专利名称：：一种含有枯草芽孢杆菌的多功能生物制剂的制作方法
技术领域：
：本发明为含有枯草芽孢杆菌的多功能生物制剂，涉及土壤改良和抗重茬剂的配方和制备方法。
背景技术：
：良好的土壤条件是作物丰产的必要条件，但是由于气候干旱，化肥过度使用，不合理的栽培和管理，连作等原因引起土壤生态恶化，作物减产，造成了巨大的经济损失。土壤生态的恶化对作物的影响主要是土壤板结引起的根系水、汽、肥失衡和重茬病原菌引起的重茬病害。探索有效地方法打破土壤板结，控制重茬病害具有巨大的经济效益和社会意义。目前，打破土壤板结的方法主要是机械深耕和施用土壤改良剂。机械深耕是利用大马力农业机械，翻耕土壤厚度达到60cm以上，疏松硬化的土壤，重构团粒结构，提高土壤肥力，保水保墒，这种方法无污染，不破坏有益菌群。缺点是土壤翻动量大，容易形成高低垄，影响土壤平整度，并且劳动强度大，成本高。施用土壤改良剂能够有效改良土壤团粒结构，起到通风通气、保水保墒的作用。土壤改良剂包括人工合成改良剂和天然改良剂。聚丙烯酰胺，沥青乳剂等人工合成改良剂成本高，持续时间短，对生态环境有不利影响。天然改良剂如多聚糖、腐殖酸、泥炭具有同样的改良效果，但成本相对要低，绿色化环保，具有明显的优势。抗重茬病害主要方法有高温处理，化学药剂处理，微生物菌剂处理。高温处理是通过覆盖地膜等方式提高土壤温度(40-5(TC，15天)达到杀灭病原菌的效果。此法只能对地表进行浅层灭菌，对深层土壤没有显著效果。化学药剂处理的方法，以氯化苦和溴甲烷使用较多，优点是对土壤病原菌的毒性强，效果显著。缺点是对环境造成不利影响，在杀灭病原菌的同时，将土壤中的有益菌群破坏，对作物生长不利，对人畜有毒害作用。微生物杀菌剂通过外施生防菌，固氮、解磷、解钾等有益菌种，利用微生物间的竞争，拮抗，重寄生等作用，抑制或杀灭病原菌，保护并促进植物根系生长，提高土壤肥力。是一种高效环保的抗重茬病害的方法。土壤的板结与重茬病害往往是相伴而生的，但是目前还没有一种有效的方法，同时具备土壤改良和重茬病害防治的效果。
发明内容本发明目的在于提供一种结合了天然土壤改良剂的土壤改良效果和微生物土壤杀菌剂防治重茬病害效果的多功能生物制剂。其效果在于(1)利用生防微生物阻断有害菌群侵染植物并杀灭病原菌，诱导植物产生抗病性，防死苗烂棵；(2)利用微生物与黄腐酸成分的复合增效作用，诱导根系生长，实现生根壮苗，增强抗病能力；(3)利用微生物与黄腐酸、硫酸锌的复合增效作用，打破土壤板结，形成团粒结构，实现免深耕作，保水保墒、缓解肥害、提高地力。为了实现上述目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DLD2菌株。所述枯草芽孢杆菌DLD2菌株是从山东寿光菜园土壤中分离，使用牛肉膏、蛋白胨培养基，利用涂布平板法培养筛选得到的，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DLD2，该菌种已于2009年8月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，编号为CGMCCNO.3222，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DLD2有以下特征单个细胞0.70.8X23微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.9X1.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。最适生长温度为28°C。枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法如下将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DLD2菌种经LB平板活化，接到液体LB培养基中，进行摇床培养；再接种进入种子罐、二级种子罐、发酵罐中搅拌通气发酵培养；然后进入乳化罐中乳化、包埋，再进入双效浓縮器浓縮制得枯草芽孢杆菌培养物，即为枯草芽孢杆菌发酵液。