专利名称：：一种启动子BgIosP525、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种启动子，特别是一种单子叶植物例如水稻的启动子，以及所述启动子的制备方法及用途。
背景技术：
：启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5'端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。根据启动子的转录模式可将其分为3类组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassavaveinmosaicvirus,CsVMV)中分尚白勺。人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶13亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果(Plantbiotechnology,2002，19(1):19-26)。单子叶植物基因中常见的启动子有Ubi启动子(Plantubiquitinpromoter)、Actin启动子(PlantActinpromoter)禾口Adh-l启动子(Maizealcoholdehydrogenase1promoter)。Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的Ubi-1启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbBl启动子、烟草泛素Ubi.U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubil-l启动子，大麦泛素Mubl启动子。玉米泛素Ubi-l启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现，属于强组成型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。Adh-l启动子调控乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-l启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦和大麦，和少部分双子叶植物如烟草，基因的调控功能比花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子提高10-50倍。Adh-1启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调控效果都很有限。单子叶植物是被子植物的主要类群，单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天南星等，是非常重要的农业作物。单子叶植物基因的强效启动子，能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因，对优良作物的分子育种研究意义重大。在强效启动子相关研究领域，发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外，双子叶植物中的一些强效启动子如CsVMV启动子、番茄E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vstl启动子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。尽管已经有上述已知的单子叶植物的启动子，本发明人通过对水稻基因组的深入研究，提供了一种新的单子叶植物启动子，所述启动子能够用于调控单子叶植物中目的基因表达，同时为研究单子叶植物中目的基因表达提供了一种新的工具和选择。
发明内容本发明的一个方面，提供了一种具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的单子叶植物启动子。在本发明中，所述启动子的具体碱基序列长度为2738个碱基，如SEQIDN0:1所不在本发明中，将SEQIDNO:l所示的启动子序列称为启动子BglosP525，或简称为P525启动子。该启动子为组成型启动子，带有该启动子和GUS的水稻愈伤组织经GUS染色实验后，所述水稻愈伤组织变为蓝色。本发明的又一方面，涉及具有与SEQIDNO:l所示核苷酸序列互补的序列的启动子。本发明的又一方面，还涉及SEQIDNO:l所示单子叶植物启动子的具有启动子功能的选自如下的变体1)在高等严紧条件下与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQIDN0:1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，禾口3)与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，"杂交条件"根据测量杂交时所用条件的"严紧性"程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，"最大严紧性"典型地发生在约Tm-5°C(低于探针Tm5°C);"高等严紧性"发生在Tm以下约5-l(TC;"中等严紧性"发生在探针Tm以下约10-20°C;"低严紧性"发生在Tm以下约20_25°C。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6XSSC=极低严紧性；3XSSC=低至中等严紧性；1XSSC=中等严紧性；0.5XSSC=高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同一性的核酸序列。对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，ColdSpringHarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括用5XSSC、0.5%SDS、1.OmMEDTA(pH8.0)溶液预洗;在50-65。C下在5XSSC中杂交过夜；随后用含O.1%SDS的2X、0.5X和0.2XSSC在65。C下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65t:或65-70°C。在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQIDN0:1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。在本发明中，所述对SEQIDN0:1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5'端和/或3'端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。