专利名称：一种制备鬼臼毒素和/或黄芪苷的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备鬼臼毒素和/或黄芪苷的方法及其专用菌株。
背景技术：
鬼臼毒素(podophyllotoxin)主要存在于小檗科鬼臼属及其近缘植物中，是一类 具有广泛生物学活性的天然化合物，有拟雌激素样、抗雌激素样、抗癌、抗病毒、抗真菌、镇 静、抑制植物生长和抗氧化等作用。特别是其具有较强的抗癌活性，其作用机制是抑制微管 蛋白的解聚作用以阻止细胞分裂以及抑制DNA拓扑异构酶的活性。鬼臼毒素的糖苷衍生物 etoposide和teniposide的毒性较低，对小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均具有很好 的疗效而成为临床应用的广谱抗肿瘤药物。 目前，鬼臼毒素主要是从野生鬼臼类植物的根茎中提取得到，而这类植物在全世 界仅有4属15种，我国有3属12种，主要生长在秦岭、西藏等高海拔地区，其生长缓慢，且 鬼臼毒素类物质的含量较低。由于鬼臼毒素类物质在医学和农林防治等方面具有广阔的应 用前景，因而其需求量日益增加；对野生鬼臼类植物资源的大量采集，已使其资源遭到严重 破坏，造成生物多样性和生态环境的不可逆的损失，因此解决鬼臼毒素类物质的来源问题 具有重要意义。 由于植物生长环境复杂，难以模拟，且其生长周期长，很难进行大规模的人工栽 培，而组织培养技术对于鬼臼类植物也不适用；加之，鬼臼毒素类物质化学结构复杂，化学 合成虽可进行，但成本太高，而通过基因工程学手段构建工程菌也由于参与形成该类物质 的酶数量过多而无法进行。所以利用内生菌具有产生和宿主相同或相似的生物活性物质的 性质，来解决鬼臼毒素的来源问题，可能是唯一也是最有效的方法。 此外，由于鬼臼类植物中还含有多种黄酮类化合物，因而其内生菌也可能产生黄 酮类化合物。许多研究证实，黄酮类化合物在人体中具有多种生物活性，包括抗氧化、抗癌、 防癌、清除自由基、抗病毒、消炎和促进血管舒张等。此外，异黄酮(如染料木黄酮和羟基异 黄酮)还具有雌激素特性。黄酮类化合物的多种生理作用，使其在医药、食品等行业具有广 泛的应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株可产鬼臼毒素和/或黄芪苷的菌株及其培养方法。
本发明所提供的菌株为斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE。该菌株已于2009 年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3401， 分类命名为Penicillium ateckii，菌株名称为WEQE。本发明所提供的培养斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401的方 法，是用马铃薯葡萄糖培养基培养斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCCNo. 3401 。
所述培养方法中，所述培养的条件可包括温度为26-3(TC、振荡速度为100-150rpm。所述温度具体可为28°C ;所述振荡速度具体可为120rpm。 本发明的另一个目的是提供一种制备鬼臼毒素和/或黄芪苷的方法。 本发明所提供的制备鬼臼毒素和/或黄芪苷的方法，包括如下步骤发酵培养斯
氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401，得到鬼臼毒素和/或黄芪苷。 所述发酵培养中用到的培养基可以是马铃薯葡萄糖培养基。 所述发酵培养的条件包括温度为26-3(TC、振荡速度为100-150rpm。所述发酵培 养的时间可为5-9天。所述温度具体可为28°C ;所述振荡速度具体可为120rpm ;所述时间 具体可为7天。 所述制备方法中在所述发酵后，还包括萃取的步骤。
所述萃取剂为氯仿。 斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401在制备鬼臼毒素和/或黄 芪苷中的应用也属于本发明的保护范围。 本发明的菌株可以用于制备鬼臼毒素和/或黄芪苷。本发明的制备鬼臼毒素和/ 或黄芪苷的方法具有操作简单、成本低廉、易操作、生产周期短的优点。本发明方法为制备 鬼臼毒素提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操 作性，适合于工业化大规模生产，同时又对保护植物生态多样性具有重要意义。
图1为斯氏青霉的菌落形态. 图2为斯氏青霉分生孢子头和孢子形态。A和B分别为(10X40)和(10X100)时 分生孢子头形态，C (10X40)为孢子形态
图3为鬼臼毒素标准品的HPLC谱图
图4为黄芪苷标准品的HPLC谱图 图5为斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401发酵液的氯仿提取 物的HPLC谱图
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 遗传资源名称窝儿七(Diphylleia sinensis L.)(在中国植物志中，是南方山
荷叶；窝儿七是秦岭植物志中的名称。)。遗传资源的获取途径I、遗传资源取自植物，
11、获取方式自行采集。直接来源获取时间2007年08月；采集方式，采集地(国家、省
(市))中国陕西省眉县红河谷(海拔1560m)，采集者名称(姓名)赵长琦，采集者联系方 式010-58805046。原始来源同直接来源。 鬼臼毒素(podophyllotoxin)的结构式如式I所示，黄芪苷(Astragalin)的结构 式如式II所示
