专利名称：通过定向进化构建的活力提高的脂肪酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及酶活力提高的华根霉脂肪酶突 变体。
背景技术：
脂肪酶(EC 3. 1. 1. 3)不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯 化、酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是脂 肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉 脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度1，3_位置选择性，因此常用于油脂加 工中。此外，根霉脂肪酶还具有稳定性佳，转化效率高等优点，被广泛应用于芳香酯、生物柴 油、手性化合物的生产中。目前为止，国内外已报道了多个根霉脂肪酶的基因序列。日本、德国对米根霉 脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase，R0L)的基因序列和表达做了比较深入的研究，并 先后用大肠杆菌、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母成功表达了脂肪酶基因(Mirming S et al. J Biotechnol,1998,66 147-156 ；Beer HD et al.Biochim BiophysActa,1998, 1399 173-180 ；Ueda M et al. J Mol Catal B :Enzym，2002，17 :113_124)。发明人在前 期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶的华根霉(Rhizopus chinensis CCTCC M 201021)菌株，并从该菌株中克隆得到脂肪酶基因序列(Genbank登录 号EF405962)，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高水平分泌表 达(Yu Xiao-Wei et al. J MolCatal B :Enzym，2009，57 :304_311)。定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对 某一蛋白质酶的基因，通过改进的诱变技术改造的酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛 选有价值的天然酶。近10年来，定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得巨大 的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选 择性等方面(Johannes Tff et al. Curr. Opin. Microbiol，2006，9 :261_267)。酶活力的提高可以用酶的动力学参数K。at值来表示。K。at又称转化数，指每分子酶 或每个酶活性中心在单位时间内能催化的底物分子数(TN)，也称为催化常数。因此，K-值 的提高即代表了酶活的提高。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供酶活力提高的华根霉脂肪酶。本发明的技术方案通过定向进化构建的活力提高的脂肪酶突变体，由华根霉 (Rhizopus chinensis) CCTCC M 201021 脂肪酶基因(Genbank 登录号 EF405962)，运用易 错PCR方法，通过多轮重组和定点突变，经定向进化而获得的脂肪酶突变体，在突变体的氨 基酸序列中，包含氨基酸突变 Alal29Ser、Lysl61Arg、Thrl95Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、 Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸两个、三个或四个突变的组合；以转换数Keat表示，脂肪酶突变体的酶活较出发菌株得到了提高；突变体的测序结果及其K。at提高的倍数为
Kcat提闻脂肪酶突变体氨基酸取代位置Kcat (A的倍数
出发菌株脂肪酶-1138
突变体1-1Alal29Ser1252
突变体1-2Lysl61Arg1479
突变体1-3Thrl95Tyr1479
突变体1-4Ala230Thr1821
突变体1-5Val261Gly1935
突变体1-6Lys322Arg1366
突变体1-7Ser373Asn1707
突变体2-1Alal29Ser/Lysl61Arg2278
突变体2-2Alal29Ser/Ala230Thr1365
突变体2-3Alal29Ser/Val261Gly1593
突变体2-4Lysl61Arg/Thrl95Tyr2845
突变体2-5Lysl61Arg/Lys322Arg1707
突变体2-6Lysl61Arg/Ser373Asn2048
突变体2-7Ala230Thr/Ser373Asn1707
突变体2-8Val261Gly/Ser373Asn3726
突变体3-1Alal29Ser/Ala230Thr/Val261Gly3186
突变体3-2Alal29Ser/Ala230Thr/Lys322Arg2278
突变体3-3Lys16lArg/Thr195Tyr/Ser373Asn2617
突变体3-4Lysl61Arg/Ala230Thr/Ser373Asn2278