在本发明中，所述对SEQIDNO:1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQIDNO:l的参考核苷酸序列至少具95X的"同一性"是指在SEQIDN0:l的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，参考序列中多达5%的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5%;或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5%。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。在本发明中，所述与SEQID冊1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQIDNO:l所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90%序列同一性、优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。在本发明中，所述与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列具有与SEQIDNO:l所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。本发明中，所述的启动子来源于单子叶植物，具体地，所述单子叶植物为水稻，例如所述水禾舀为日本睛(0ryzasativaLssp.japonicacv.Nipponbare)。本发明的又一方面，还涉及一种含有本发明所述单子叶植物启动子的重组载体。所述重组载体可以通过将上述启动子插入到克隆载体或表达载体而得到。适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-TSimpleVecter、pMD19-TSimpleVecter等。适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为p8+P525重组载体。本发明的又一方面，还涉及含有本发明所述单子叶植物启动子的所述重组载体的重组细胞。所述重组细胞可以通过将含有本发明所述单子叶植物启动子的所述重组载体转化至宿主细胞而得到。适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101等。在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组根癌农杆菌(Agrobacteriumt聽faciens)EHA105-P525。本发明的又一方面，还涉及一种单子叶植物愈伤组织，所述愈伤组织转化有本发明所述的启动子。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻。所述水稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、11优416、11优107、11优128、11优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101(上述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公司)等。在本发明的又一实施方案中，所述水稻为日本晴。本发明的又一方面，还涉及一种制备本发明所述启动子的方法，包括如下步骤1)根据SEQIDN0:1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR扩增引物对进行PCR扩增。本领域技术人员周知，可以根据待扩增的目的核苷酸序列按照碱基互补原则设计相应的PCR扩增引物对。在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增引物对如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。本发明的又一方面，还涉及一种调控单子叶植物中目的基因表达的方法，所述方法包括用本发明所述单子叶植物启动子转化单子叶植物的愈伤组织的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明所述单子叶植物启动子的重组细胞。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了前述的重组农杆菌EHA105-P525。在本发明的一个具体实施方案中，所述单子叶植物的愈伤组织为水稻愈伤组织，具体地，所述水稻为日本晴。在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。本发明中，可利用所述单子叶植物启动子调控目的基因表达的所述单子叶植物包括但不限于，例如水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等。本发明的又一方面，还涉及本发明所述单子叶植物启动子在单子叶植物中调控目的基因表达的应用。在本发明的一个实施方案中，利用本发明所述启动子调控的目的基因是GUS。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻，具体地所述水稻为日本晴。为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。本发明的又一方面，涉及本发明所述启动子在水稻育种中的用途。所述水稻为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。在本发明的一个实施方案中，所述水稻为日本睛。本发明的启动子可成为一种新的启动子作为单子叶植物、尤其是水稻转基因的工具启动子，为开展低表达基因转化苗筛选、植物花器官败育等分子育种研究提供便利，从而极大的縮短优良品种的选育时间。本发明的启动子可广泛用于培育水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等单子叶植物。发明的有益效果为了寻找新的单子叶植物启动子，用于调控单子叶植物目的基因表达，同时为研究单子叶植物基因表达提供新的工具和选择，本发明人通过生物信息学研究获得，并采用生物学实验验证了所述启动子BglosP525的功能。具体地，所述启动子能够在水稻中调控GUS基因表达。图1是启动子BglosP525的PCR扩增检测结果，其中，泳道1:200bpDNALadderMarker,泳道2:PCR扩增产物，泳道3:lkbDNALadderMarker,其右侧的数字3000和2000表示所指向的LadderMarker的条带的大小，单位都是bp。图2是用于构建p8质粒的pCAMBIA-1301质粒示意图。图3是p8质粒示意图中多克隆位点和GUS序列部分的示意图。图4是p8质粒示意图。图5是经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P525序列的重组根癌农杆菌p8+P525转化的水稻愈伤组织(左)经GUS染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻愈伤组织(对照，右)经GUS染色后颜色未发生变化。