专利名称：诱导裙带菜孤雌生殖幼孢子体体细胞产生雌配子体的方法
技术领域：
本发明涉及一种裙带菜雌配子体的生产方法，尤其是一种操作简单、成本低廉、所
产出的雌配子体成熟率高、可为裙带菜规模化苗种生产提供大量雌配子体的诱导裙带菜孤 雌生殖幼孢子体体细胞产生雌配子体的方法。
背景技术：
裙带菜(Undaria pinnatifida)属于褐藻门、褐子纲、海带目、翅藻科、裙带菜属， 属于广温性藻类，其味道鲜美，营养丰富，含有包括全部人体必需氨基酸的19种氨基酸、蛋 白质、糖份和维生素，由于裙带菜的纤维素含量仅为干重的3%左右，因此易于被人体消化， 是深受消费者欢迎的健康食品。 裙带菜大型藻体为孢子体，每年秋季开始幼苗在自然海区出现，经过冬季和春季 生长成为1 2m的藻体，在春季藻体开始发育，在茎部形成特殊的生殖器官孢子叶，在孢子 叶表面形成孢子囊，在春夏季孢子囊成熟放出游孢子，进入繁殖期，放散孢子后藻体死亡流 失，结束为期1年的生活周期。种藻所放出的孢子中约有50%形成雌配子体，50%形成雄配 子体，雌雄配子体经生长后在水温超过23t:时以休眠的状态度过夏季的高温期。在秋季水 温下降后雌雄配子体从休眠中复苏并逐渐发育成熟，雌配子体形成卵囊并排出卵，雄配子 体形成精子囊并放出精子，卵受精后萌发为幼孢子体，在适宜的水温条件下幼孢子体很快 生长成为裙带菜幼苗。 目前，裙带菜人工育苗生产中的采苗方式主要有孢子采苗和配子体采苗两种方 式，孢子采苗的缺点是采孢子时间受种藻繁殖季节限制，育苗时间在大连地区达3个月以 上，育苗成本高、风险大。配子体采苗是近年来开发并发展起来的一种新的裙带菜采苗及育 苗方法，其原理是在裙带菜繁殖期内将裙带菜孢子大量采集在培养皿或烧瓶内，在室内适 宜条件下培养成一定数量的雌雄配子体，采用雌雄分离的方法可将雌雄配子体分离后单独 培养，在秋季水温下降后，采用配子体切碎的方法使配子体附着在苗绳上直接进入成熟阶 段，雌配子体形成的卵和雄配子体放出的精子受精形成裙带菜幼苗，育苗时间只有1个月 左右，降低了育苗风险，大幅度提高了育苗的成功率。配子体采苗另外一个优点是可以使
用分离培养的雌配子体和雄配子体进行不同品系和不同地方种间杂交，培育出优质高产苗 种。 但是，由于分离后的雌雄配子体数量有限，尤其是雄配子体细胞数量多，一个细胞 可形成多个精子囊相比，而雌配子体细胞数量少且只有枝端细胞能形成卵囊，因此虽经过 室内增殖培养但雌配子体仍难以达到规模化苗种生产对其数量的要求。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、成本低 廉、所产出的雌配子体成熟率高、可为裙带菜规模化苗种生产提供大量雌配子体的诱导裙 带菜孤雌生殖幼孢子体体细胞产生雌配子体的方法。
本发明的技术解决方案是一种诱导裙带菜孤雌生殖幼孢子体体细胞产生雌配子 体的方法，按照如下步骤进行 a.取保存培养的裙带菜雌配子体10mg，添加300ml消毒海水后用组织搅拌机切碎 至190 210 ii m藻段形成种雌配子体体液，将种雌配子体体液按1ml/培养皿移至多个培 养皿内，添加培养液后在温度为2(TC、光照强度为2000Lx、光照时间为12小时/日的条件 下培养12天，培养液每3天全量交换1次； b.将生长有孤雌生殖幼苗的培养皿在温度为15t:、光照强度为2000Lx、光照时间 为12小时/日的条件下继续培养至孤雌生殖幼苗长度达到0. 4 0. 6cm，培养液每3天全 量交换1次； c.将孤雌生殖幼苗从培养皿底面上剥下，铺在经过灭菌消毒的载玻片上，将幼苗 假根从柄的部位去除，将剩余叶片移到烧杯内，添加培养液后在温度为2(TC、光照强度为 2000Lx、光照时间为12小时/日的条件下培养2个月，培养液每7天全量交换1次；