突变体3-5Lysl61Arg/Val261Gly/Lys322Arg2731
突变体3-6Ala230Thr/Lys322Arg/Ser373Asn2845
突变体4-1Alal29Ser/Lysl61Arg/Ala230Thr/2073
Lys322Arg
华根霉脂肪酶氨基酸原始序列为SEQ ID NO=I ；华根·_脂肪酶
1. 0 1. 1 1. 3 1. 3 1. 6 1. 7 1. 2 1. 5 2 1. 2
1.4
2.5 1. 5 1. 8
1.5
3.3
2.8 2
2. 3 2
2. 4 2. 5 1. 8
为SEQ ID NO :2，7个突变氨基酸用底色标记显示。 本发明的有益效果本发明运用易错PCR方法对华根霉脂肪酶基因(Genbank登 录号EF405962)进行定向进化，通过多轮重组和定点突变，获得华根霉脂肪酶突变体，这 些突变体包含氨基酸突变 Alal29Ser、Lysl61Arg、Thrl95Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、 Lys322Arg,Ser373Asn以及上述氨基酸突变的组合。以转换数K。at表示，脂肪酶突变体的酶 活得到了提高。
具体实施例方式实施例中涉及到的培养基配方如下LB液体培养基蛋白胨1 %，酵母提取物0. 5 %，NaCl 1 %，pH7. 0。YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) Yeast Extract 1 %, Trypton2%, Dextrose 2%，制作平板时加入Agar 2%。121°C高压灭菌20min。用于筛选G418抗 性时加入G418至终浓度为0. 25mg/mL-l. Omg/mL,即YPD-G418平板。MD(Minimal Dextrose Medium) :YNB 1. 34%, Biotin 4X10_5%, Dextrose 2%, Agar 2%。MM (Minimal Methanol Medium) :YNB1. 34%, Biotin4X 10_5%, Methanol 0. 5%, Agar2%。BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium) :Yeast Extract 1 %, Trypton 2%, YNB 1. 34%, Biotin 4X 10_5%, Glycerol 1 %，磷酸钾溶液 100mmol/L。
BMMY(Buffered Methanol-complex Medium) :Yeast Extract 1 %, Trypton 2%, 34%, Biotin 4X 10_5%, Methanol 0. 5%，磷酸钾溶液 100mmol/L。 培养基中的单位为％ (W/V)。
实施例1、利用易错PCR方法构建华根霉脂肪酶突变文库 利用易错PCR技术在体外向华根霉脂肪酶基因proRCL引入核苷酸突变。 易错PCR的反应条件如下 YNB 1
dCTP(25mmol/L)2μ L
dTTP(25mmol/L)2μ L
dGTP(10mmol/L)1 μ L
dATP(10mmol/L)1 μ L
F(20pmol/y L)1 μ L
R(20pmol/y L)1 μ L
Mg2+ (25mM)14 μ L
Mn2+ (5mM)1. 5μ LpPIC9K-proRCL0· 5 μ L(携带有华根霉脂肪酶基因proRCL的质粒)Taq DNA 聚合酶(2. 5U)1 μ L10 X PCR 缓冲液(不含 MgCl2)5 μ LddH2020 μ L其中，引物F和R序列为上游引物F:5' -TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3'下游引物R 5 ‘ -AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3 ‘。PCR 扩增条件94 "C 3min ；94 "C Imin, 59 "C Imin, 72 "C 2min，30 个循环； 720C IOmin。易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶Avr II和NotI分别对 易错PCR扩增产物和质粒pPIC9K进行消化，连接，转化至E. coli JM109感受态细胞。涂布 于LB (含100 μ g/ μ L的Amp)平板。生长12h后，将转化子转移至LB液体培养基中培养，
获得突变质粒。将突变质粒经限制性内切酶SalI线性化后，电转化毕赤酵母GSl 15感受态细胞。 将转化液涂布于MD平板上，30°C培养2天，构成突变文库。
5
利用上述同样的方法，以突变体基因组为模版进行多轮易错PCR，构建突变文库。实施例2、高酶活脂肪酶突变体的筛选用灭菌牙签将MD平板上生长出的His+转化子复制到YPD和BMMY平板的相同位 置，同时将对照菌GS 115/pPIC9K-proRCL接种至BMMY平板上。30°C培养2天。平板初筛保存生长完毕的YPD平板。每12h向BMMY平皿盖上补加200 μ L甲醇 诱导重组脂肪酶表达。诱导2-3天。向酶活测定底物ρΝΡΡ中加入0.6%琼脂，混合均勻后， 倒于BMMY平板形成顶层琼脂。2min内出现明显黄色的菌株为初筛目的突变菌株。相同条 件下，对照菌GS115/pPIC9K-proRCL不能显示出明显黄色。96孔板复筛向1.8mL/孔(平底)的96孔板中加入300 μ L BMGY培养基，121°C灭 菌20min。向其中接入保藏于YPD平板上的初筛目的菌株(同时接入GS115/pPIC9K-proRCL 作为对照)，30°C 250r/min振荡培养至0D600为2-6 (约16_18h)。