专利名称：一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法。
背景技术：
水稻矮缩病毒(rice dwarf virus, RDV)是水稻普通矮缩病的病原，1883年首次 在日本被发现，广泛分布于中国、日本、朝鲜、菲律宾、尼泊尔等东南亚水稻产区。此病在水 稻秧田和本田期均能发生，为系统性侵染病害。植株感病后，所有分蘖均能发病。症状为植 株显著矮缩，分蘖增多，叶色浓绿，叶片粗而僵直，沿叶脉出现白色小斑点，形成断续的点线 状(老叶不出现斑点)；如在孕穗后期发病，只在剑叶及其叶鞘上表现清晰的条点病斑；若 在抽穗后发病，仅在剑叶叶鞘上表现病斑。病株根系发育不良，多老朽根，早期发病(苗期 到分蘖期)一般不能抽穗，后期发病呈包茎穗或半包穗，穗小秕谷多。因此，水稻感染该病 后能够造成大面积减产，严重威胁水稻的生产。RDV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员 (Boccardo G，1984)。呼肠孤病毒科病毒有一些共同特点，例如病毒粒子呈球状，有双层衣 壳，每个衣壳均呈现20面体对称，直径为60-80nm，没有脂蛋白外膜，外壳由3种蛋白质组 成，核心有4-6种蛋白，核心内含有线状dsRNA，有10-12个基因组分。RDV病毒粒子为无 刺突、无脂蛋白外膜的二十面体，病毒粒子直径为69. 3nm，具有双层外壳蛋白，内壳直径为 53nm。RDV病毒粒子内有单拷贝基因组12条双链RNA，RNA基因组分以超卷曲形式包装在 病毒粒子内，与蛋白质组成复合体。依照dsRNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率，由慢到 快，依次命名为Sl到S12。RDV基因组编码6-7种结构蛋白(包括Pl，P2，P3，P5，P7，P8和 P9)，和至少五种非结构蛋白(包括Pns4, Pns6, PnslO, Pnsl 1，Pnsl2)。Pnsll的编码序列有两个0RF，这两个ORF的读码框相同，但第二个ORF的AUG密 码子满足Kozak保守转录的要求，在感病的植株和昆虫体内表达量较高。其编码一个181 个氨基酸组成的20KD蛋白。Sll的3，非编码区很长，占整个片段的46.4%，远远高于RDV 其他片段3'非编码区的相对长度(约占3.1%-17.7%)。
发明内容
本发明的目的是提供一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法。本发明提供了一种具有细胞核和/或叶绿体定位功能的多肽，其氨基酸序列如序 列表的序列1所示。编码所述多肽的DNA片段也属于本发明的保护范围。所述DNA片段的核苷酸序列可如序列表的序列2所示。含有所述DNA片段的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。所述重组表达载体可为将编码所述多肽的DNA片段插入载体PRTL2的多克隆位点 得到的重组质粒。
本发明还保护一种在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方 法，是用所述多肽作为信号肽引导外源蛋白在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表 达。所述 方法可通过将含有所述DNA片段和所述外源蛋白的编码基因的融合DNA导入 植物细胞实现；所述融合DNA中，编码所述多肽的DNA片段位于所述外源蛋白的编码基因 的上游。具体来说，所述融合DNA通过如下重组表达载体导入所述植物细胞骨架质粒为 PRTL2，在35S启动子后依次插入编码所述多肽的DNA片段和外源蛋白的编码基因。所述植物细胞为可烟草细胞，如烟草BY2细胞。所述外源蛋白可为GFP蛋白。所述GFP基因具体可为GENBANK ACCESS 10NNUMBER U55761中自5，末端第97至816位核苷酸序列所示的DNA。所述融合DNA具体可为序列表 的序列6所示的DNA。本发明通过实验证实了水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pnsll的C端132-180多肽 (第二个0RF)具有将外源蛋白特异定位到细胞核和叶绿体中的功能。不仅为在细胞核中特 异表达抗逆，抗病害相关基因，提高植物生存能力提供了良好技术路线，同时也为在叶绿体 中表达激活光合作用反应的相关基因，提高农作物生物产量提供了新的技术支持。本发明 在实际生产中有重要的应用价值。