d.将多个生长雌配子体藻团的叶片移到组织捣碎机中，添加培养液后打碎至 490 510 ii m的藻段形成雌配子体体液，叶片湿重与培养液体积比为10mg : 300ml，汲取 雌配子体液按lml/培养皿移至多个培养皿中，添加培养液后在温度为2(TC、光照强度为 2000Lx、24小时/日温度光照条件下培养2个月； e.将培养皿内的雌配子体藻团置于灭菌后的烧瓶中，添加培养液后在d步骤所述培 养条件下增殖和保存培养，培养液每10天交换半量，每10天摇瓶1次，培养2个月，将烧瓶内 的雌配子体连同培养液移到2 3个烧瓶内，再添加培养液进行分瓶增殖，获得雌配子体；
所述培养液为向1L加热至80°C经过滤后的自然海水中添加NaN03100mg、 NaH2P04 12H20 20mg及PI溶液lml。 上述a步骤所述保存培养的裙带菜雌配子体是经过如下步骤得到 f.在裙带菜的繁殖期内，取浮筏栽培成熟的种藻成熟孢子叶，经阴干剌激后放入
添加消毒海水的烧杯内，当烧杯中的海水呈浅褐色时捞出孢子叶，用吸管取孢子水移到添
加培养液的培养皿内，将培养皿在温度为20°C 、光照强度为2000Lx的条件下培养1个月，培
养液每10天全量交换1次； g.在显微镜下辨别雌配子体和雄配子体后，将雌配子体移到另外的培养皿内，添 加培养液进行裙带菜雌配子体分离培养2个月，将雌配子体藻团从培养皿底面上剥下，移 到烧瓶中，添加培养液后进行保存培养，培养液1个月全量交换1次。 本发明是利用裙带菜雌配子体排出的未受精卵孤雌生殖形成单倍体的幼苗，采用 除去假根的诱导方法使其体细胞产生雌配子体，该雌配子体成熟后排出的卵与正常雄配子 体成熟放出的精子受精可萌发成裙带菜幼苗，操作简单、成本低廉。由于所产出的雌配子体 其来源的种雌配子体具有相同的遗传性状，与正常雌雄配子体同样可以长期保存培养，可 广泛地应用于裙带菜杂交育种研究和苗种生产；本发明所产出的雌配子体，通过与其他品 系和地方种雄配子体杂交可以培育出大量的优质(生长速度快、质量好)高产杂交幼苗，从 根本上解决了裙带菜杂交苗生产中雌配子体数量不足问题，达到规模化产业化应用水平。
具体实施例方式 实施例1 :
4
可按照现有技术雌雄分离的方法将雌雄裙带菜配子体分离后单独保存培养，之后 按如下步骤进行 a.取保存培养的裙带菜雌配子体(湿重)10mg，添加消毒300ml海水后用组织搅 拌机切碎为190 210 m藻段，形成种雌配子体体液，用吸管将种雌配子体体液按1ml/培 养皿移至多个培养皿(直径9cm，下同)内，添加培养液(添加营养盐的消毒海水)后移到 温度为20°C 、光照强度为2000Lx、光照时间为12小时/日的条件下培养12天，培养液每3 天全量交换l次；裙带菜雌配子体的湿重与添加消毒海水的体积可以按上述10mg : 300ml 的比例进行调整。 培养7天后观察，可见部分裙带菜雌配子体开始发育成熟形成卵囊并排出卵，挂 在卵囊袋上等待受精，培养12天后80%的雌配子体排出卵，显微镜下可见大多数的卵因无 精子受精落到培养皿底面上死亡，约有10%左右的未受精卵孤雌生殖萌发形成幼苗。