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式I 式II 实施例1、斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401的分离及鉴定
—、分离 将采集自陕西省眉县红河谷(海拔1560m)的植物窝儿七(Diphyllria sinensisL.)的根及根状茎分别用自来水洗净，在超净工作台中用75%体积百分含量 的乙醇处理5min，然后无菌水冲洗3-5次；而后再用2. 5 %质量百分含量的次氯酸钠处 理10min，再无菌水冲洗3-5次。用灭菌的镊子和刀片将窝儿七的根的外皮剥去，再切成 0. 5cmX0. 5cm大小的小片种植于PDA固体培养基上，28。C培养3_7天。同时将同样灭菌处 理过的窝儿七的根不做剥皮及切割，将窝儿七的根在PDA培养基上滚动一周后，同条件培 养作为对照观察。 培养几天后发现在窝儿七的根的切口处有菌丝长出，取切口处新长出的菌丝，转 接到新鲜的PDA培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时 间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA培养基上进行分离培养，直至筛选 出单一的菌落，将单一菌株进行培养，提取产物，对提取的产物进行高效液相色谱检测，得 到产鬼臼毒素和黄芪的菌株，将此菌株命名为WEQE。
二、鉴定 将上述菌株进行如下生理生化、菌形态的鉴定 (1)菌落特征 菌落形态如图l所示。 将单菌株WEQE接种至PDA培养基上，当细胞生长至对数生长后期，菌落大小稳定 后，观察菌落形态。结果表明，上述分离得到的菌株WEQE在PDA培养基上菌落薄，生长局限， 产孢面暗蓝绿色或灰绿色，绒状，上泌出多数无色以至鲜黄色的水滴，背面带暗黄色。
(2)菌丝形态特征
菌丝形态如图2所示。 分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，有横隔膜，顶端生排列成帚状的间枝，下 部不分枝；间枝长短不一，散开，上生多数平行排列的小梗，小梗8-10X2微米；分生孢子链 常作散开的圆柱状；分生孢子球形至椭圆形，直径2-2. 5微米。 综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》等资料，上述分离得到的菌株 具有斯氏青霉的基本特征，将其鉴定为斯氏青霉(Penicillium ateckii)，其分类属于半知 菌纲、丛梗孢目、丛梗孢科、青霉属。
该菌株斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE已于2009年11月5日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中 国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3401。 实施例2、利用斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC漁3401制备鬼臼毒
素和黄芪苷 —、培养菌株 将100ml制备好的马铃薯葡萄糖液体培养基装于250ml三角瓶中，灭菌，挑取斯氏 青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401的单菌落接种于上述灭菌好的马铃薯葡 萄糖液体培养基中，28t:， 120r/min摇床培养7天，得到发酵液。 马铃薯葡萄糖液体培养基是按照如下方法配制的称取马铃薯200g(去皮、切成 约2cm2的小块)，放入水中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取其滤液加20g葡萄糖，再补 足水至lOOOmL，自然pH。
实验设3次重复。
二、产物的提取 用抽滤器将发酵液抽滤两次，分别收集菌丝体与发酵液上清。将发酵液上清分别 用等体积的氯仿萃取，随时取萃取液于紫外检测仪下检测，直至萃取液在紫外检测器下无 荧光，合并萃取液，减压蒸馏回收。得到发酵液上清的氯仿提取物，提取物样品进行如下步 骤三的检测。 实验设3次重复，结果取平均数。
三、产物的高效液相色谱(HPLC)检测 标准品鬼臼毒素购自中国药品生物制品检定所，产品目录号为111645 ; 标准品黄芪苷按照如下文献中方法从植物中华山荷叶中分离得到刘畅，药用植
物中华山荷叶化学成分的分析研究[硕士毕业论文]，NMR数据参考文献冯育林，李云秋，
徐丽珍，杨世林，蜀葵花的化学成分研究(II)——黄酮类成分研究中草药，2006，37(11):
1622-1624[注黄芪苷和紫云英苷是同一种物质]。标准品黄芪苷也可购自中国药品生物
制品检定所。 检测前，取鬼臼毒素标准品、黄芪苷标准品、发酵液上清的氯仿提取物样品，分别 用甲醇充分溶解，0. 45 ii m微孔滤膜过滤；采用外标法对样品进行HPLC分析。每个样品至 少重复三次。
具体的检测方法如下 仪器Aglient 1100型高效液相色谱仪；色i普柱Aglient 1100 Eclipse XDB_C18(5 ii m， 4. 6X 150mm); 检测器紫外检测器；检测波长254nm ; 色谱条件 流动相甲醇水=60 : 40(体积比) 流速0. 5ml/min 进样量5ul 柱温室温 标准品鬼臼毒素、黄芪苷。
实验设三次重复，结果如图3-5所示。其中，图3为鬼臼毒素标准品的HPLC谱 图，图4为黄芪苷标准品的HPLC谱图，图5为斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401发酵液上清的氯仿提取物样品的HPLC谱图。鬼臼毒素的保留时间为8. 336 分钟。黄芪苷的保留时间为4.965分钟。 将斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401发酵液上清的氯仿提取 物样品的HPLC谱图分别与鬼臼毒素标准品和黄芪苷标准品的HPLC谱图进行比对。