菌液中菌含量达到lX109-3Xl(T/ml。具体制备方法为枯草芽孢杆菌种子培养将枯草芽孢杆菌菌种经LB平板活化，再接到液体LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L)中，在28°C、转速120rpm下，摇床培养24h。枯草芽孢杆菌的发酵方法发酵培养基为蔗糖20g/L、硫酸铵5g/L、麸皮50g/L、柠檬酸三钠2.5g/L、K2HP043H200.3g/L、MgS047H200.5g/L、FeS047H200.05g/L。发酵培养的条件如下发酵温度3(TC，初始pH值7.2，接种量3X_7%，最适接种量5%。发酵方法如下按接种量送入种子罐中搅拌通气培养24h，再进入二级种子罐中搅拌通气培养24h，然后注入发酵罐中搅拌通气发酵培养48h;发酵结束后，进入乳化罐中乳化、包埋，再进入双效浓縮器，在45°C的温度下浓縮制枯草芽孢杆菌，制得枯草芽孢杆菌发酵液。菌液中菌含量达到lX109-3Xl(T/ml。应用上述枯草芽孢杆菌发酵液与土壤改良剂黄腐酸，硫酸锌等成分进行复配，可制得用于土壤改良、抗重茬的多功能生物制剂。本发明所述土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的组分包括枯草芽孢杆菌发酵液、黄腐酸、硫酸锌，各组分重量份数为枯草芽孢杆菌发酵液30—65黄腐酸2—30硫酸锌0.5—5为了提高应用效果和改善制剂性，本发明所述土壤改良、抗重茬多功能生物制剂中还可添加如下辅助组分维生素C和/或a奈乙酸和/或绿原酸和/或氨基水杨酸及糊具体制剂中的原料组分及其重量份数如下组分有效范围份数较好范围份数最佳范围份数枯草芽孢杆菌发酵液30—6535-—5040-一45黄腐酸2—305-—2510-一20硫酸锌0.5—51--53画一5维生素c4-125-106--8a奈乙酸0.5-1.50.6-1.20.7-0绿原酸6-158-139--10氨基水杨酸3-105--86--7糊精5-106--97--8其中枯草芽孢杆菌发酵液浓度中菌含量达到30亿/ml。其他组分含量按100%计。本发明所述土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的制备方法为①制取枯草芽孢杆菌发酵液首先将枯草芽孢杆菌试管中的菌种经LB平板活化，接到液体LB培养基中，灭菌后在摇床上培养，制得种子液；再放进种子罐中培养，不断搅拌，再进入二级种子罐搅拌通风培养，然后注入发酵罐中发酵；搅拌混匀，进入乳化罐中乳化，再进入双效浓縮器，在45°C的温度下浓縮制得枯草芽孢杆菌发酵液；作为微生物成分A备用。(加工中应无菌操作)。②将黄腐酸，硫酸锌加入50-60°C的水中充分搅拌溶解，螯合，逐步降温至30±2°C;作为土壤改良成分B备用。③氨基水杨酸和/或绿原酸和/或a奈乙酸和/或维生素C加入50-60°C的水中，充分搅拌溶解，逐步降温至30±2°C，作为植物诱导因子C备用。④最后将上述备用的微生物成分A，土壤改良成分B，植物诱导因子成分C在配料罐中合并、混匀、添加糊精成分并进行乳化加工，经检测合格，即为本发明的制剂成品。(上述制剂加工技术，除具体说明外，均参照现有技术)。有益效果本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，是一种自然环境中广泛存在的对人畜无害的生防微生物。枯草芽孢杆菌能够通过生态位的竞争作用降低细菌性病原菌的侵染，通过溶菌作用降低真菌性病原菌侵染。此外，还能分泌抗菌物质和细胞壁溶解酶类杀灭病原菌。枯草芽孢杆菌是一类植物促生根圈细菌(Plantgrowth-promotingrhizobaceria)，能够促进作物生长。本发明所述的黄腐酸，属于腐植酸类，能够促进土壤团粒形成，使土壤疏松，具有良好的吸附性。从而保肥、稳肥、保水、透气，克服土壤的板结现象，为提高土壤肥力打下基础。