具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1P525启动子片段的PCR扩增和pMD18_T+P525重组载体的构建PCR扩增使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号DP320-02)提取水稻日本晴(2009年12月18日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-P200910)的基因组DNA，根据该启动子在水稻日本晴gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增弓|物(上游引物Fl，加限制性酶切位点KpnI和保护碱基，下游引物Rl，加限制性酶切位点SbfI和保护碱基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA为模板，使用高保真ExTaq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表l所示。表1基因启动子扩增的PCR体系组成_体积(pi)基因组DNA0.2Ex"a。2ddH20补满至总体积25piPCR扩增程序为94t:预变性5min，然后以94t:变性45s，55t:退火50s，72t:延伸90s，进行35个反应循环，最后72t:延伸7min。其中，上游引物F1:GGggtaccACATAAGCCGCTGTCGACGCC(SEQIDN0:2)，其中小写字母代表KpnI酶切位点。下游引物Rl:GCcctgcaggCGCCGCCGCGCTAGGGTTT(SEQIDNO:3)，其中小写字母代表SbfI酶切位点。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为2756bp的条带(图1)，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号DP209-03)进行纯化回收。pMD18-T+P525重组载体的构建将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序(如SEQIDN0:4所示)，证明准确。其中，T/A克隆的连接条件如下T/A连接体系10illpMD18-T1ii12*solutionI5u1PCR扩增产物(回收插入片段)10ng20ng，根据其浓度定ddH20补齐至10ii1于16t:在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上，得到pMD18-T+P525重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100DH5a(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海生工购得)，冰上融化后，加入10ii1如上所得的连接产物，即pMD18-T+P525重组载体，^at匀，冰浴3Qirin，42t:f^敫60s，冰浴5irin，加入600y1《C预冷的SOC土^#基(具^E方详见《分子克隆实验指衝〉，第3K，科学出版社)，37。C22Qrpii复苏4&iin，800Qrpii离ll、30s，去上清，留取150"l，用剩下的150"上清重悬沉淀后盼混^勿，轻轻吹匀，5朱涂布1￡(卡男隋素)平板(具^K方详见《^克隆实验指衝〉，第3K，科学出版社)，3TC倒gi歸他24h。获得含有iM)18-T怖25克^^体WS^肽肠杆菌，命名为Effia书25。^楚川华大基因禾4^I货份有限公司对lM)18-T怖25克^g^本中的P525进行测序，结果如下GGGGTACCACATAAGCCGCTGTCGACGCCCGACCTAAACAGTTGGACTGTTTTATATCATAAAAAAAATCAAACAAAAAGAAAAAATATTCCCCATCTGTGAAATTCGCAAAACCCTAGCGCGGCGGCGCCTGCAGGGC(SEQIDNO:4)上面的序列中，带下划线的为酶切位点，带方框的为引物序列。测序结果表明，获得的pMD18-T+P525克隆载体中P525启动子序列正确。实施例2载体p8+P525重组载体的构建按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号DP103_03)的操作手册，从实施例1构建的转化有启动子P525的大肠杆菌DH5a-P525中提取带有本发明P525启动子序列的克隆载体pMD18-T+P525;纯化后用相应的限制性内切酶KpnI(NEB，R0142)和SbfI(NEB，R0642)进行酶切，回收相应的启动子插入片段，并分别与p8质粒用相同的限制性内切酶酶切后回收的载体大片段进行连接。将所得连接产物p8+P525重组载体转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞DH5a，37t:倒置培养1624h，待转化子长出菌落后，挑取单克隆进行PCR检测和酶切鉴定。p8质粒构建本发明中所使用的p8质粒是由pCAMBIA-1301质粒(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，该公司的pCAMBIA-1301质粒的原始来源是TheCAMBIABios(biologicalopensource)Licensee,Australia)按照如下方式改造并构建的，具体说明如下用KpnI/NcoI(NEB)双酶切质粒pCAMBIA-1301(参见图2)，回收大片段。根据所采用的限制性内切酶位点合成如下序列GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCATGG(SEQIDNO:5)(包含的酶切位点是KpnI/HindIll/SpeI/SbfI/PstI/XbaI/BamHI/Sa11/NcoI)，用KpnI/NcoI双酶切后回收，与上述所回收的大片段连接后转化ToplO细胞(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如北京索莱宝科技有限公司购得)。用引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT(SEQIDN0:6)/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQIDNO:7)筛选转化子，通过PCR检测方法，带有扩增片段为350bp的转化子即为含有需要构建的多克隆位点及GUS序列的p8质粒的转化子(参见图4)。