专利名称：：一种支持cho细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种支持哺乳动物细胞培养的无血清培养基，具体地说是支持CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，属于细胞工程
技术领域：
。
背景技术：
：CHO(Chinesehamsterovary)细胞与其它动物细胞相比，具有外源蛋白易在细胞中合成并分泌到培养基中；能正确组装多亚基蛋白；重组蛋白的折叠与修饰、理化性质、生物学性质几乎与天然蛋白相同；能大规模无血清高密度培养等优点。因此，CHO细胞在生物制药中得到了广泛的应用，在已经上市和处于不同临床试验研究阶段的基因工程药物中，超过70%为哺乳动物细胞表达产品，而CHO细胞表达产品占其中的绝大部分。CHO细胞系贴壁依赖性细胞，传统的细胞贴壁培养由于受细胞贴附面积的限制，极大的限制了细胞的产能。随着动物细胞悬浮培养技术的不断发展，单个细胞悬浮培养技术的优势日益显现。相对于动物细胞贴壁培养而言，单个细胞悬浮培养具有细胞生长均一性好、传质效率高、容易实现规模放大和过程控制的特点。哺乳动物细胞的悬浮培养已成为目前动物细胞培养的理想模式和动物细胞表达产品工业化生产的首要选择，超过80%的哺乳动物细胞表达生物技术药物采用动物细胞悬浮培养为其生产工艺。对于CHO细胞悬浮培养而言，要在规模化的培养中获取好的培养结果，设计出适宜细胞悬浮生长的培养基是至关重要的。细胞培养基是动物细胞体外培养的最重要因素之一。细胞培养基的发展已经历了天然培养基、合成培养基及无血清培养基三个阶段。无血清培养基因其组成成份相对清楚、不存在动物源性病原微生物污染、批次间重复性好、蛋白质含量低或不含蛋白质、便于细胞表达产品的分离纯化等优点，在哺乳动物细胞表达产品的规模化生产中得到普遍的应用。目前，国内虽已针对CHO细胞开发了多种无血清培养基，但其细胞培养方式多为贴壁培养，难于适应目前动物细胞培养的应用现状和发展趋势。同时，其所支持的细胞最大生长密度往往较低，不能满足CH0细胞大规模高密度培养的需求。Hyclone、Invitrogen等多家国外培养基供应商已开发出多种针对CHO细胞悬浮培养的商业化无血清培养基，其中包括CH0无血清培养基、CH0无蛋白培养基和化学成分明确的CH0无血清培养基，但商业化无血清培养基的组成配方一直是秘而不宣的核心商业机密，此外，昂贵的价格以及适用细胞系范围较窄的不足，也在很大程度上限制商品化CHO细胞无血清培养基的应用。因此，本领域迫切需要开发新的适合CH0细胞大规模悬浮培养的无血清培养基。
发明内容本发明的目的是提供一种新的支持CH0细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，该培养基可以支持CH0细胞在悬浮培养条件下，呈单个悬浮细胞快速生长并达到较高的培养密度。本发明的发明思路为在现有的基础培养基中，主要包括葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐等其它多种成分。在进行动物细胞培养时，常常需要在基础培养基中添加一定浓度的动物血清，才能使细胞较好的生长。在进行动物细胞无血清培养时，则必须在基础培养基中添加血清替代成分，如结合蛋白、激素、生长因子、低分子量营养物质如微量元素、脂类等，从而使细胞的培养效果相当于或好于有血清的培养基。本发明所提供的一种适合CHO细胞大规模悬浮培养的无血清培养基，就是依据如上的构想，选用匿EM/F12(v/v，1:l)作为基础培养基，并添加化学成分明确的血清替代成分和具有保护细胞受流体剪切力损伤及抑制细胞聚集成团的化合物组成。基于以上考虑，本发明的无血清培养基在DMEM/F12(v/v，1:1)基础培养基中选择了如下有效成分胰岛素促进细胞对葡萄糖和氨基酸的摄取，并促进细胞生长。腐胺具有促进蛋白和核酸合成的作用及调节细胞内pH的作用。转铁蛋白结合铁的糖蛋白、与细胞表面专一受体结合作用，传递铁离子、协助铁的吸收，可络合有害离子，起解毒作用，同时还有生长因子的作用。谷胱甘肽具有保护细胞膜免受自由基损伤的作用。乙醇胺是无血清培养基的重要组成部分，与磷脂(磷脂酰乙醇胺)的合成有关。卵磷脂卵磷脂作为细胞膜的重要组成部分。羟丙基_|3_环状糊精贮存及运送生物大分子，提高生物活性物质的稳定性和生物利用度。|3-巯基乙醇促进胱氨酸的吸收，还可使谷胱甘肽处于还原状态，从而保护细胞免受过氧化氢的损伤。