专利名称：一株小球藻Chlorella sorokiniana CS-01及其产油脂的培养方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种小球藻Chlorella sorokinianaCS-01及 其培养获取油脂的方法。
背景技术：
由于化石燃料需求的日益增长与其储量的减少的矛盾加剧，加之化石燃料的使用 各种污染物的排放问题，人们广泛地意识到持续使用石油燃料是不可能的。运输用燃料的 可再生性和空气污染物的零排放对经济和环境的可持续发展都是十分重要的。生物柴油是 一种已经得到证明的燃料。生产和使用生物柴油的技术已经存在了50余年。目前，生物柴 油主要是以植物和动物脂肪酸为原料来生产的，而不是微藻。在美国，生物柴油主要以大豆 油脂为原料，其他来源包括棕榈油、菜籽油、动物脂肪酸、玉米油、废食用油和麻疯树油。但 这种现状可能会出现变化，因为有几家公司正在尝试着将微藻生物柴油商品化。
但由油料作物、废食用油和动物脂肪酸生产的生物柴油甚至只能满足当前车用燃 料需求量的一小部分。同时使用植物原料在所有的国家都存在共同的问题一、是否适合当 地气候，实现高产稳产；二、种植过程中产生的土地资源紧缺的问题以及由此引起的其他农 作物价格上涨的问题。特别在我国人多地少的情况下，这些问题在我国尤为突出。
跟植物一样，微藻也是利用光照产油，但却比普通作物的作用要大得多。大多数微 藻的产油量远远超过了最好的油料作物。与其他油料作物不同的是，微藻生长极为迅速，而 且含有极其丰富的油脂。藻类光合作用转化效率可达10%以上，含油量一般能达到30%， 在特定培养条件下可达80%以上。Metting和Spolaore研究发现微藻常常可以在24小时 内使其生物量翻倍，在指数生长期，生物量倍增时间可短至3. 5个小时，油脂含量达微藻干 重的80%。利用微藻产油具有不与农业争地的明显优势，而且可用海水作为天然培养基进 行大量繁殖。当前，国内外有许多科学家在探索发现新的藻种，并研制"工程微藻"，希望能 实现规模化养殖，降低成本，为获取油脂资源提供一条可靠的途径。美国国家可更新实验室 (NREL)通过现代生物技术制成"工程微藻"，即硅藻类的一种"工程小环藻"。该种藻类在实 验室条件下可积累油脂质量分数达60%以上，户外生产也可达40%以上。预计每m2 "工程 微藻"每年可生产约116L柴油。 国内微藻生物柴油的研究目前处于起步阶段，在化学法将生物油脂转化为柴油的 技术比较成熟的条件下，找到一种生产能力更大，价格更加低廉的原料及该原料生产方法 成为了人们要解决得首要问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有生物柴油原料来源生产能力不足，提供一种成本 低、产出高且副产品经济价值高的新的用于生物柴油生产的微生物小球藻Chlorella sorokiniana CS-01及其产油脂的培养方法。
从取自内蒙古包头市土右旗生态公园的淡水水样中分离筛选得到的一株小球藻
Chlorella sorokiniana CS-01，保藏号为CCTCC M209220。培养基为BGll培养液，该菌株
为呈球状，直径在4 7微米之间，普通培养条件下，测定其蛋白质含量为55%左右，脂质
含量在14% 20%之间，多糖含量为4%左右，富含叶绿素。经形态学鉴定和18S rRNA扩
增序列分析，确定该藻株为小球藻，GeneBank提交序列号为GQ122327，命名为Chlorella
sorokiniana CS-01，保藏号为CCTCC M209220。该菌株适合培养温度和pH范围较广，分别
是25 35t:和6 11之间，比较适合在日照较好、温度较高、水体偏碱性的内陆地区培养。 本发明的小球藻发酵产油脂培养方法包括以下步骤 1)无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到灭菌培养液中指数培养； 2)将经过指数培养的藻株接种于BGll灭菌培养液中，接种终浓度为1X106个/
mL 3X 106个/mL培养基，培养温度为25 35°C ，培养基pH 6 11，氮源选用硝酸钠或
尿素，浓度为O. 3 1. 5g/L培养基，加入EDTA-Fe(ni)浓度为1 X 10—5mol/L 1 X 10—3mol/
L培养基，光照强度为6600 10000Lx，光暗比为14 : 10条件下通气培养18-22天收获或
非通气培养28-32天收获；所述培养温度优选为30°C 。 所述藻株培养时pH值优选为8. 1 。 所述氮源优选为硝酸钠，浓度优选为0. 5g/L，添加方式为一次加入或分批加入。 所述EDTA-Fe(III)浓度优选为1 X 10—4mol/L，添加方式为一次加入或分批加入。 所述通气培养的通气量为一分钟通气的气/液体积比100vvm。 3)油脂提取与测定将收获藻液离心分离，所得藻泥经冷冻干燥后采用索氏抽提
