专利名称：植物乳杆菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明一株优良乳酸菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
生物胺是一类含氮的脂肪族、芳香族或杂环类有机化合物。主要有酪胺、组胺、腐 胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺。在人体内积累到较高数量时就会产生毒害，如外部 血管膨胀导致高血压和头痛，以及肠道平滑肌的收縮造成腹部痉挛、腹泻和呕吐等，严重的 还会危及生命。
食品中常见的8种生物胺中精胺和亚精胺是原料中带来的，其它生物胺均由微生
物产生的氨基酸脱羧酶催化氨基酸脱羧产生的，主要存在于蛋白质含量高的发酵食品中。
发酵肉制品中生物胺含量已受广大关注，国外学者已做了大量的调查，认为生物胺在发酵
肉制品中普遍存在，特别是在发酵香肠中，一些产品中生物胺远远超过了FDA规定的标准。
例如，传统中式香肠属自然发酵香肠，其中微生物菌系及其复杂。在本课题组的调查研究中
发现，传统中式香肠中生物胺含量，远远高国外学者报道，生物胺含量达1651.84mg/kg。对
消费者的健康有重要影响。发酵肉制品中主体生物胺一般为酪胺，腐胺和尸胺。 目前在传统肉制品发酵生产中对生物胺的控制主要从两方面可以实现一是控制
产胺菌的生长，另一方面采用能够产生物胺氧化酶的微生物产生的生物胺氧化酶，减少生
物胺积累。例如，在传统中式香肠中主要的产胺菌是肠细菌，肠细菌产生生物胺是在对数生
长后期，并且菌数达到一定浓度时才协同产生生物胺。所以抑制肠细菌的生长，把肠细菌控
制在最低浓度，是有效控制生物胺产生的重要措施。 因此，为控制传统中式香肠中生物胺的产生和累积，以生长能力强，抑制肠细菌能 力强，产生物胺氧化酶为目的，从生物胺含量低的传统中式香肠样品中分离筛选出一株植 物乳杆菌，可有效控制生物胺的产生和累积。
发明内容
本发明的目的在于针对肉制品发酵生产中产胺菌会产生生物胺，筛选一种能够 在肉制品发酵生产中抑制产胺菌的生长，产生生物胺氧化酶，氧化酪胺，组胺，苯乙胺和色 胺的植物乳杆菌菌株及其应用。 本发明的目的是这样实现的 一 种植物乳杆菌(Lactobaci 1 lusplantarum) xlbf001菌株，其特征在于菌株的保藏号为CGMCC No. 3166，菌株在MRS琼脂培养基上， 37t:培养36h，在改良MRS液体培养基中富集，白色菌落，直杆，成短链，革兰氏阳性，无鞭 毛，同型发酵，发酵葡萄糖不产气，发酵核糖时产生乙酸和乳酸，不还原亚硝酸盐；该菌株在 普通显微镜下呈杆状形，该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890357。
在本发明中所述的MRS琼脂培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠 檬酸氢三铵2g，葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰 0. 25g，琼脂18克，蒸馏水1000mL，pH值6. 2 6. 4 ;所述的改良MRS液体培养基为蛋白胨
310g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢三铵2g，葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 25g，碳酸钙0. 4g，半胱氨酸盐酸盐，乳精粉7. 5g，啤酒65ml，蒸馏水1000mL， pH值6. 2 6. 4。 —种上述植物乳杆菌菌株的应用，其特征在于将菌株活化、扩培、菌体收集后形成发酵剂，在肉制品发酵生产中抑制产胺菌的生长，产生生物胺氧化酶，可氧化降解酪胺，组胺，苯乙胺和色胺。 