结果表明，在保留时间为8. 306分钟时，发酵液上清的氯仿提取物样品的HPLC谱 图中具有吸收峰，而鬼臼毒素标准品在8. 336分钟时具有吸收峰，说明发酵液上清的氯仿 提取物样品中含有鬼臼毒素；发酵液上清的氯仿提取物样品的HPLC谱图中，在保留时间为 4. 960分钟时具有吸收峰，而黄芪苷标准品在4. 965分钟时具有吸收峰，说明发酵液上清的 氯仿提取物中含有黄芪苷。以上结果表明，发酵液上清的氯仿提取物中含有鬼臼毒素和黄 芪苷。 四、产物的薄层层析(TLC)检测 标准品同上述"产物的高效液相色谱(HPLC)检测"中采用的标准品。 首先，取鬼臼毒素标准品、黄芪苷标准品、斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE
CGMCC N2 3401发酵液上清的氯仿提取物样品，分别用甲醇充分溶解，然后分别在正相和反
相薄层板上共层析，并在紫外灯下进行检测，并进一步用硫酸-乙醇(15 : 85，v/v)显色，
观察样品和标准品的斑点荧光颜色和显色后的颜色，并分别计算Rf值。 具体的检测条件如下 正相薄层层析 氯仿层提取物展开剂氯仿甲醇=80 : 20(v/v)
反相薄层层析 氯仿层提取物展开剂甲醇水=60 : 40(v/v)
紫外检测波长254nm。 结果表明，在正相层析板上，鬼臼毒素标准品的Rf值为0. 85，而在发酵液上清的 氯仿提取物样品中同样存在一个Rf值为0. 85的斑点，其斑点与鬼臼毒素标准品在紫外灯 (254nm)下具有相同的荧光颜色，并且用硫酸_乙醇(15 : 85，v/v)显色后，也具有相同的 颜色，说明发酵液上清的氯仿提取物样品中含有鬼臼毒素；黄芪苷标准品的Rf值为0. 30， 而在发酵液上清的氯仿提取物样品中同样存在一个Rf值为0. 30的斑点，其斑点与鬼臼毒 素标准品在紫外灯(254nm)下具有相同的荧光颜色，并且用硫酸_乙醇(15 : 85， v/v)显 色后，也具有相同的颜色，说明发酵液上清的氯仿提取物样品中含有黄芪苷。
在反相层析板上，鬼臼毒素标准品的Rf值为0. 32，而在发酵液上清的氯仿提取物 样品中同样存在一个Rf值为0. 32的斑点，其斑点与鬼臼毒素标准品在紫外灯(254nm)下 具有相同的荧光颜色，并且用硫酸-乙醇(15 : 85，v/v)显色后，也具有相同的颜色，说明 发酵液上清的氯仿提取物样品中含有鬼臼毒素；黄芪苷标准品的Rf值为O. 58，而在发酵液 上清的氯仿提取物样品中同样存在一个Rf值为0. 58的斑点，其斑点与鬼臼毒素标准品在 紫外灯(254nm)下具有相同的荧光颜色，并且用硫酸_乙醇(15 : 85，v/v)显色后，也具有 相同的颜色，说明发酵液上清的氯仿提取物样品中含有黄芪苷。
权利要求
斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE，其保藏号为CGMCC No.3401。
2. 培养斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401的方法，是用马铃薯葡 萄糖培养基培养斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述培养的条件为26-30°C、100-150rpm振荡。
4. 一种制备鬼臼毒素和/或黄芪苷的方法，包括如下步骤发酵培养斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401，得到鬼臼毒素和/或黄芪苷。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述发酵培养中用到的培养基是马铃薯 葡萄糖培养基。
6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述发酵培养的条件为26-30°C、 100-150rpm振荡培养5_9天。
7. 根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述制备方法中在所述发酵后， 还包括萃取的步骤。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述萃取剂为氯仿。
9. 斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401在制备鬼臼毒素和/或黄芪 苷中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种制备鬼臼毒素和/或黄芪苷的方法及其专用菌株。该菌株为斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE，其保藏号为CGMCC No.3401。本发明的菌株可以用于制备鬼臼毒素和/或黄芪苷。本发明的制备鬼臼毒素和/或黄芪苷的方法具有不受植物资源的影响、操作简单、成本低廉、易操作、生产周期短等优点。本发明方法为制备鬼臼毒素提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产，同时又对保护植物生态多样性具有重要意义。
文档编号C12P19/60GK101701193SQ200910237790
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者朱妍妍, 艾嫦, 赵长琦 申请人:北京师范大学