所述p8质粒中的多克隆位点和GUS序列的长度2353碱基，如SEQIDNO:8所示(参见图3):TCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGAAGCTT'—'ii-1iGGTACCACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCJ7Y76TJWOTY^(76"6T^777^X46T7TnrTO77TO7T7TC7mTcc趟otto"rraratfC6T卿7m^6wora③ff扁6rc卿c^7r6T6^na77T7r"r6m7raeraa7"c^6T6T卿ra」■ra④」6TOr"""(X47rm^虹"rcra7Yraj7mmm^r釘"rac"超crn^③扁■6rcramraw卿too^to群"ra77Y7盧7mTOra」""C77raJ(OT"c"w"(t」c咖"C7T度"OT6T①7m7"(x7r7^c"C6T③"7X47T7ra71①C7T①"c(x^kx扁"^OT^C6T虹扁④7T(X4■CC7Y^7W7ra①(X477"7V"cr歸7TOW^jCCTOm77T4a7OT"""7Y7CTO^"r①"7Yra7T6T^7^77"t^扁OTm^7Y77TmT7raWototx47mrr7r^6W虹"c"6^③"卿""cm6T②eraw"卿wera^虹w7T扁w化ran口c"扁ra"c6tcjrac③"tmrc"釘rac卿"ar7TOOmtmW①f①6T趨c咖wra虹wmraraa:③卿cot"dora紅6wcrracra^rra^a6T③wraraC7v7ra7mm^wra咖w7mT"rawra6w咖;r6TC6^^7V①r7ram^7totojoto③w7T6wa77TC6T"c雄扁卿j7rrraC7rmL4咖C"M"扁①(X4raC"(X4C"C6T6TO(SEQIDNO:8)如上序列所示本发明中所构建的p8质粒，其多克隆位点中的EcoRI/SacI/KpnI/HindIII/SpeI/SbfI/PstI/XbaI/BamHI/SalI/NcoI限制性酶切位点分别用加框和下划线表示，筛选转化子所用的引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(即SEQIDN0:6和7)用双下划线表示，GUS序列用斜体表示，其内含子序列分别用斜体加底纹示出。重组载体p8+P525的构建根据限制性内切酶KpnI(NEB，R0142)和SbfI(NEB，R0642)操作说明，按照如下条件处理实施例1中所得到的克隆载体pMD18-T+P525，以及如上所述构建的p8质粒。其中，克隆载体pMD18-T+P525及p8质粒的酶切条件如下酶切体系50ill无菌水34.8ii110*bufferH5u1KpnI0.1ii1(10U)SbfI0.1ii1(10U)克隆载体pMD18-T+P525或p8质粒10ii1(<1000ng)使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号DP209_03)分别回收经酶切的p8质粒，以及启动子P525插入片段，根据T4连接酶(TaKaRa，D2011A)操作说明，按照如下条件进行连接连接体系10ill10*T4buffer1ii1酶切后的p8质粒1ill(20ng)回收的启动子P525插入片段10-20ng，根据其浓度定无菌水补齐至9.5iUT41igase(TaKaRa，D2011A)0.5ii1T4buffer冰上融化，酶切后的p8质粒载体加入量约20ng，本发明中的P525片段加10-20ng。于16t:在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上。将100ii1氯化f丐法制得的感受态细胞DH5a从超低温冰箱取出，冰上融化后，加入lOiil上面的连接产物，轻轻搅匀，冰浴30min，42t:热激60s，冰浴5min，加入600ia4。C预冷的S0C，37。C下220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150iil，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(kan)，37。C倒置培养1624h。得到重组载体p8+P525。分别以F1(SEQIDNO:2)和Rl(SEQIDNO:3)为引物对所得重组载体p8+P525进行PCR检测，以确证所得重组载体p8+P525中含有所需启动子P525。通过酶切筛选含有重组载体p8+P525转化子。实施例3重组根癌农杆菌EHA105-P525细胞的制备将如实施例2所述方法构建的p8+P525重组载体和作为对照的p8质粒分别转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌EHA105(2009年12月24日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM209315)的感受态细胞，具体方法如下将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，至于冰上解冻。融化后，分别加入5iil的p8+P525重组载体和p8质粒以及作为对照的p8空载体，轻轻混匀，冰浴10min，放入液氮中冷冻5min，37t:解冻5min，加入800yl常温的LB液体培养基，28。C160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下200yl吹匀，涂布于加有kan-rif(卡那霉素_利福平)双抗的预培养基平板上(50mg/lKan，10mg/lRif，具体配方参见表4)。28t:倒置培养2-3天。以F1(SEQIDNO:2)和Rl(SEQIDNO:3)为引物进行PCR检测和通过KpnI/SbfI酶切筛选转化子。PCR扩增出约2756bp条带和酶切出约2745bp条带的为重组载体p8+P525的重组根癌农杆菌。本发明中，按照如上述方法得到的带有重组载体p8+P525的重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-P525。按照本发明所述方法，得到的带有p8质粒的对照重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-p8。实施例4水稻愈伤组织的诱导和转化按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组根癌农杆菌EHA105-P525和重组根癌农杆菌EHA105-p8转化所述愈伤组织。