腐植酸还能够通过促进作物呼吸作用，促进根系生长发育实现壮苗。腐植酸是一种高效环保的天然土壤改良剂，并且制造工艺简单，价格低廉。6本发明所述的硫酸锌是一种补充微量元素。由于作物的重茬种植，不断吸收土壤中的特定的微量元素且得不到补充，尤其是锌元素最易在重茬连作土壤中缺乏，补充硫酸锌有助于缓解重茬引起的减产。氨基水杨酸，绿原酸，a奈乙酸，维生素C作为植物诱导因子C，有利于促进作物生长、诱导植物体内增加抗病活力，提高抗病能力。上述各组分的合理复配，能够产生协同增效作用。本发明具体使用方法可以灌根、随水浇灌、喷施、蘸根。本发明生物制剂具有土壤改良和抗重茬病害双重效果，较全面解决了土壤生态恶化引起土壤板结和重茬病害。具体实施例方式制剂配方实施例例1、本发明土壤改良、抗重茬多功能生物制剂由以下按重量(份)比的原料配制而成枯草芽孢杆菌发酵液42、黄腐酸15、硫酸锌4、维生素C7、a奈乙酸0.8、绿原酸10、氨基水杨酸7、糊精8、加水至100份。例2、本发明土壤改良、抗重茬多功能生物制剂由以下按重量(份)比的原料配制而成枯草芽孢杆菌发酵液40、黄腐酸10、硫酸锌3、维生素C6、a奈乙酸0.7、绿原酸9、氨基水杨酸6、糊精7、加水至100份。例3、本发明土壤改良、抗重茬多功能生物制剂由以下按重量(份)比的原料配制而成枯草芽孢杆菌发酵液45、黄腐酸20、硫酸锌5、维生素C7、a奈乙酸0.8、绿原酸9、氨基水杨酸6、糊精8、加水至100份。本发明土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的制备方法①枯草芽孢杆菌发酵液的制取方法(加工中应无菌操作)将枯草芽孢杆菌菌种经LB平板活化，接到液体LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L)中，在28。C、转速120rpm下，摇床培养24h，按3%接种量进行种子罐中搅拌通气培养24h，在进入二级种子罐中搅拌通气培养24h，然后注入发酵罐中搅拌通气培养48h，发酵结束后，进入乳化罐中乳化、包埋，再进入双效浓縮器在45t:的温度下浓縮，制得枯草芽孢杆菌发酵液；作为微生物成分A备用。②将黄腐酸，硫酸锌加入50-60°C的水中充分搅拌溶解，螯合，逐步降温至30±2°C;作为土壤改良成分B备用。③将氨基水杨酸，绿原酸，a奈乙酸，维生素C加入50-6(TC的水中充分搅拌溶解，逐步降温至30士2t:，作为植物诱导因子C备用。④最后将上述备用的微生物成分A，土壤改良成分B，植物诱导因子成分C在配料罐中合并、混匀、添加糊精成分并进行乳化，再经检测合格即为本发明的成品；具体应用实例实例1:(1)土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的配方参照配方实施例1。(2)使用方法于山东曲阜市董家乡草莓大棚进行。使用本发明稀释60倍喷施地面，结合整地翻入地下。在草莓定植后使用本发明稀释300-400倍喷施地面，连用3-4次，喷施间隔10-15天。每666.71112用量每次2-3升。草莓品种为美王1号。在相邻地块以不施用本发明作为对照。每小区面积为1001112，三次重复。其他管理全部同常规。对幼苗期的根、茎、叶的生长状况进行了调查。试验结果见表1:表1本发明对草莓幼苗期根、茎、叶的影响名称对照本发明单株根系数(根)3652根长度(厘米)2226毛细根(根)3761茎粗度(厘米)0.40.8单株年生长叶片(片)183120度以下每生一片叶需(天)97有效叶龄(天)4563由表1可知，施用本发明后，平均单株根系数、根长度、毛细根数量分别增加了44.4%、18.2%和64.9%，平均茎粗度增加了1倍，叶片数量、生长速度，有效叶龄，分别提高了72.2%、28.6%和40%。说明使用本发明可以改善土壤环境，促进草莓生根壮苗，效果非常显著。实例2(1)土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的配方参照配方实施例1。