专利名称：一株阴沟肠杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株微生物及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
腐胺的化学名称为1，4-丁二胺，生物化学试剂和药物中间体。也是尼龙-46、尼 龙_6及尼龙-66的原料，尤其是尼龙-46广泛用于汽车、摩托车的零部件材料，以代替金 属；尼龙-66用于电子产品的材料；酸性气体吸收剂。目前，制备方法有四种(l)丙烯腈与 氰化氢反应，生成乙二氰，在催化剂作用下加氢而得；(2)以吡咯为原料，在碳酸钠存在下 与盐酸羟胺反应，生成丁二肟，再在钠汞齐作用下，在无水乙醇中加热而得；(3)以2，5_二 氨基戊酸为原料，加热催化脱羧而得。由此可见，目前腐胺的生产方式能源消耗量大，对环 境也有污染。我国腐胺需求量大，但国内企业生产能力和产品质量有限，从国外进口价格很 高。 通过微生物代谢产生腐胺(鸟氨酸在微生物产生的鸟氨酸脱羧酶的作用下，脱羧 产生腐胺)，获得高浓度腐胺液，然后分离腐胺，可降低腐胺的生产成本和能源消耗，也成为 研究的主要课题。
发明内容
本发明的目的在于针对目前腐胺生产存在的问题，提供一种微生物并通过该微 生物代谢产生腐胺，获得高浓度腐胺液。 本发明的目的是这样实现的 一 株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) xlcad001，其特征在于保藏号为CGMCC No. 3162，菌落在VRBDA琼脂培养基上，30°C培养 24h，红白色菌落，1.0-1. 5X0. 3-0.6ym，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普 通显微镜下呈杆状，该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为GQ890353。 在本发明中，VRBDA培养基为酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1. 5g，氯化钠5g，乳糖 10g，中性红0. 03g，结晶紫0. 002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml， PH值7. 3-7. 5。
—株保藏号为CGMCC No. 3162的阴沟肠杆菌的应用，其特征在于从斜面挑取菌 落接种于装有A培养基的试管中，37t:静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在 相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37t:静止培养4天， 接种量为106cfu/ml ;将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度腐胺液， 高浓度腐胺液的腐胺含量为4452. 74ii g/ml ; 所述的A培养基为加入O. 1% L-鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体 培养基为加入0. 005%磷酸吡哆醛和0. 1% L-鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
在本发明中，肠细菌增菌肉汤培养基为蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷 酸二氢钠8g，蒸馏水1000mL，在115。C灭菌15min， pH值7. 2 7. 4。 本发明的优点在于由于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)xlcad001产腐胺 能力强，在上述方法制得的培养液中，腐胺含量可达到4452. 74ii g/ml，用此方法生产腐胺将极大降低生产成本和减少污染。
图1是阴沟肠杆菌在普通显微镜下的照片；
图2是标样的高效液相色谱图； 图3是高效液相检测阴沟肠杆菌培养液的色谱图；
图4是高效液相检测腐胺的标准曲线图。
具体实施例方式
实施例1 菌株的筛选和保藏 培养基 肠道菌增菌肉汤培养基蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠8g，蒸 馏水1000mL，在115。C灭菌15min， pH值7. 2 7. 4。 下层培养基蛋白胨5g，酵母膏5g，牛肉膏5g，氯化钠2. 5g，葡萄糖0. 5g，吐温lg， 硫酸镁0. 4g，硫酸锰0. 03g，磷酸氢二钾2g，拧檬酸三铵2g，碳酸*丐0. lg，硫酸亚铁0. 04g， 维生素BA Olg，磷酸吡哆醛0. 05g，琼脂18克，鸟氨酸(115。C灭菌15min) ;5克，1000ml蒸 馏水，pH5. O，在115。C高压灭菌15分钟; 上层培养基溴甲酚紫0.06g，琼脂20g，1000ml蒸馏水，pH5. 0，在121°C灭菌 10min j VRBDA琼脂培养基为酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1. 5g，氯化钠5g，乳糖10g，中 性红0. 03g，结晶紫0. 002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml， PH值7. 3_7. 5。 在无菌条件下取20克传统中式香肠，无菌条件下剪碎后置于装有180ml已灭菌生 理盐水的三角瓶中，室温230转摇床摇10分钟，取lml接种于肠道菌增菌肉汤培养基中， 37t:培养24小时，取lml培养液用9ml生理盐水逐级稀释到10-100cfu/ml浓度，涂布于产 腐胺检测下层培养基上，37t:培养48小时。缓慢倾入一薄层上层培养基，10分钟内结果记 录完毕，显紫色的菌落为阳性，显黄色为阴性，其中，阳性为能产生腐胺的菌株，阴性为不能 产生腐胺的菌株。 挑取阳性菌株，在VRBDA固体培养基纯化三次以上，用肠细菌增生肉汤培养基 37。C培养24小时，离心后获得阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)xlcadOOl菌株。
该菌株的菌落在VRBDA琼脂培养基上，30 °C培养24h，红白色菌落， 1.0-1.5X0. 3-0.6ym，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普通显微镜下呈杆 状。 该菌株根据Gen bank比对结果，命名阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae) xlcad001，2009年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保 藏号为CGMCC No. 3162。该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为GQ890353。
该菌株加入无菌甘油，在-8(TC冰箱保存。
实施例2 高浓度腐胺培养液制备方法3/4页 培养基 肠道菌增菌肉汤培养基(同实施例1);
制备方法 从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37t:静置培养24小时，试管中的 接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基 中37t:静止培养4天，接种量为106cfu/ml ;将培养后的菌液10000转离心IO分钟，取上清 液，获得高浓度腐胺液. 所述的A培养基为加入O. 1%鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培 养基为加入O. 005%磷酸吡哆醛和0. 1%鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