图1为pRTL2-Sll: :eGFP在烟草表皮细胞中的瞬时表达；A :pRTL2_Sll: :eGFP荧 光；B :pRTL2-Sll: :eGFP 可见光；C :pRTL2_Sll eGFP 荧光和可见光叠加；D :pRTL2_eGFP 荧 光；E，F :pRTL2-Sll::eGFP在烟草表皮细胞核中定位的放大图。图2为pCambial301_Sll: :eGFP转基因烟草中，Pnsll: eGFP在叶肉细胞和保卫 细胞中的细胞定位情况。图3为免疫电镜显示Pnsll在RDV宿主细胞中的定位；A :RDV感病水稻细胞的细 胞核(标尺表示250nm) ；B =RDV感病水稻细胞的叶绿体；C 健康水稻的细胞，Nu-细胞核， Ch-叶绿体；D 细胞中金胶体颗粒密度统计；红色箭头示胶体金颗粒所在位置。图4为Pnsll序列及核定位信号分析模式图。图5为Sll (132-181) eGFP在烟草BY2细胞核中的瞬时表达。图6为Sll (132-181) eGFP在烟草BY2叶绿体中的瞬时表达。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。pRTL2、大肠杆菌 DH5a 和 EHA105 北京大学；参见文献Cao，X. S.，Zhou，P.， Zhang, Χ. Μ. , Zhu, S. F. , Zhong, Χ. H. , Xiao, Q. , Ding, B. , and Li, Y. (2005). Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-strandedRNA virus. J Virol 79，13018-13027。烟草BY2细胞北京大学；参见文献:Howard EA, Zupan JR, Citovsky V, ZambryskiPC(1992)The Vird2 protein of A. tumefaciens contains a C-terminalbipartite nuclearlocalization signal-implications for nuclear uptake ofDNA in plant-cells. Cell 68:109—118。PCR引物(由上海生工生物工程技术 服务有限公司合成)见表1。表1实施例中用到的PCR弓丨物
权利要求
1.一种多肽，其氨基酸序列如序列表的序列1所示。
2.编码权利要求1所述多肽的DNA片段。
3.如权利要求2所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段的核苷酸序列如序列表 的序列2所示。
4.含有权利要求2或3所述DNA片段的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将权利要求2 或3所述DNA片段插入载体pRTL2的多克隆位点得到的。
6.一种在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法，是用权利要求 1所述多肽作为信号肽引导外源蛋白在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表达。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法是通过将含有权利要求2或3所 述DNA片段和所述外源蛋白的编码基因的融合DNA导入植物细胞实现的；所述融合DNA中， 权利要求2或3所述DNA片段位于所述外源蛋白的编码基因的上游。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述融合DNA通过如下重组表达载体导入 所述植物细胞骨架质粒为PRTL2，在35S启动子后的多克隆位点依次插入权利要求2或3 所述DNA片段和外源蛋白的编码基因，得到的重组质粒。
9.如权利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于所述植物细胞为烟草细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述植物细胞为烟草BY2细胞；所述外源 蛋白为GFP蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法。本发明提供了一种具有细胞核和/或叶绿体定位功能的多肽，其氨基酸序列如序列表的序列1所示。本发明还提供了编码权利要求1所述多肽的DNA片段以及含有所述DNA片段的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。本发明提供的在植物细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法，是所述多肽作为信号肽引导外源蛋白在植物细胞核和/或叶绿体中定位表达。本发明不仅为在细胞核中特异表达抗逆，抗病害相关基因，提高植物生存能力提供了良好技术路线，同时也为在叶绿体中表达激活光合作用反应的相关基因，提高农作物生物产量提供了新的技术支持。本发明在实际生产中有重要的应用价值。
文档编号C12N1/00GK102040655SQ20091023540
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月13日 优先权日2009年10月13日
发明者李毅, 高锋, 魏春红 申请人:北京大学