(2)使用方法于山东金乡县进行，这一地区棉花重茬种植在5年以上，化肥不合理使用引起的土壤板结严重，土传病害盛行。试验作物为棉花。使用本发明稀释60倍喷施地面和有机肥拌施，结合整地翻入地下。每666.7m2用量2-3升。在相邻地块以不施用本发明作为对照。每小区面积为1001112，三次重复。其他管理全部同常规。进行苗期病害防治效果调查，分别为定植后10天、20天、30天、40天、45天，对这一阶段由因土传病、倒春寒、气温、地温、高湿引起的猝倒病、立枯病、根腐病、红腐病等苗期病害，进行调查统计。试验结果见表2:表2本发明对棉花苗期抗病能力的影响8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可知，施用了本发明后，病死苗，染病苗在整个苗期(10天-45天)得到了有效地控制，维持了较高的健康苗率，表明该发明能够在棉花易感病的苗期，改善土壤环境，有效控制土传病害的发生。对于多年连作引起的重茬病害具有显著的预防效果。实例3(1)土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的配方参照配方实施例1。(2)使用方法于山东大学生物化学与分子生物学研究所试验田进行土壤改良测试。以试验田土作为实验对象。使用本发明稀释60倍喷施土壤，以喷施蒸馏水为对照组。取样、测定方法参照中华人民共和国国家标准土壤环境质量标准(GB15618-1995)。分别测定对照组和施用本发明的实验组的土壤有机质含量、持水量、容重。表3本发明对土壤有机质、含水量、容重的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表3可知，施用本发明后，土壤有机质、持水量、土壤容重都有显著提高。结果表明本发明能够有效改善土壤颗粒度，打破土壤板结，提高土壤肥力和持水量。具有明显的土壤改良效果。实例4(1)土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的配方参照配方实施例1。(2)使用方法于山东大学生物化学与分子生物学研究所试验田进行土壤参数检测。土壤采用试验田土。使用本发明稀释60倍喷施土壤，以盆栽黄瓜苗施用蒸馏水作为对照。共100盆，每盆3株。其他管理全部同常规。分别在施用后0d，3d，6d，9d，12d，24d对幼苗根系进行取样。方法参考李春喜主编《生物统计学》第四版(科学出版社)。每个取样点重复三次。测定植物抗病相关酶活力，多酚氧化物酶(PPO)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)，13-1，3-葡聚糖酶含量(e-l，3-Gluconase)。方法参考张志良主编《植物生理学试验指导》第三版(高等教育出版社)。表4本发明对根系中抗病相关酶活力的影响(单位U/mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表4可知，施用本发明后，植物根系中的几种抗病关键酶的活力在3天内迅速提高，这些酶可以有效抑制、杀死土壤中侵染根系的土传病害。酶活力在施用后的24天内都显著高于对照组。在生理生化水平证明该产品能够有效对抗作物土传病害。权利要求一种含有枯草芽孢杆菌的生物制剂，其特征在于所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DLD2，该菌株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，编号为CGMCCNO.3222。2.—种含有枯草芽孢杆菌的生物制剂，其特征在于所述生物制剂的组分包括枯草芽孢杆菌发酵液、黄腐酸、硫酸锌。3.如权利要求2所述的生物制剂，其特征在于所说的生物制剂各组分重量份数为枯草芽孢杆菌发酵液30-65份黄腐酸2-30份硫酸锌0.5-5份。4.如权利要求2所述的生物制剂，，其特征在于所说的生物制剂的组分还包括维生素C和/或a奈乙酸和/或绿原酸和/或氨基水杨酸及糊精。5.