实施例3 腐胺含量检测方法(高效液相检测)
1 、生物胺标准溶液的配制 准确称取色胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺50mg，用0. 4mol/L的高氯 酸(HC104)定容至50mL，制成lmg/ml储备液备用。分别取以上标准品储备液，用0. 4mol/L HC104配制成终浓度分别为5. 0、10、20、30、40、50ii g/ml的标准溶液，避光、4t:冰箱保存。
2、样品溶液的衍生化 取实施例2的样品lmL于5ml容量瓶中，加入200 ii L的2N NaOH使之呈碱性，然 后加入300iiL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride) 溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于4(TC水浴黑暗中反应处理40min。反应 结束后加入100 ii L的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。 衍生处理后用0. 22 ii m的有机滤膜过滤后，获得样品溶液的衍生物。
3、标准溶液标样的衍生化 分别取5. 0、10、20、30、40、50iig/ml的标准溶液样品lmL于5ml容量瓶中，加入
200 ii L的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300 y L的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml
的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于4(TC水
浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100 ii L的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯
溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0. 22ym的有机滤膜过滤后，获得六组样品溶
液的衍生物。 4、检测方法为 Agilent 1100检测系统，AgilentZORBAX XDB-C18 (4. 6 X 250mm， 2， 5 ii m)，流速为 lmL *min-l，紫外检测波长为254nm，进样量20 y L，柱温30°C ，流动相A为水，流动相B为乙
腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
洗脱时间/min流动相A/%流动相B/先
Elution timeMobile phase AMobile phase B
0.035.065. 0
5.030.070. 0
20.00.0100.0
24. 00.0100.0
25. 035.065.0
30.035.065.0 在图2的生物胺标样的高效液相图中1为色胺，2为苯乙胺，3为腐胺，4为尸胺， 5为组胺，6为酪胺，7为亚精胺，8为精胺。本发明的样品溶液高效液相检测结果如图3所 示。由图3可见，样品溶液中含有腐胺。 利用上述的检测方法检测，响应值为24296892. 9 (参见图4)，根据标准曲线计算 得到结果为445. 274p g/mg，但由于在检测过程中把原样稀释了 10倍，所以最终腐胺含量 为4452.74ug/mg。 以上各实施例不是对本发明的具体限定。
权利要求
一株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，其特征在于保藏号为CGMCC No.3162，菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，红白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普通显微镜下呈杆状，该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890353。
2. 根据权利要求1所述的一株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，其特征在于 VRBDA琼脂培养基为酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1. 5g，氯化钠5g，乳糖10g，中性红 0. 03g，结晶紫0. 002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml， PH值7. 3-7. 5。
3. —株保藏号为CGMCC No.3162的阴沟肠杆菌的应用，其特征在于从斜面挑取菌落 接种于装有A培养基的试管中，37t:静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相 同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37t:静止培养4天，接 种量为106cfu/ml ;将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度腐胺液，高 浓度腐胺液的腐胺含量为4452. 74ii g/ml ;所述的A培养基为加入O. 1% L-鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养 基为加入0. 005%磷酸吡哆醛和0. 1% L-鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
4. 根据权利要求3所述的一株保藏号为CGMCC No.3162的阴沟肠杆菌的应用，其特征 在于所述的肠细菌增菌肉汤培养基为蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠 8g，蒸馏水1000mL， pH值7. 2 7. 4， 115。C灭菌15min。
全文摘要
本发明涉及保藏号为CGMCC No.3162的一株阴沟肠杆菌，菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，红白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普通显微镜下呈杆状。应用时，菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，反复活化五次后，菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，将菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度腐胺液，其中，A培养基为加入0.1％鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛+0.1％鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
文档编号C12P13/00GK101701200SQ200910232710
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者刘登勇, 卢士玲, 周光宏, 徐幸莲, 舒蕊华 申请人:南京农业大学