b.将生长有孤雌生殖幼苗的培养皿移到温度为15t:、光照强度为2000Lx、光照时 间为12小时/日的条件下继续培养至孤雌生殖幼苗长度达到0. 4 0. 6cm，培养液每3天 全量交换1次； c.用消毒镊子将孤雌生殖幼苗从培养皿底面上剥下，铺在经过灭菌消毒的载玻片 上，将消毒刀片将幼苗假根从柄的部位去除，将剩余叶片移到300ml烧杯内，添加培养液后 移到温度为2(TC、光照强度为2000Lx、光照时间为12小时/日的条件下培养2个月，培养 液每7天全量交换1次。 切除假根后的藻体(叶片)失去极性，细胞脱离藻体的束缚后向多方向生长，叶片 呈多角形，显微镜下可见部分细胞体积膨大，细胞内原生质增多呈浓褐色。随后，可见膨大 细胞产生突起并逐渐向外延伸拉长形成雌配子体。随着培养时间的延长，雌配子体形成的 数量逐渐增多，培养1个月后观察，部分叶片上雌配子体的形成率达到体细胞总数的10% 以上，诱导产生的雌配子体在适宜的培养条件进行快速的细胞分裂，培养2个月后已成为 肉眼可见的多细胞分枝雌配子体藻团。 d.将多个生长雌配子体藻团的叶片移到组织捣碎机中，添加培养液后打碎至 490 510 ii m左右的藻段形成雌配子体体液，叶片湿重与培养液体积比为10mg : 300ml， 汲取雌配子体液按lml/培养皿移至多个培养皿中，添加培养液后移到温度为2(TC、光照强 度为2000Lx、24小时/日温度光照条件下培养2个月。 培养l个月后，肉眼可见雌配子体已布满培养皿底面，培养2个月后，雌配子体已 经长满培养皿。 e.使用灭菌毛刷将培养皿内的雌配子体藻团刷下，移到灭菌后的5000ml烧瓶中， 添加培养液后在d步骤所述条件下增殖和保存培养，培养液每10天交换半量，每10天摇瓶 l次，培养2个月后，可见雌配子体藻团直径达到lmm以上，烧瓶内呈褐色，此时可将烧瓶内 的雌配子体连同培养液移到2 3个烧瓶内，添加培养液后进行分瓶增殖，从而获得大量雌 配子体。 实施例2 : 其他步骤均如实施例1， a步骤所述保存培养的裙带菜雌配子体可以按照以下方 式得到 f.在裙带菜的繁殖期内，取浮筏栽培种藻成熟的孢子叶，经阴干剌激后放入添加消毒海水的烧杯内，当观察到有大量孢子放散孢子水呈浅褐色时捞出孢子叶，用吸管取少 量孢子水移到添加培养液(添加营养盐的消毒海水)的培养皿内，2小时后，可见培养皿底 面有圆形的胚孢子附着，将培养皿移到温度为2(TC、照度为2000Lx的条件下培养培养1个 月，培养液每10天全量交换1次； 培养2天后，附着在培养皿内的裙带菜胚孢子萌发形成雌雄配子体，培养1个月 后，肉眼可见生长在培养皿内的雌雄配子体藻团。 e.在显微镜下辨别雌配子体和雄配子体后，用消毒镊子将雌配子体移到另外的培 养皿内，添加培养液后进行裙带菜配子体分离培养，培养2个月后，生长在培养皿内的裙带 菜雌配子体藻团已经达到1. 0mm左右，将雌配子体藻团从培养皿底面上剥下，移到300ml烧 瓶中，添加培养液进行保存培养，培养液1个月全量交换1次。 a g步骤所述培养液均为向1L加热至8(TC经过滤后的自然海水中添加 NaN03100mg、 NaH2P04 12H20 20mg及PI溶液1ml 。 PI溶液公开于西澤一俊，千原光雄。藻类研究法[M]東京共立出版株式会社， 1979 :281 293. 实验在8月中下旬，将本发明实施例增殖后的雌配子体与室内培养的不同品系 裙带菜正常雄配子体按2 : l的比例混合，用组织捣碎机切碎至200ym左右的藻段后撒在 苗帘的苗种绳上，静置3天待雌雄配子体在苗种绳上附着牢固后将苗帘移到2吨培育水槽 内培养，温度、光照条件下设定为20°C 、2000Lx、 12小时/日，培养用水为当地海水经沉淀过 滤后，每吨海水中条件硝酸钠20mg、磷酸二氢钾5mg，培养用水每2天全量交换1次。