如权利要求2或4所述的生物制剂，其特征在于所说的生物制剂各组分重量份数为组分重量份数枯草芽孢杆菌发酵液30-65黄腐酸2-30硫酸锌0.5-5维生素c4-12a奈乙酸0.5-1.5绿原酸6-15氨基水杨酸3-10糊精5-106.如权利要求2或4所述的生物制剂，其特征在于所说的生物制剂各组分重量份数为组分重量份数枯草芽孢杆菌发酵液35-50黄腐酸5-25硫酸锌1_5维生素c5-10a奈乙酸0.6-1.2绿原酸8-13氨基水杨酸5-8糊精6-97.如权利要求1或2所述的生物制剂，其特征在于所说的组分重量份数枯草芽孢杆菌发酵液40-45黄腐酸10-20硫酸锌3-5维生素C6-8a奈乙酸0.7-0.8绿原酸9-10氨基水杨酸6-7糊精7-88.如权利要求2或4所述的生物制剂，其特征在于所说的枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法如下将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DLD2菌种经LB平板活化，接到液体LB培养基中，进行摇床培养；然后接种进行种子罐、二级种子罐、发酵罐中搅拌通气培养发酵；再进入乳化罐中乳化、包埋，再进入双效浓縮器浓縮制得枯草芽孢杆菌发酵液。9.如权利要求2或4所述的生物制剂，其特征在于所说的枯草芽孢杆菌发酵液的具体制备方法如下枯草芽孢杆菌种子培养将枯草芽孢杆菌菌种经LB平板活化，再接到液体LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L中，在28"C、转速120rpm下，摇床培养24h;枯草芽孢杆菌的发酵方法发酵培养基为蔗糖20g/L、硫酸铵5g/L、麸皮50g/L、柠檬酸三钠2.5g/L、K2HP04*3H200.3g/L、MgS047H200.5g/L、FeS047H200.05g/L。发酵培养的条件如下发酵温度3(TC，初始pH值7.2，接种量3X_7%，最适接种量5%。发酵方法如下按接种量送入种子罐中搅拌通气培养24h，再进入二级种子罐中搅拌通气培养24h，然后注入发酵罐中搅拌通气发酵培养48h;发酵液进入乳化罐中乳化、包埋，再进入双效浓縮器，在45°C的温度下浓縮制得枯草芽孢杆菌发酵液。10.如权利要求2或4所述的生物制剂的制备方法，其特征在于具体制备方法如下①制取枯草芽孢杆菌发酵液，作为微生物成分A备用；②将黄腐酸，硫酸锌加入50-6(TC的水中充分搅拌溶解，螯合，逐步降温至30±2°C;作为土壤改良成分B备用；③氨基水杨酸和/或绿原酸和/或a奈乙酸和/或维生素C加入50-60°C的水中充分搅拌溶解，逐步降温至30士2t:，作为植物诱导因子C备用；④最后将上述备用的微生物成分A，土壤改良成分B，植物诱导因子成分C在配料罐中合并、混匀、添加糊精成分，进行乳化加工，经检测合格，即为生物制剂成品。全文摘要本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DLD2菌株，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，编号为CGMCCNO.3222。本发明还提供了利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DLD2的发酵液与黄腐酸、硫酸锌等组分进行复配制备用于土壤改良和抗重茬的多功能生物制剂的配方和制备方法。该生物制剂的功能效果为(1)利用生防微生物阻断有害菌群侵染植物并杀灭病原菌，诱导植物产生抗病性，防死苗烂棵；(2)利用枯草芽孢杆菌与黄腐酸、硫酸锌复配增效作用，即可诱导根系生长，实现生根壮苗，又能打破土壤板结，形成团粒结构，实现免深耕作，保水保墒、缓解肥害、提高地力。文档编号C12R1/125GK101792669SQ20091023098公开日2010年8月4日申请日期2009年11月27日优先权日2009年11月27日发明者孙斐,宋保平,尹倩倩,李淑梅,陈靠山申请人:山东多利德生物科技有限公司