离心，弃上清，用900 μ L BMMY培养基重悬菌体，并加入(V/V)甲醇诱导脂肪酶表达。此后每24h补加IOOyL BMMY培养基和1 % (V/V)甲醇，诱导4天。将诱导表达96h的96孔板发酵液3000r/min离 心lOmin，收集上清。取1 μ L上清液稀释500倍后，取5 μ L于另一 96孔板中，用排枪加入 底物，振荡混勻。2min内迅速显示明显黄色的菌株为复筛目的菌株。相同条件下，对照菌 GS115/pPIC9K-proRCL的发酵上清液不能显示明显黄色。 以易错PCR构建的突变文库为基础进行筛选，获得6株酶活明显提高的菌株，测定 脂肪酶核苷酸序列，利用三联体密码子推测脂肪酶的氨基酸序列，脂肪酶突变体的氨基酸 取代及K。at值提高倍数如表1所示。根据实施例3的方法测定脂肪酶突变体的K。at值。表1突变体的测序结果 实施例3脂肪酶突变体的K。at值测定为测定脂肪酶的K。at值，需要对酶进行分离纯化。摇瓶发酵将出发菌株以及各脂肪酶突变体，接种至25mL BMGY培养基中，30°C振 荡培养16 20h至OD6tltl为2 6，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至OD6tltl为1，每隔24h添加0. 5%的甲醇诱导表达，培养3-4天后，收集发酵上清液。分离纯化将突变菌株的发酵上清液经过IOKD超滤膜浓缩，SP-SepharoseFF强阳 离子交换层析和Phenyl-Si5Pharose 6FF疏水色谱柱层析后得到纯化的突变脂肪酶活性组 分。具体操作参考文献 Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B :Enzym，2009，57 :304_311。测定方法脂肪酶活力的测定方法为pNPP法(Pencreach G et al. Enzyme and MicrobialTechnol. 1996，18 :417_422.)。酶活的定义为一定反应条件下每分钟产生 1 μ mol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。在底物对硝基苯酚棕榈酸酯浓 度为O 25mmol/L范围内，测定酶活力，计算获得脂肪酶的动力学参数K。at。实施例4定点突变组合脂肪酶突变体的基因突变位点经过多轮易错PCR进行突变文库构建，得到包含有氨基酸突变位点Alal29Ser、 Lysl61Arg、Thrl95Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn 的 7 个突变株。为 了考察其中某一个突变及各突变的组合对脂肪酶突变株活力的影响，对发现的突变位点进 行定点突变组合，获得多个脂肪酶突变体。(定点突变可以利用市售的试剂盒进行。)将含有上述突变位点组合的基因与载体pPIC9K连接，电转化毕赤酵母GS115，以 获得脂肪酶的高效分泌表达。以与实施例3等同的方法测定脂肪酶突变体的K。at值。各突 变体酶的组合位点及其K。at提高的倍数如表2所示。表2突变体的测序结果及其K。at提高的倍数
0085]序列表
0086]<210>SEQ ID NO 1
0087]<211>389
0088]<212>PRT
0089]<213> 华根霉(Rhizopus
0090]<400>1
0091]Met Val Ser Phe Ile
0092]5
0093]Leu Val Ser Ser Met
0094]20
0095]Gly His Lys Gly Ser
0096]35
0097]Leu Pro Pro Leu lie
0098]50
0099]Glu Thr Thr Gly Asp
0100]65
0101]Ser Val Gln Trp Tyr
0102]80
0103]lie Lys Arg Asp Thr
0104]95
0105]Pro Glu Asn Pro Pro
0106]110
0107]Ser Asp Ser Gly Glu
0108]125
0109]Glu Leu Thr Asn Tyr
0110]140
0111]Ser Val Val Pro Gly
0112]155
chinensis)CCTCC M 201021 脂肪酶氨基酸
Ser lie Ser Gln Gly 10
Met Leu Gly Ser Ser 25
Val Lys Ala Thr Asn 40
Ser Ser Arg Cys Thr 55
Pro Asp Ala Glu Ala 70
Gln Ala His Gly Gly 85
Glu Thr Val Gly Gly 100
Pro lie Pro Ala Thr 115
Val Val Thr Ala Thr 130
Ala Gly Val Ala Ala 145
Thr Lys Trp Asp Cys 160
Val Ser Leu Cys Leu 15
Ala Val Pro Val Ala 30
Gly Thr Asp Phe Gln 45
Pro Pro Ser His Pro 60
Tyr Tyr lie Asn Lys 75
Asn Tyr Thr Ala Leu 90
Met Thr Leu Asp Leu 105
Ser Thr Ala Pro Ser 120
Ala Ala Gln lie Lys 135
Thr Ala Tyr Cys Arg 150
Lys Gln Cys Leu Lys 1650113]
0114]
0115]
0116]
0117]
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
0138]
0139]