1)将水稻日本睛种子去壳，70%乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5%的次氯酸钠消毒30min，期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于N6D培养基(具体配方参见表2)上，用封口膜封口；29.5t:光照培养3-4周；2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径l-3mm)，在新N6D培养基上29.5t:光照培养3天；3)分别挑取如实施例3所构建的重组根癌农杆菌单菌落(重组根癌农杆菌EHA105-P525或重组根癌农杆菌EHA105-p8)，于添加抗生素(50mg/lKan，10mg/lRif)的预培养基(具体配方参见表3、表4)上划线培养3天，培养温度28°C;分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了30iUlOOmM的AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30mlAAM培养基(具体配方参见表5)中，温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞(重组根癌农杆菌EHA105-P525或重组根癌农杆菌EHA105-p8);4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将如步骤3制备的重组根癌农杆菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min;5)倒掉重组根癌农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于N6-AS培养基(配方参见表6)上放一张灭菌滤纸，加lml如上述含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，28。C暗培养48-60h;6)将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含lmg/1潮霉素B(HmB)和50mg/lCarb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29.5"光照培养3-4周。实施例5水稻愈伤组织中的GUS的表达为检测经过实施例4所述转化的水稻愈伤组织中目的基因GUS的表达情况，按照ChenSY等在JournalofIntegrativePlantBiology,2008，50(6):742-751所述的方法，对分别用重组根癌农杆菌EHA105-P525或重组农杆菌EHA105_p8转化的水稻愈伤组织进行染色。GUS染色液的配方(lml):610ii10.2MNa2HP04溶液(pH=7.0);390ii10.2M化11204溶液和lOii10.1MX-gluc。将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P525或重组根癌农杆菌EHA105_p8转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，37t:保温至出现蓝色，拍照记录，结果如图5所示，经含有启动子的P8+P525重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图5左)经染色后呈现蓝色，不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(作为对照，图5右)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明的P525启动子对GUS基因表达具有调控作用。本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下以下有关培养基中所称的"常规灭菌"是指如下条件的灭菌12rC下蒸气灭菌20分钟。表2N6D培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>用1N氢氧化钾调节pH值到5.8，封口后按常规方法灭菌。N6macro母液(20X):硝酸钾56.60g，磷酸二氢钾8.OOg，硫酸铵9.26g，硫酸镁3.70g，氯化钙3.32g，蒸馏水定容至1L，4。C保存备用。N6micro母液(1000X):碘化钾0.80g，硼酸1.60g，硫酸锰3.33g，硫酸锌1.50g，蒸馏水定容至lL，4t:保存备用。铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):将3.73g乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA2H20)和2.78gFeS04.7H20分别溶解，混合并用。用蒸馏水定容至1000ml,7(TC温浴2h，冷却后4°C保存不超过1个月。N6维生素贮存液(1000X):维生素10g，维生素B60.05g，烟酸0.05g，甘氨酸0.20g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4t:保存不超过1周。表3YM液体培养基(含有50mg/LKan，10mg/LRif):<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表4YM固体培养基(含有50mg/LKan，lOmg/LRif):<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>加IN氢氧化钾调节pH值至5.2，常规灭菌。AAMmacro(10X):2.5g七水硫酸镁(MgS04.7H20)，1.5g二水氯化钙(CaCl2*2H20)，1.33g二水磷酸二氢钠(NaH2P04.2H20蒸馏水定容至1L，4"保存备用。AAMmicro(100X):0.7g单水硫酸锰(MnS04*H20)，0.2g七水硫酸锌(ZnS04*7H20)，0.075g碘化钾(KI)，0.3g硼酸(H3B03)，25mg二水钼酸钠(Na2Mo04.2H20)，2.5mg五水硫酸铜(CuS04.5H20)，2.5mg六水氯化钴(CoCl2.6H20)，蒸馏水定容至1L，4"C保存备用。AAM有机(1000X):0.75g甘氨酸(Glycine)，0.lg烟酸(Nicotinicacid)，0.lgVB6(Pyridoxine)，lgVB!(Thiamine)，蒸馏水定容至100ml，4"C保存备用。铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见表2。表6N6-AS共培养基1L0.5L2L<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>调pH至5.2。N6macro母液(20X)，N6micro母液(IOOOX)，铁盐(Fe2EDTA)贮存液(IOOX)，N6维生素贮存液(IOOOX):均见表2尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。序列表〈110〉深圳华大基因科技有限公司〈120〉一种启动子BglosP525、其制备方法及其用途〈130>IDC090178〈160>8〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>2738〈212>DNA〈213>水稻日本晴(0ryzasativaLssp.j即onicacv.)