在所述植物乳杆菌菌株的应用中所述的菌株活化是指从斜面挑取菌落接种于装有液体培养基的试管中，37t:静置培养24小时后，取菌液再接种于装有改良MRS液体培养基的试管中37t:静置培养22小时，试管中的接种量为106cfu/ml，取菌液接种活化至少反复三次；所述的扩培是指将活化的菌液接种于装有改良MRS液体培养基的三角瓶中，三角瓶中的接种量为106cfu/ml，37t:静置培养22小时，形成富集菌种的菌液；所述的菌体收集是指取富集菌种的菌液于无菌离心管中，12000转离心10分钟，在无菌条件下弃去上清液获得菌体； 在所述植物乳杆菌菌株的应用中所述的发酵剂是指将收集到的菌体用无菌生理水洗出直接作为发酵剂，或将收集到的菌体加入保护剂冷冻干燥，制成的干粉发酵剂。 保护剂为15%的脱脂乳+甘油50mL/L+蔗糖30g/L5+麦芽糊精10g/L+谷氨酸钠20g/L+酵母浸提膏20g/L。 在所述植物乳杆菌菌株的应用中所述的产胺菌是指屎肠球菌，粪肠球菌，产气肠杆菌，大肠埃希杆菌，阴沟肠杆菌；所产生的生物胺分别是酪胺，腐胺，尸胺，苯乙胺；产生的生物胺氧化酶可氧化降解的生物胺为酪胺，苯乙胺，色胺和组胺。 在所述植物乳杆菌菌株的应用中在肉制品发酵生产的配方中发酵剂的加入量为106—7cfu/g，同时需要加入1. 5%的葡萄糖。 本发明的优点在于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xlbf001生长能力强，富集培养后培养基中菌体浓度达1(^cfu/ml，发酵剂制备工艺简单，将获得的菌体置于保护剂，可以在生产干粉发酵剂时减少植物乳杆菌的失活率，发酵剂在肉制品发酵生产中能有效抑制肠细菌的生长繁殖，控制生物胺的产生，另外本菌株产生的生物胺氧化酶，可减少生物胺的累积。
图1是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xlbfOOl菌株在普通显微镜下的图片。
具体实施例方式
实施例l 菌株的筛选和保藏 本菌株是从传统中式香肠中分离出来不产生物胺的菌株，将分离到菌株培养液离心，取上清液，观察上清液对五种产胺菌的抑制能力。并将其接入含有生物胺的培养基中，检测氧化减少生物胺能力。 该菌属革兰氏阳性菌，白色菌落，直杆，成短链，无鞭毛，同型发酵，发酵葡萄糖不产气，发酵核糖时产生乙酸和乳酸，不还原亚硝酸盐，不产生吲哚，硫化氢产生阴性，凝固酶 阴性；该菌株在普通显微镜下呈杆状(见图1)。 该菌株根据Gen bank比对结果，命名植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) xlbf001，于2009年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 号为CGMCC No. 3166。以U968和L1401为引物扩增的该菌株16S rDNA的Genbank登陆号 为GQ890357。
实施例2 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xlbf001对产胺菌的抑制作用
实验用产胺菌屎肠球菌 培养基MRS琼脂培养基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢三铵2g， 葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 25g，琼脂18克， 蒸馏水1000mL， pH值6. 2-6. 4)
实验方法 将传统中式香肠中优势产胺肠细菌屎肠球菌涂布于MRS琼脂培养基；将24小时 37t:培养的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xlbf001菌液，8000转离心10分钟， 用无菌枪头吸取上清液于无菌离心管中。取已灭菌的直径为0. 6cm滤纸沾取此上清液，并 放置于上述接种肠细菌的MRS琼脂培养基上，观察抑菌圈。抑菌圈直径为大于1. Ocm，说明 xlbf001对屎肠球菌有抑制作用。 用同样的方法分别对粪肠球菌、产气肠杆菌、大肠埃希杆菌以及阴沟肠杆菌，抑菌 圈均大于1. Ocm，证明xlbf001对上述产胺菌具有相同的抑制作用。
实施例3植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xlbf001氧化生物胺的作用。