0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
0145]
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151]
Tyr Thr Ile Thr Ala Lys Asp Ala Ser Gly Phe Pro Lys Thr Asp
Val Asp Tyr Asp Lys Asp Tyr Leu Pro Asn His Gln Glu Lys His
Pro Thr Val MET Val Tyr Lys Leu Lys Asn Arg Ala Asp Gln Leu
Asp Asn Thr Val His Phe Val Ala Asn Ala Thr Phe Pro Cys Thr
Gly 170 Gly 185 Phe 200 Phe 215 Ala 230 Pro 245 lie 260 Gly 275 Leu 290 Phe 305 Val 320 Gly 335 Ala 350 Ser 365 Tyr 380
Lys Phe Arg Thr Gly Val Val Met Ser Ala His Tyr Asp Asn Phe
Leu lie Gly Phe Phe Val Thr Asp lie Tyr Lys Leu Val Ser Gly
lie Lys Leu Arg Thr Asn Thr Asp Leu Ser Gln Asp Gly His Leu Tyr Tyr Thr Tyr Val Arg Asp His Pro Gln lie lie Val lie Asn
Thr 175 Ser 190 Ser 205 Tyr 220 Ser 235 Gln 250 Ser 265 Gln 280 Val 295 Asp 310 lie 325 Gly 340 Cys 355 Pro 370 Glu 385
Phe Asp Phe Ser Tyr Leu Leu Arg Gly Ser Val Val Thr Phe Gly
Thr Ala Arg Pro Asn Thr Gly Glu Cys Thr Pro Glu Ser Thr Ser
Ser Gln Ser Val Gln Ala Gly Lys Pro Gly His Ser Asn Ser Cys
Leu Lys Ala Lys Val Tyr Ala Arg Arg lie Val Trp lie lie Leu
Leu 180 Thr 195 lie 210 Gly 225 Val 240 Pro 255 Gln 270 Leu 285 Val 300 Pro 315 Pro 330 lie 345 Glu 360 Ala 375
389
<210>SEQ ID NO 2
<211>389
<212>PRT
<213> 华根霉(Rhizopus <400>2
Met Val Ser Phe lie
5
Leu Val Ser Ser Met 20
chinensis)CCTCC M 201021脂肪酶氨基酸突变体
Ser lie Ser Gln GlyVal Ser Leu Cys Leu
1015
Met Leu Gly Ser SerAla Val Pro Val Ala
25300152]
0153]
0154]
0155]
0156]
0157]
0158] 0159]
0160] 0161] 0162]
0163]
0164]
0165]
0166]
0167]
0168]
0169]
0170]
0171]
0172]
0173]
0174]
0175]
0176]
0177]
0178]
0179]
0180] 0181] 0182]
0183]
0184]
0185]
0186]
0187]
0188]
0189]
0190]
Gly Leu Glu Ser Ile Pro Ser Glu Ser Tyr Thr Ile Thr Ala Lys Asp Ala Ser Gly Phe
His Pro Thr Val Lys Glu Asp Leu Val Val Asp Tyr Asp Lys Asp Tyr Leu Pro Asn His
Lys Pro Thr Gln Arg Asn Ser Thr Val Pro Thr Val MET Val Tyr Lys Leu Lys Asn Arg
Gly Leu Gly Trp Asp Pro Gly Asn Pro Asp Asn Thr Val His Phe Val Ala Asn Ala Thr
Ser 35 lie 50 Asp 65 Tyr 80 Thr 95 Pro 110 Glu 125 Tyr 140 Gly 155 Gly 170 Gly 185 Phe 200 Phe 215 Thr 230 Pro 245 lie 260 Gly 275 Leu 290 Phe 305 Val
Val Ser Pro Gln Glu Pro Val Ala Thr Lys Phe Arg Thr Gly Val Gly Met Ser Ala His
Lys Ser Asp Ala Thr lie Val Gly Lys Leu lie Gly Phe Phe Val Thr Asp lie Tyr Arg
Ala Arg Ala His Val Pro Thr Val Trp lie Leu Thr Thr Leu Gln Gly Leu Tyr Tyr Arg
Thr Cys Glu Gly Gly Ala Ser Ala Asp Lys Arg Asn Asp Ser Asp His Tyr Thr Val Asp