〈400>1acateagccgctgtcgacgcccgaccteaacagttggactgttttetetcattettegcg60ggggattgtetteagtttttgcgc皿ggatateagatgac120皿ggttgtetttgaactttgtgtttetteaaacattttgc180atecggatgtccggttttggatttetcatgttgagcaatt240ggagggtttcaagatcattttttgcaatggtgagatttccttcaccaactattttttgtt300atte^agggatcttgtetttetgteacacccacatcttc360tteteattttctcctctgtgtttegatcctgg卿tc郷tttteggcgc420C3C3gCC3ggtgratgg卿ttggagac皿g3Cg皿3Cggcacttgcctg■tggatectgtctttctecttctccgttcttcc^tgatgaattggtgattggccttttca540郷tegttgcagc皿gtetctcctgaagatgac皿ttggaatcgatgttc600agtgcgtcgtC3CC3CC3Cttgtcatgctttcagaacgtc皿Cg3C3C3Caacctctcgt660tttttcctttttgtg皿gteattttggcgaatecgagcacgaatttcgca720agctgttcttcaatttttgcgattccteacgcaaccgcgtgtgg腿gag780te皿gtgagatcgatcgaatcaagcatctcctgcgtecagtegctgccag840ccatgatcacttgtggcagccatecttgaggcatctcgatcgttttcaggacgtctctgg■cttgacagctgagttg卿ttettcaggttgatctttttgcttggttcagatttcagatc960cgtcagacttttcaattctgttttcctectcgttttecaggttctgaaattgccaaatgc1020Cg3CC3朋Cg朋gacgtgattctgttggtettggg郷agategg皿gga1080aaaacctgtcctgcaaatgctetgccatettgccttccaatg卿gtetg1140tcagcattca3gC皿3C3gCttetegttcgtcccategaggctggatgtg1200g朋cgttegcatttgtaatccteatttteattcatttteggcgttccttt1260tcaaatttttte郷ctgtgtttegttcctg皿gtttgggttg朋attgg1320tecgatgteactgaaaatttgcgtgtgtettgtgatgg皿1380gtttggatct朋3C3C3gCCtaagtttcggcttttteaccatecte皿cg1440ccteccgteaaactectttttcgteacatcgtttttettctetggcttet皿ctcg皿gc1500ctatcaatgtgactegtectattttettectteatga^cgtctatecat1560朋皿ccgtea朋皿gccatggac朋皿teatectctetcc1620ateagg皿ttttetgtggatgtgacgtetcttetactttgggtg卿gga1680agaggtecteateccactettatettgtectccctccatectcgtea皿gaaatcgttta1740ggacagcgacacggtttccattgacttctt1800ctttteteaaattetttttc1860atttttetettttcaaactctgatttetettcctaagatt1920tgattteagcattgtccteaactectttctggagteatetgtettggt朋1980C3gtecagtetegtegtegaatetectgtectgtegggggaggtttgggc2040cggc卿ggaatggg固gtcgcacatgccgtctgcgtgcgcttcccgcgaccteg皿te2100tcgcccactcgctcaaccgcatetcccttccteataacctctccgatccgteaacctcgc2160ccatgcgccacgtcccccctagtgtcctecctcccggaccacccggtcttggtegaccac2220gtccacctcctatcctccctaacccaaccaccccacggteacccacgtec2280tteacgcgagtteccccccgcaaagatccaaccgcctctcgcaccgcccgcctgtccacc2340cacgcctactgacgaacccggcccacctctccgggccccaccatgtcgtcaccacgcagg2400cc朋朋tcgggg卿gcgtgtcgtggtcccacctgtcattggcttcgtgggtgggagcgg2460gtcacgtgcatctcgacatgactcgaggaggteaccatggttetggtaaccccaccgcct2520tgacacccgtggtteggggtgggggcgcgcgatgccgccacgtgtgacgatcggacggct2580gCgg3gggC3tcggggttgggcgacccgcctettteaccgcgggggcctcgtcttcctca2640ggccacgcagcgatctg皿gtg皿3C3gc3皿皿朋atc3皿c朋皿3g3a皿朋tettc2700cccatctgtg朋attcgc皿朋ccctegcgcggcggcg2738〈210>2〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ggggteccacateagccgctgtcgacgcc29〈210>3〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3gccctgcaggcgccgccgcgctegggttt29〈210>4〈211>2756〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4ggggteccacateagccgctgtcgacgcccgaccteaacagttggactgttttetetcat60tettegcgggggattgtett朋gtttttcaateatcc3gcgc朋ggateagateg朋tet120ggttgtetttgaactttgtettggaatetgtttetteaaacattttgccc180acggatgtctteateaaaccggttttgggaaattteatetttetcatgtt240g解咖ttgggatcattttttgcaatggtgagatttccttcaccaactet300tttttgttettea皿ggg皿atgaagtcatcttgtetttetgteacacaacaaactctcc360acatcttcttateattttctcctctgtgtttegatcctgaaatgaattggagatcaggtt420tteggcgccaC3gCC3ggtgC3tgg3g3ttgg3g3C朋g3Cg朋3CggC3cttgcctgca■gatectgtctttctecttctccgttcttccaatgatgaattggtgattgg540ccttttcaaggtegttgragc朋gtetctetctetetetcctg朋gatgac朋ttgg朋t600cgatgttcagtgcgtcgtcaccaccacttgtcatgctttcagaacgtcaacgacacacaa660cctctcgttttttcctttttgtg朋gteattttggcg朋t3cg3gc3ccatgag朋c3ga720atttcgcacactgttcttcaatttttgcgattccteacgcaaccgcgtgt780gg腿g卿g皿gga皿cte皿gtgagatcgatcgaatcaagcatctcctgcgtecagte840gctgccagccatgatcacttgtggcagcc3tecttgaggcatctcgatcgttttcaggac■gtctctggctgttgagattettcaggttgatctttttgcttggttcagat960ttcagatccgtcagacttttcaattctgttttcctactcgttttacaggttctgaaattg1020ccaaatgccggacgtgattctgttggtettggg郷卿t1080aacctgtccttgccatettgccttccaatg1140agagtetgtc3gcattc皿gC皿3C3gCC3ategttcgtcccategaggc1200tggatgtggaacgttegccattgteatcctcatttteggc1260gttccttttcaggctgtgtttegttccttctea朋ttegaagtttgggtt1320g朋attggtecgatgtaactgtgtgtetgtC郷ttg3tgtgatgg朋朋1380agttgg朋gtttggatcteaacacagccteagtttcggctttttaaccaa1440acteaacgccteccgtea皿ctectttttcgteacatcgtttttattctetggcttetea1500ctcgaagcctctegtectettttettecttctetacatta1560朋ccgtea皿1620ctctetccat3tgtgg3tgtgacgtetcttatectttggg1680tg卿gg皿gaggtecteataccactattetettgtectccctccatectcgt朋朋g朋1740atcgtttagg3C3gCg3C3Cggtttccaaaacacaactttgacttcttet1800gtatttettgtatgtetecttetttttcaagac朋3tcte1860ttttetatttgttetttetgatttatettc1920ctaagatttgattteagcattgtcctaaactectttctttateagtetggagt朋tetgt1980gtecagtetetec3gcagtegtegteg皿tatectgtectgteggggg3g2040gtttgggccggC3g3gg皿tgggccagtcgcacatgccgtctgcgtgcgcttcccgcgac2100ctagaatatcgcccactcgctcaaccgcatatcccttcctaateacctctccgatccgta2160aacctcgcccatgcgccacgtcccccctegtgtcctecctcccggaccacccggtcttgg2220tegaccacgtccacctcccctcctcccteaCCC朋CC3CCccacggteac2280ccacgtectt朋cgcgagtt3CCCCCCgC3皿gatcc皿ccgcctctcgcaccgcccgcc2340tgtccacccacgcctectgacgaacccggcccacctctccgggccccaccatgtcgtcac2400cacgcaggcc朋皿tcgggg卿gcgtgtcgtggtcccacctgtcattggcttcgtgggt2460gggagcgggtcacgtgcatctcgacatgacaaccatggttatggteaccc2520caccgccttgacacccgtggtteggggtgggggcgcgcgatgccgccacgtgtgacgatc2580ggacggctgcgg郷gratcggggttgggcgacccgcctettteaccgcgggggcctcgt2640cttcctcaggccacgcagcgatctg朋gtg2700aaatettccccatctgtgaaccctegcgcggcggcgcctgcagggc2756〈210〉5〈211〉49〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉5ggtecc皿gcttectegtcctgcaggtctegaggatccgtcgaccatgg49〈210>6〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6gcttccggctcgtetgttgt20〈210>7〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7gagtcgtcggttctgteac19〈210>8〈211>2353〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8gttggc朋gctgctctegccaatecgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcat60teatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaatt120朋tgtgagttagctcactcatteggcaccccaggctttecactttetgcttccggctcgt180atgttgtgtgg朋ttgtgElgcggateac朋tttcac3C3gg朋3cagctetgaccatgat240tecgaattcgagctcggteccaagcttectagtcctgcaggtctegaggatccgtcgacc300atggtegatctg郷gt腿tttctegtttttctccttcattttcttggtteggaccctt360ttctctttttatttttttgagctttgatctttcttteaactgatctetttttteattgat420tggttetggtgte朋tettecategcttteactgateatctgattectttatttcgtgtg■tctetgatgatgatgategttecagaaccgacgactcgtccgtcctgtegaaaccccaac540ccgtgaaatc朋朋朋ctcgacggcctgtgggcattcagtctggatcgcgaaaactgtgg600朋ttg3tC3gcgttggtgggaaagcgcgttacaagaaagccgggcaattgctgtgccagg660cagtttteacgatcagttcgccgatgcagatettcgteattetgcgggcaacgtctggte720tcagcgcg朋gtcttteteccgaaaggttgggcaggccagcgtetcgtgctgcgtttcga780tgcggtcactcattecggcaaagtgtgggtcaateatcaggaagtgatggagcatcaggg840cggctetecgccatttgaagccgatgtcacgccgtetgttattgccgggaaaagtgtecg■tetcaccgtttgtgtg朋caacgaactgaactggcagactatcccgccgggaatggtgat960teccgacg朋aacggcaagaaaaagcagtcttecttccatgatttcttteactetgccgg1020aatccatcgcagcgt朋tgctctecaccacgccgaacacctgggtggacgatetcaccgt1080ggtgacgcatgtcgcgcaagactgteaccacgcgtctgttgactggcaggtggtggccaa1140tggtgatgtcagcgttg朋ctgcgtgatgcggatcaacaggtggttgcaactggacaagg1200cactegcgggactttgcaagtggtgaatccgcacctctggcaaccgggtgaaggttetct1260ctatgaactcg朋gtcac3gcc朋朋gccagacagagtctgatetctecccgcttcgcgt132022cggcatccggtg皿gggccaacagttcctgaaccgttcta1380ctttectggctttggtcgtcatg皿gatgcggacttecgtggc朋aggattcgateacgt1440gctgatggtgcacgaccacgctggattggggccaactcctaccgtecctc1500gcattecccttecgctg皿g3gatgctcgactgggc卿tg皿C3tggC3tcgtggtgat1560tgatga朋ctgctgctgtcggctttcagctgtcttteggcattggtttcg皿gcgggc皿1620c朋gccga皿g皿ctgtecagcga卿ggcagtc朋cgggg皿3CtC3gCaagcgcactt1680tegcgcgtgacc皿gcgtggtgatgtgg賜1740tettgccaacg皿ccggatecccgtccgca郷tgracgggaatatttcgcgccactggc1800gg皿gc朋cgcgteaactcgacccgacgcgtccgatcacctgcgtcaatgteatgttctg1860cgacgctcacaccgataccatcagcgatctctttgatgtgctgtgcctgaaccgttette1920cggatggtetgtcca朋gcggCg3tttgg3皿CggC3g3g皿ggtectgg1980tctggcctggC3gg3g皿3Ctgcatcagccgattetcatcaccg皿tecggcgtggatec2040gttegccgggctgcactcaatgtecaccgaratgtggagtg皿gagtetcagtgtgratg2100gctggatetgtatcaccgcgtctttgatcgcgtcagcgccgtcgtcggtg皿caggtetg2160gaatttcgccgattttgcgacctcgcaaggcatettgcgcgttggcggte2220gatcttcactcgcgaccgca朋ccg朋gtcggcggcttttctgctgcaaa皿cgctggac2280tggcatg皿cttcggtga皿朋CCgC3gC3ggg郷c腿caagctegcc3CC3CC3CC32340ccaccacgtgtga235权利要求一种具有SEQIDNO1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列的启动子，或其具有启动子功能的选自如下的变体1)在高等严紧条件下与SEQIDNO1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQIDNO1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和3)与SEQIDNO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。2.—种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的启动子，优选地，所述重组载体为p8+P525重组载体。3.—种含有权利要求2所述重组载体的重组细胞。4.权利要求3所述的重组细胞，其为重组农杆菌EHA105-P525。5.—种单子叶植物愈伤组织，其特征在于，所述愈伤组织转化有权利要求1所述的启动子，优选地，所述愈伤组织为水稻愈伤组织，更优选地，所述水稻为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特别优选地，所述水稻为日本晴。6.—种制备权利要求1中所述的启动子的方法，包括如下步骤1)根据SEQIDN0:1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，具体地，所述PCR扩增引物对为SEQIDNO:2禾PSEQIDNO:3。2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR扩增引物对进行PCR扩增。7.—种调控单子叶植物中基因表达的方法，所述方法包括用权利要求1所述的启动子转化单子叶植物的愈伤组织的步骤，优选地，所述愈伤组织为水稻愈伤组织，特别优选地，所述水稻为日本晴。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了权利要求4所述的重组农杆菌EHA105-P525。9.权利要求1所述的启动子在调控单子叶植物中目的基因表达的用途，其中所述目的基因为GUS，所述单子叶植物为水稻，优选地，所述水稻为日本晴。10.权利要求1所述的启动子在水稻育种中的用途，优选地，所述水稻为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、11优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特别优选地，所述水稻为日本晴。全文摘要本发明涉及一种启动子，特别是一种单子叶植物例如水稻的启动子，以及所述启动子的制备方法及用途。本发明所述启动子具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的选自如下的变体1)在高等严紧条件下与SEQIDNO1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQIDNO1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和3)与SEQIDNO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本发明还涉及所述启动子的制备方法以及所述启动子在调控单子叶植物中目的基因表达和水稻育种中的用途。文档编号C12R1/01GK101792764SQ200910249580公开日2010年8月4日申请日期2009年12月30日优先权日2009年12月30日发明者全志武,孙红正,张耕耘,曹颖申请人:深圳华大基因科技有限公司