抗坏血酸在细胞生长代谢过程中，具有促进细胞生长和保护细胞免受氧自由基损伤的作用。微量元素主要起调节、传递和控制的作用，如Fe:酶和血红素的辅基、是线粒体中呼吸链的组成部分。Cu:超氧化物歧化酶的辅基，是线粒体呼吸链的组成部分。Mn:超氧化物歧化酶、水解酶、激酶和转移酶的辅基，参与细胞代谢。Zn:酶的辅基，参与细胞代谢。Mo:黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、亚硫酸氧化酶的辅基，它参与细胞内的电子传递、机体内铁代谢和醛的氧化等。Se:谷胱甘肽还原酶的组成部分、具有抗氧化作用。V:调节细胞钠/钾ATP酶、磷酰转移酶、腺苷酸环化酶、蛋白激酶类的辅因子，与细胞的蛋白质和脂类代谢关系密切。本发明培养基中还可添加嵌段式聚醚F-68(PluronicF-68):PluronicF-68作为一种表面活性剂，可有效的降低细胞悬浮培养过程中流体剪切力对细胞的损伤，同时对细胞也具有一定生物学活性。谷氨酰胺为细胞提供必需的氮源，促进细胞内蛋白质合成、细胞生长和分化。4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES):pH缓冲剂，维持培养基pH的相对恒定。硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖作为高度磺化硫酸聚阴离子物质，可以通过改变细胞表4面的电荷，促使单个细胞的悬浮，进而达到抑制细胞聚集成团的目的。根据上述物质对细胞生长的不同作用，本发明在DMEM/F12(v/v，1:1)培养基的基础上，将上述物质按以下浓度加入到DMEM/F12(v/v，1:1)培养基中，组成了一种新的CHO细胞无血清培养基。其中添加物中含有腐胺转铁蛋白谷胱甘肽乙醇胺卵磷脂羟丙基-e-环状糊精P-巯基乙醇抗坏血酸20.550.511100105mg/L0.8mg/L7mg/Llmg/L3mg/L2mg/L-200mg/L20iiM510mg/L所述的添加物，还含有以下微量元素Na2Se03MnS04H20Na2Mo042H20NaV03CuS045H20ZnS047H20FeC6H507510nM0.5InM510nM510nM510nM13iiM35iiM。所述的添加物，还含有以下物质谷氨酰胺5mM硫酸葡聚糖25mg/LPluronicF-68lOOOmg/LHEPES15mM。本发明提供的无血清培养基与现有CHO细胞无血清培养基相比具有以下优点1.能够支持CHO细胞在悬浮培养条件下呈单个悬浮细胞快速生长。2.添加成份明确、组成相对简单、易于配制。3.细胞生长良好、细胞培养密度和细胞活力高于有血清培养基和同类商品化无血4.成本低廉。下面将结合附图和实例对本发明做进一步说明,图1A为倒置显微境下观察的在含5X(v/v)小牛血清DMEM/F12(v/v，1:1)培养基中生长的CHO细胞；图IB为倒置显微境下观察的在本发明无血清培养基中生长的CHO细胞；图2为CHO细胞在本发明无血清培养基中和含5%(v/v)小牛血清DMEM/F12(v/v，l:1)培养基中批次培养的活细胞密度变化。A、B分别表示CHO细胞在无血清培养基及含5%(v/v)小牛血清DMEM/F12(v/v，1:1)培养基中批次培养的活细胞密度；图3为CHO细胞在本发明无血清培养基中与Hyclone公司的无血清培养基(SFM-CHO)中批次培养的活细胞密度变化。A、B分别表示CHO细胞在本发明无血清培养基及Hyclone公司SFM-CHO培养基中批次培养的活细胞密度；图4为CHO细胞在5L搅拌罐式生物反应器中用本发明无血清培养基培养的活细胞密度。具体实施例方式实施例1:运用统计学方法Plackett-Burman及响应面法确定CHO细胞无血清培养基添加成分及其最适使用剂量将CHO细胞(CH0-K1，ATCCCat.No.CC1-61)按3-3.5X105cells/m接种于100ml三角瓶中，培养体积为35ml，培养时加入含有5mM谷氨酰胺、0.1%(v/v)PluronicF-68及25iig/ml硫酸葡聚糖的无血清培养基或含5X(v/v)血清的DMEM/F12(v/v，1:1)培养基，将三角瓶置于37。C温箱中摇床上培养，摇床转速90r/min。CH0细胞悬浮培养无血清培养基的设计以DMEM/F12(v/v，1:1)为基础培养基，应用Plackett-Burman方法考察胰岛素(X》、腐胺(X》、转铁蛋白(X》、微量元素(X4，表1)、抗坏血酸(X5)、卵磷脂(X6)、e-巯基乙醇(X7)、谷胱甘肽(X8)、乙醇胺(X9)、e-环状糊精(X1Q)等IO种添加成分对细胞生长的影响(表2、3)。