入氯嘧磺隆溶液，充分拌勻后制成氯嘧磺隆浓度为20mg/kg的含药土壤。以上处理静态培养15d，在已经浸种催芽的种子中选取萌发度一致的小麦、玉米、黄瓜种子，播种于不同处理土壤中，在25°C温室中培养20d。同时每天观察记录出苗率、株尚ο降解菌土壤生物修复菌剂的生物修复作用对敏感作物影响实验结果表明含药土壤施用菌剂后可以明显提高小麦、玉米、黄瓜的出苗率。含药土壤未施用菌剂的小麦、玉米、黄瓜出苗率比对照土壤不含药的清水处理的低55%、49%、60%，而含药土壤施用菌剂后，小麦、玉米、黄瓜出苗率比未接菌含药土壤高40%、30%、41%，表明2N3菌剂对土壤中氯嘧磺隆有较好的降解作用，提高小麦、玉米、黄瓜的出苗率。同时土壤中氯嘧磺隆的残留对小麦、玉米、黄瓜的生长也有明显的抑制作用。土壤中施用菌剂2N3后，小麦、玉米、黄瓜的药害明显减轻。加菌处理含药土壤中小麦、玉米、黄瓜株高均明显高于未加菌处理植株。表明2N3菌剂对小麦、玉米、黄瓜的生长有明显的解除药害的作用。结果参照图2，3。权利要求一种氯嘧磺隆农药残留降解菌，其分类命名为克雷伯氏菌2N3(KlebsiellajilinsisH.Zhang2N3)，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏编号是CCTCCNOM209248，该降解菌菌株在平板培养基上生长的菌落形态为直径1.0～1.2mm，圆形，边缘整齐，有光泽，微黄色，半透明，细菌细胞体为椭圆形，并带有菌毛和鞭毛，氧化酶试验为阳性，V.P试验为阳性，葡萄糖发酵试验为阳性。2.一种包含氯嘧磺隆农药残留降解菌的土壤生物修复菌剂，其由如下步骤制备1)在权利要求1所述的氯嘧磺隆降解菌2N3的斜面试管菌种中，用接种环沾少许菌体接种于平板培养基上，35°C培养10h后；然后再用接种环沾少许菌体接种于LB培养基中，30°C振荡培养至对数期；所述LB培养基是将10gNaCl、5g酵母粉和5g胰蛋白胨，加入到1000ml蒸馏水中配制而成；2)将上述步骤培养好的菌种接入种子瓶，用量为1015mL菌种/1000mL种子瓶培养基，振荡培养至对数期，1000mL的种子瓶培养基的重量百分含量是葡萄糖0.60.8%、MgS047H200.050.07%、K2HP040.20.4%、NaCl0.10.2%、CaC030.30.5%、酵母膏0.020.04%，余量为水，种子瓶培养基的pH值为6.07.0；3)将上述步骤培养好的菌种，加入到由麦麸、木屑、玉米粉、稳定剂硅藻土组成的发酵培养基中，用量为1015mL菌种/1000g发酵培养基，同时把810mL的营养液加入到1000g发酵培养基中，在35°C下进行通风发酵36h，并将发酵物在35°C下进行通风干燥，粉碎后进行包装，即得到基于上述2N3菌株的土壤生物修复菌剂；每100g发酵培养基的组成按重量百分比是麦麸7885%、木屑712%、玉米粉48%、稳定剂硅藻土48%;每100ml营养液的组成按重量百分比是葡萄糖0.50.7%,KH2P040.050.08%，MgS047H200.020.04%,K2HP040.050.07%,NaCl0.020.04%，余量为水，pH值自然。3.一种包含氯嘧磺隆农药残留降解菌的土壤生物修复菌剂在用于土壤生物修复中的应用。4.如权利要求3所述的一种包含氯嘧磺隆农药残留降解菌的土壤生物修复菌剂在用于土壤生物修复中的应用，其特征在于按重量百分比为10%的比例，将土壤生物修复菌剂散施于种植有作物的土壤中。5.如权利要求4所述的一种包氯嘧磺隆农药残留降解菌的土壤生物修复菌剂在用于土壤生物修复中的应用，其特征在于作物是小麦、玉米或黄瓜。全文摘要本发明涉及一种氯嘧磺隆农药残留降解菌，分类命名为克雷伯氏菌2N3(KlebsiellajilinsisH.Zhang2N3)，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏编号是CCTCCNOM209248，及应用该菌制备的土壤生物修复菌剂及应用。氯嘧磺隆农药残留降解菌为从生产氯嘧磺隆农药厂排水口淤泥中通过富集培养分离得到的一株对氯嘧磺隆有较强降解能力的菌株，该菌株以氯嘧磺隆为唯一氮源生长，在液体培养基中通过氯嘧磺隆诱导增加菌体活性，提高对氯嘧磺隆的降解能力。该菌剂的制备方法简单，成本较低，施用方便，可以散施在土壤上，在土壤中的降解效果可达到82.6％，有很好的应用前景。文档编号C12N1/20GK101798564SQ20091021808公开日2010年8月11日申请日期2009年12月23日优先权日2009年12月23日发明者张浩,张祥辉,汪佳秀,潘洪玉,穆文辉申请人:吉林农业大学