生物胺酪胺、苯乙胺、色胺和组胺。 培养基改良MRS液体培基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢三铵 2g，葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 25g，碳酸钙 0. 4g，半胱氨酸盐酸盐，乳精粉7. 5g，啤酒65ml，蒸馏水1000mL， pH值6. 2 6. 4)
实验方法 实验分成五个组，在各组改良MRS液体培养基中分别加入500ug/ml的酪胺、苯乙 胺、色胺、组胺和对照组，115t:灭菌15min ;冷却后实验组接入植物乳杆菌(Lactobacillus plantar咖)xlbf001，接种量为106cfu/ml， 37°C ，摇床(85转/分钟)培养72小时，HPLC测 各组生物胺浓度的变化，其中酪胺减少了 227. 32ug/ml，苯乙胺减少了 255. 09yg/ml，色胺 减少了 178. 36/ml，组胺减少了 210. 8ii g/ml。说明植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) xlbf001对酪胺、苯乙胺、色胺和组胺氧化降解作用明显。
实施例4
菌体的收集 培养基改良MRS液体培养基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢三铵 2g，葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 25g，碳酸钙 0. 4g，半胱氨酸盐酸盐，乳精粉7. 5g，啤酒65ml ，蒸馏水1000mL， pH值6. 2 6. 4。
称取上述培养基，放800ml蒸馏水中，加热并搅拌均匀至完全溶解后，补水至lOOOml。再次搅拌均匀后，分装于试管中，并用橡皮筛塞紧后，灭菌，以备活化用。将做好的
培养基分装于三角瓶中，灭菌后用于扩培。 1、活化 从斜面挑取菌落接种于装有液体培养基的试管中，37t:静置培养24小时后，取菌液再接种于装有改良MRS液体培养基的试管中37t:静置培养22小时，试管中的接种量为1(fcfu/ml，取菌液接种活化至少反复三次。
2、扩培 将活化的菌液接种于装有改良MRS液体培养基的三角瓶中，三角瓶中的接种量为1(fcfu/ml，37t:静置培养22小时，形成富集菌种的菌液。
3、菌体收集 取富集菌种的菌液于无菌离心管中，10000转离心IO分钟，无菌条件下弃去上清
液。即收集到菌体。
实施例5
发酵剂的制备 1、将收集到的菌体用无菌生理水洗出，形成发酵剂。 2、将收集到的菌体置于保护剂中，制成干粉发酵剂，其中，保护剂为15%的脱脂乳+甘油50mL/L+蔗糖30g/L5+麦芽糊精10g/L+谷氨酸钠20g/L+酵母浸提膏20g/L。
实施例6 在肉制品发酵生产中的应用(以广式香肠为例) 配方去皮猪肉，肥瘦比为1 : 3，含硝精盐2.5% (每公斤食盐中加入6g亚硝酸钠)，葡萄糖1. 5 % ，蔗糖2 % ，生抽1 % ，汾酒4% ，香辛料适量，实施例5中制备的发酵剂106cfu/g。 加工方法 1.将肥肉切成约0. 5cm 放入IO(TC沸水中浸1小时，用冷水冲洗去浮油，沥干，拌上汾酒，蔗糖，4°C 6°C腌制8小时。 2.把瘦肉用绞肉机绞碎或用刀切成黄豆粒大小的碎块，加入含硝精盐，香辛料，生抽和葡萄糖拌均，4t: 6t:腌制24小时后，加入发酵剂拌均。 3.将肥瘦肉放在一起拌匀，灌肠后，用温水洗去肠体表面浮油，并用针在肠表面扎孔，便于放气。 4.沥水后，日晒或烟熏2 3天后，阴干成熟一个月，即可食用。 以本发明生产的广式香肠样品中，生物胺总量低于同期生产的未加发酵剂的广式
香肠样品(下称对照组)的60%以上。本发明生产的样品成熟结束时检测不到肠细菌，而对
照组样品中肠细菌量为102cfu/g。本发明生产的样品中成熟结束时乳酸菌含量为108cfu/
g，对照组样品中乳酸菌数为105cfu/g。可见，植物乳杆菌xlbf001的迅速繁殖可有效抑制
肠细菌，抑制生物胺产生，减少生物胺累积。 以上各实施例不是对本发明的具体限制。
权利要求