进而应用响应面方法(RSM)中的Box-behnken对胰岛素(X》、腐胺(X》、转铁蛋白(X3)对的使用浓度进行优化(表4、5)。在此基础上加入谷氨酰胺、硫酸葡聚糖、HEPES及PluronicF_68，组成了适用于CHO细胞悬浮培养的无血清培养基的组成配方(表6)。表1.微量元素的组成成分<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2.Plackett-Burman设计因素水平<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4.响应面设计<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表5.响应面设计及响应值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表6.无血清培养基的组成及用量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2:培养基的配制和CHO细胞培养1.培养基配制:在以DMEM/F12(v/v，l:胰岛素2mg/L腐胺0.5mg/L转铁蛋白5mg/L谷胱甘肽0.5mg/L乙醇胺lmg/L卵磷脂lmg/L羟丙基-P-环状糊精lOOmg/LP-巯基乙醇10iiM1)为基础培养基中添加以下物质:0090]抗坏血酸5mg/L:0091]所述的添加物还含有以下微量元素:0092]Na2Se035nM:0093]MnS04H200.5nM:0094]Na2Mo042H205nM:0095]NaV035nM:0096]CuS045H205nM:0097]ZnS047H201iiM:0098]FeC6H5073iiM:0099]所述的添加物还含有以下物质:0100]硫酸葡聚糖25mg/L:0101]谷氨酰胺5mM:0102]PluronicF-681000mg/L:0103]HEPES15mM上述培养基成分溶解于去离子水中，用0.2ym微孔膜滤器过滤除菌。2.细胞培养将预先准备好的CHO细胞(CH0-K1)在无菌操作下，离心去上清，用过滤除菌配制好的上述无血清培养基重新悬浮细胞，将细胞接入100ml三角瓶中，接种密度为3Xl()Scells/ml，培养体积为35ml，将三角瓶置于37。C温箱中摇床上培养，摇床转速90r/min。每隔24h取样计数。同时以添加5mM谷氨酰胺、0.1%(w/v)PluronicF_68、25yg/ml硫酸葡聚糖及5%(v/v)新生小牛血清的DMEM/F12(v/v，1:1)培养基作为对照。整个培养过程持续8d，每天取样倒置显微镜下观察细胞形态，用CedexA20测定CHO细胞的活细胞密度。在含5%(v/v)小牛血清DMEM/F12(v/v，1:1)培养基中悬浮培养的CHO细胞可见部分细胞集结成团现象(图1A);CHO细胞在本发明无血清培养基中呈单个细胞悬浮生长(图IB)。培养第4d，CHO细胞在本发明无血清培养基及含5%(v/v)小牛血清DMEM/F12培养基(v/v，1:1)中的活细胞密度分别达到4.3Xl()6cells/ml和2.5Xl()6cells/ml(图2)。实施例3:与Hyclone公司的CHO细胞无血清培养基SFM-CH0比较在Hyclone公司SFM-CH0培养基中加入0.1%(v/v)PluronicF-68及25iig/ml硫酸葡聚糖，采用与实施例2相同的培养方法对CH0细胞(CH0-K1)进行培养。整个培养过程持续8d。培养第4d，CHO细胞在本发明无血清培养基及Hyclone公司SFM-CHO培养基中的活细胞密度分别达到4.2X106cells/ml和3.3X106cells/ml(图3)。实施例4.在5升搅拌罐式生物反应器中批次悬浮培养1.培养基配方在DMEM/F12(1:1，v/v)基础培养基中添加以下物质胰岛素5mg/L腐胺0.8mg/L转铁蛋白7mg/L谷胱甘肽lmg/L乙醇胺3mg/L卵磷脂2mg/L羟丙基-13-环状糊精200mg/LP-巯基乙醇20iiM抗i不血酸lOmg/L所述的添加物还含有以下微量元素Na2Se0310nMMnS04H20InMNa2Mo042H2010nMNaV0310nMCuS045H2010nMZnS047H203iiMFeC6H5075iiM所述的添加物还含有以下物质硫酸葡聚糖25iig/ml谷氨酰胺5mMPluronicF-68lOOOmg/LHEPEP15mM上述培养基成分溶解于去离子水中，用0.2ym微孔膜滤器过滤除菌。