Asn 40 Thr 55 Ala 70 Gly 85 Gly 100 Thr 115 Thr 130 Ala 145 Cys 160 Thr 175 Ser 190 Ser 205 Tyr 220 Ser 235 Gln 250 Ser 265 Gln 280 Val 295 Asp 310 lie
Gly Pro Tyr Asn Met Ser Ala Thr Arg Phe Asp Phe Ser Tyr Leu Leu Arg Gly Ser Val
Thr Pro Tyr Tyr Thr Thr Ala Ala Gln Thr Ala Arg Pro Asn Thr Gly Glu Cys Thr Pro
Asp Ser lie Thr Leu Ala Gln Tyr Cys Ser Gln Ser Val Gln Ala Gly Lys Pro Gly His
Phe His Asn Ala Asp Pro lie Cys Leu Leu Lys Ala Lys Val Tyr Ala Arg Arg lie Val
Gln 45 Pro 60 Lys 75 Leu 90 Leu 105 Ser 120 Lys 135 Arg 150 Lys 165 Leu 180 Tyr 195 lie 210 Gly 225 Val 240 Pro 255 Gln 270 Leu 285 Val 300 Pro 315 Pro
320325330
ProGlnAlaPhe GlyTyrLeuHisProGlyValGluSerTrplie
335340345
LysGluAspProAlaAspValGlnlieCysThrSerAsnlieGlu
350355360
ThrLysGlnCysSerAsnSerlieValProPheThrAsnlieAla
365370375
AspHisLeuThr TyrPheGlylieAsnGluGlySerCysLeu
380385389
<210>SEQ IDNO 3
<400>3
F 5'-TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3'；
R 5'-AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3/ O
1权利要求
通过定向进化构建的活力提高的脂肪酶突变体，其特征是由华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021脂肪酶基因(Genbank登录号EF405962)，运用易错PCR方法，通过多轮重组和定点突变，经定向进化而获得的脂肪酶突变体，在突变体的氨基酸序列中，包含氨基酸突变Ala129Ser、Lys161Arg、Thr195Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸两个、三个或四个突变的组合；以转换数Kcat表示，脂肪酶突变体的酶活较出发菌株得到了提高；突变体的测序结果及其Kcat提高的倍数为脂肪酶突变体 氨基酸取代位置 Kcat(/min) Kcat提高的倍数出发菌株脂肪酶11381.0突变体1 1Ala129Ser12521.1突变体1 2Lys161Arg14791.3突变体1 3Thr195Tyr14791.3突变体1 4Ala230Thr18211.6突变体1 5Val261Gly19351.7突变体1 6Lys322Arg13661.2突变体1 7Ser373Asn17071.5突变体2 1Ala129Ser/Lys161Arg 22782突变体2 2Ala129Ser/Ala230Thr 13651.2突变体2 3Ala129Ser/Val261Gly 15931.4突变体2 4Lys161Arg/Thr195Tyr 28452.5突变体2 5Lys161Arg/Lys322Arg 17071.5突变体2 6Lys161Arg/Ser373Asn 20481.8突变体2 7Ala230Thr/Ser373Asn 17071.5突变体2 8Val261Gly/Ser373Asn 37263.3突变体3 1Ala129Ser/Ala230Thr/Val261Gly31862.8突变体3 2Ala129Ser/Ala230Thr/Lys322Arg22782突变体3 3Lys161Arg/Thr195Tyr/Ser373Asn26172.3突变体3 4Lys161Arg/Ala230Thr/Ser373Asn22782突变体3 5Lys161Arg/Val261Gly/Lys322Arg27312.4突变体3 6Ala230Thr/Lys322Arg/Ser373Asn28452.5突变体4 1Ala129Ser/Lys161Arg/Ala230Thr/ 20731.8 Lys322Arg 。
全文摘要
通过定向进化构建的活力提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了一种由华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021脂肪酶基因经定向进化而获得的一系列脂肪酶突变体。在各突变体的氨基酸序列中，涉及到的氨基酸突变为Ala129Ser、Lys161Arg、Thr195Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸两个、三个或四个突变的组合。以转换数Kcat表示，这些突变体的酶活较出发菌株得到了提高。
文档编号C12N9/20GK101899427SQ20091023518
公开日2010年12月1日 申请日期2009年11月11日 优先权日2009年11月11日
发明者喻晓蔚, 徐岩, 王睿 申请人:江南大学