一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其特征在于菌株的保藏号为CGMCC No.3166，菌株在MRS琼脂培养基上，37℃培养36h，在改良MRS液体培养基中富集，白色菌落，直杆，成短链，革兰氏阳性，无鞭毛，同型发酵，发酵葡萄糖不产气，发酵核糖时产生乙酸和乳酸，不还原亚硝酸盐；该菌株在普通显微镜下呈杆状，该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890357。
2. 根据权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其特征在 于所述的MRS琼脂培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢三铵2g，葡萄 糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 25g，琼脂18克，蒸馏 水1000mL， pH值6. 2 6. 4 ;所述的改良MRS液体培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母 膏5g，柠檬酸氢三铵2g，葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g， 硫酸锰0. 25g，碳酸钙0. 4g，半胱氨酸盐酸盐，乳精粉7. 5g，啤酒65ml ，蒸馏水1000mL， pH值 6. 2 6. 4。
3. —种保藏号为CGMCC No. 3166的植物乳杆菌菌株的应用，其特征在于将菌株活化、 扩培、菌体收集后形成发酵剂，在肉制品发酵生产中抑制产胺菌的生长，产生生物胺氧化 酶，氧化降解生物胺。
4. 根据权利要求3所述的保藏号为CGMCC No. 3166的植物乳杆菌菌株的应用，其特征 在于所述的菌株活化是指从斜面挑取菌落接种于装有液体培养基的试管中，37t:静置 培养24小时后，取菌液再接种于装有改良MRS液体培养基的试管中37t:静置培养22小时， 试管中的接种量为106cfu/ml，取菌液接种活化至少反复三次；所述的扩培是指将活化的 菌液接种于装有改良MRS液体培养基的三角瓶中，三角瓶中的接种量为1(fcfu/ml，37t:静 置培养22小时，形成富集菌种的菌液；所述的菌体收集是指取富集菌种的菌液于无菌离 心管中，10000转离心10分钟，在无菌条件下弃去上清液获得菌体；获得的菌体可做为发酵 剂直接应用，也可以制成干粉发酵剂。
5. 根据权利要求4所述的保藏号为CGMCC No.3166的植物乳杆菌菌株的应用，其特征在于所述的发酵剂是指将收集到的菌体用无菌生理水洗出直接作为发酵剂，或在菌体中加入保护剂后冷冻干燥，制成干粉发酵剂。
6. 根据权利要求3所述的保藏号为CGMCC No.3166的植物乳杆菌菌株的应用，其特征在于所述的产胺菌是指屎肠球菌，粪肠球菌，产气肠杆菌，大肠埃希杆菌，阴沟肠杆菌 (发酵肉制品中常见的产胺菌)；所产生的生物胺是指酪胺，腐胺，尸胺，苯乙胺；该菌株产 生的生物胺氧化酶可氧化降解的生物胺是酪胺，组胺，苯乙胺和色胺。
7. 根据权利要求3 6之一所述的保藏号为CGMCC No. 3166的植物乳杆菌菌株的应 用，其特征在于在发酵肉制品生产中发酵剂的加入量为106—7cfu/g，同时需要加入1. 5% 的葡萄糖。
全文摘要
本发明涉及保藏号为CGMCC No.3166的一种植物乳杆菌菌株，该菌株可在改良MRS液体培养基中富集。在MRS固体培养基上白色菌落，直杆，成短链，革兰氏阳性，无鞭毛，同型发酵，发酵葡萄糖不产气，发酵核糖时产生乙酸和乳酸，不还原亚硝酸盐。应用中将菌株活化、扩培、菌体收集后形成发酵剂，在肉制品发酵生产中抑制产胺菌的生长，产生生物胺氧化酶，氧化降解酪胺、苯乙胺、色胺和组胺。其优点是植物乳杆菌生长能力强，发酵剂制备工艺简单，发酵剂在肉制品发酵生产中能有效抑制肠细菌的生长繁殖，控制生物胺的产生，其产生的生物胺氧化酶，可氧化降解酪胺、苯乙胺、色胺和组胺的含量，它作为发酵剂生产发酵肉制品可有效减少生物胺的累积。
文档编号C12N1/20GK101724591SQ20091023240
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者刘登勇, 卢士玲, 周光宏, 徐幸莲, 舒蕊华 申请人:南京农业大学