2.细胞培养将在250ml搅拌瓶中用本发明无血清培养基悬浮培养的CHO细胞(CHO-S，Invitrogen公司)按3X105cells/ml接种5L搅拌罐式生物反应器(B.BraunBiotecnlnternational公司)，加本发明无血清培养基至5L设定工作体积。温度设置为37°C，溶解氧浓度控制在3050%，pH控制在7.17.2，搅拌速度设置为60_70r/min，每天取样用CedexA20测定细胞密度和细胞活力。整个培养过程持续8d，培养第4d的活细胞密度达到4.6X106cells/ml(图4)。以上实施例具体使用原料均可从市售途径得到。本发明使用原料来源l、DMEM/F12(v/v，l:1)培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购自美国Hyclone公司。2、胰岛素、转铁蛋白、腐胺、嵌段式聚醚F-68(PluronicF_68)、谷胱甘肽、谷氨酰胺、抗坏血酸、P-巯基乙醇、亚硒酸钠、硫酸铜、硫酸锌、乙醇胺均美国Sigma公司产品。3、硫酸葡聚糖购自日本Wako公司。4、卵磷脂德国Merck公司产品。5、羟丙基-13-环状糊精购自山东恒台新大精细化工有限公司。6、硫酸锰、钼酸、偏钒酸钠、柠檬酸铁均购于北京化学试剂公司。1权利要求一种用于CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，所述培养基包含有基础培养基和添加物；其特征在于，所述添加物的组分和用量为胰岛素2～5mg/L腐胺0.5～0.8mg/L转铁蛋白5～7mg/L谷胱甘肽0.5～1mg/L乙醇胺1～3mg/L卵磷脂1～2mg/L羟丙基-β-环状糊精100～200mg/Lβ-巯基乙醇10～20μM抗坏血酸5～10mg/L。2.根据权利要求1所述的用于CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述添加物中还含有以下组分和用量的微量元素Na2Se03510nMMnS04H200.5InMNa2Mo042H20510nMNaV03510nMCuS045H20510nMZnS047H2013iiMFeC6H50735iiM。3.根据权利要求1或2所述的用于CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述添加物中还含有以下用量的物质谷氨酰胺5mM硫酸葡聚糖25mg/L嵌段式聚醚F-68lOOOmg/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸15mM。4.根据权利要求1或2所述的用于CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为体积比为1:1的匿EM/F12。5.根据权利要求3所述的用于CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为体积比为1:1的DMEM/F12。6.根据权利要求5所述的用于CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述培养基用于CHO细胞的高密度悬浮培养。全文摘要本发明公开了一种适于CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基。该培养基是以DMEM/F12(v/v，1∶1)为基础培养基，并添加了胰岛素、腐胺、转铁蛋白及微量元素等其它物质。本发明提供的无血清培养基具有以下优点能够支持CHO细胞在悬浮培养条件下快速生长；蛋白含量很低且化学成分基本明确。细胞呈单个悬浮生长、活细胞密度和细胞活率高于有血清和同类商品化无血清培养培养；成本较低。文档编号C12N5/075GK101724600SQ200910241670公开日2010年6月9日申请日期2009年11月30日优先权日2009年11月30日发明者刘兴茂,刘红,叶玲玲,吴本传,李世崇,王启伟,谢靖,陈昭烈申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所