结果诱导获得的雌配子体和正常的雄配子体在切碎一周后陆续开始发育成熟， 雌配子体形成卵囊并排出卵，雄配子体形成精子囊并放出精子，卵受精后萌发为裙带菜幼 苗。经过1个月左右的培育，幼苗长度达到lmm以上，在9月20日前后将生长幼苗的苗帘 移到海区浮筏上暂养。经过1个月左右的海区暂养，幼苗长度达到0. 5cm以上，将生长幼苗 的维尼纶绳剪成3cm小段，以35cm间距夹在长8m、直径3cm的栽培苗绳上，将栽培苗绳平挂 在裙带菜栽培浮筏上进入栽培阶段，至第二年3月栽培为商品裙带菜。
权利要求
一种诱导裙带菜孤雌生殖幼孢子体体细胞产生雌配子体的方法，其特征在于按照如下步骤进行a.取保存培养的裙带菜雌配子体10mg，添加300ml消毒海水后用组织搅拌机切碎至190～210μm藻段形成种雌配子体体液，将种雌配子体体液按1ml/培养皿移至多个培养皿内，添加培养液后在温度为20℃、光照强度为2000Lx、光照时间为12小时/日的条件下培养12天，培养液每3天全量交换1次；b.将生长有孤雌生殖幼苗的培养皿在温度为15℃、光照强度为2000Lx、光照时间为12小时/日的条件下继续培养至孤雌生殖幼苗长度达到0.4～0.6cm，培养液每3天全量交换1次；c.将孤雌生殖幼苗从培养皿底面上剥下，铺在经过灭菌消毒的载玻片上，将幼苗假根从柄的部位去除，将剩余叶片移到烧杯内，添加培养液后在温度为20℃、光照强度为2000Lx、光照时间为12小时/日的条件下培养2个月，培养液每7天全量交换1次；d.将多个生长雌配子体藻团的叶片移到组织捣碎机中，添加培养液后打碎至490～510μm的藻段形成雌配子体体液，叶片湿重与培养液体积比为10mg∶300ml，汲取雌配子体液按1ml/培养皿移至多个培养皿中，添加培养液后在温度为20℃、光照强度为2000Lx、24小时/日温度光照条件下培养2个月；e.将培养皿内的雌配子体藻团置于灭菌后的烧瓶中，添加培养液后在d步骤所述培养条件下增殖和保存培养，培养液每10天交换半量，每10天摇瓶1次，培养2个月，将烧瓶内的雌配子体连同培养液移到2～3个烧瓶内，再添加培养液进行分瓶增殖，获得雌配子体；所述培养液为向1L加热至80℃经过滤后的自然海水中添加NaNO3100mg、NaH2PO4·12H2O 20mg及PI溶液1ml。
2. 根据权利要求1所述诱导裙带菜孤雌生殖幼孢子体体细胞产生雌配子体的方法，其特征在于所述a步骤保存培养的裙带菜雌配子体是经过如下步骤得到f. 在裙带菜的繁殖期内，取浮筏栽培成熟的种藻成熟孢子叶，经阴干剌激后放入添加消毒海水的烧杯内，当烧杯中的海水呈浅褐色时捞出孢子叶，用吸管取孢子水移到添加培养液的培养皿内，将培养皿在温度为20°C 、光照强度为2000Lx的条件下培养1个月，培养液每10天全量交换1次；g. 在显微镜下辨别雌配子体和雄配子体后，将雌配子体移到另外的培养皿内，添加培养液进行裙带菜雌配子体分离培养2个月，将雌配子体藻团从培养皿底面上剥下，移到烧瓶中，添加培养液后进行保存培养，培养液1个月全量交换1次。
全文摘要
本发明公开一种操作简单、成本低廉、所产出的雌配子体成熟率高、可为裙带菜规模化苗种生产提供大量雌配子体的诱导裙带菜孤雌生殖幼孢子体体细胞产生雌配子体的方法，是将室内保存培养的裙带菜雌配子体切碎后放置在适合于其发育成熟的温度、光照及营养盐条件下培养，当雌配子体发育成熟大量形成卵囊并排出卵后，因无精子受精导致大部分未受精卵死亡，少数未受精卵孤雌生殖萌发成幼苗，当孤雌生殖幼苗生长至0.4～0.6cm时，根据细胞全能性的生物学原理，采用切除假根的方法使藻体失去极性和对体细胞的束缚，诱导幼苗体细胞产生雌配子体。
文档编号C12N5/04GK101717748SQ20091022026
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者张泽宇, 曹淑青, 李晓丽, 由学策 申请人:大连水产学院