法和氯仿甲醇法分析油脂其含量。(均为常规分析过程) 与现有技术相比较，本发明具有以下优势 1)应用潜力好微生物油脂是唯一具有完全替代化石柴油潜力的生物柴油原料 来源，本发明中筛选得到一株小球藻，环境适应性较广，耐碱性强，即使在PH值为11的碱 性环境中可以较好生长；而且耐中高温(30到35摄氏度，常见微藻培养温度为20到30 摄氏度)。较高浓度的三价铁离子能显著促进其生长，EDTA-Fe(III)加入后最适浓度为 1X10—iol/L下，生物量比普通培养条件下(1X10—5mol/L)增长30% 40%，该藻株与已 报道其他小球藻株相比优势显著； 2)副产品经济价值高该小球藻一般培养条件下蛋白质含量55%左右(Bradford
法测定)，多糖含量在4 %左右(蒽酮法测定)，不饱和脂肪酸及多种维生素等物质普遍存在
于小球藻等单细胞绿藻中，在提取油脂同时能够加以利用，可提高经济效益； 3)产率较高本发明的微藻干粉得率最高为970mg/L发酵液，培养周期20-30天，
含油量最高可达到57%左右(油脂占细胞干重)，与现有生产生物柴油主要原料植物种子
(含油量10%，生产周期半年到一年以上)相比，产率大大提高。藻粉得率和培养周期均优
于现所报道的其他小球藻株。 本发明藻株保藏信息如下 小球藻Chlorella sorokiniana CS-01 ; 保藏号为CCTCC M209220 ; 保藏日期2009年10月13日；
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保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；
保藏单位简称CCTCC。
具体实施方式
实施例1 : 无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有5mL灭菌培养液的小试管中，置光照 培养箱静止培养，生长到指数末期以1 : io接种比例扩大培养。 将藻液接种于3L灭菌BG11培养基中，终浓度为IX 106个/mL 3X 106个/mL， 培养温度为3(TC，培养基pH为8. 1，氮源选用硝酸钠浓度为0.5g/L， EDTA-Fe(III)的加 入后浓度是1X10—iol/L，氮源和EDTA-Fe (III)加入方式均为一次性加入，光照强度为 10000LX，光暗比为14 : 10，培养方式为静置培养30天。 离心收集藻细胞，冷冻真空干燥，称藻粉干重并计算藻粉产量为500mg/L，氯仿甲 醇法测定微藻油脂含量为22%，油脂净产量为110mg/L。
实施例2: 无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有5mL灭菌培养液的小试管中，置光照 培养箱静止培养，生长到指数末期以1 : io接种比例扩大培养。 将藻液接种于3L灭菌BG11培养基中，终浓度为IX 106个/mL 3X 106个/mL， 培养温度为3(TC，培养基pH为ll，氮源选用硝酸钠浓度为0. 5g/L，EDTA-Fe(ni)的加入后 浓度是1X10—iol/L，加入方式为一次性加入，光照强度为IOOOOLX，光暗比为14 : IO，培
养方式为静置培养30天。 离心收集藻细胞，冷冻真空干燥，称藻粉干重并计算藻粉产量为390mg/L，氯仿甲 醇法测定微藻油脂含量为20%，油脂净产量为78mg/L。
实施例3 : 无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有5mL灭菌培养液的小试管中，置光照 培养箱静止培养，生长到指数末期以l : io接种比例扩大培养。 将藻液接种于3L灭菌BG11培养基中，接种后终浓度为1 X 106个/mL 3 X 106 个/mL，培养温度为3(TC，培养基pH为8. l，氮源选用硝酸钠浓度为0. 2g/L， EDTA-Fe(III) 的加入后浓度是1X10—4mol/L， EDTA-Fe(III)加入方式为一次性加入。培养第七天补料 硝酸钠(原有氮源基本消耗完全)，补料量为0. 2g/L培养液，光照强度为10000Lx光暗比 为14 : 10，培养方式为通气培养20天。通气培养的通气量为一分钟通气的气/液体积比 100vvm。 离心收集藻细胞，冷冻真空干燥，称藻粉干重并计算藻粉产量为730mg/L，氯仿甲 醇法测定微藻油脂含量为57%，油脂净产量为416mg/L。
实施例4 : 无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有5mL灭菌培养液的小试管中，置光照 培养箱静止培养，生长到指数末期以l : io接种比例扩大培养。 将藻液接种于3L灭菌BG11培养基中，接种后终浓度为1 X 106个/mL 3X 106个 /mL，培养温度为30°C ，培养基pH为8. 1，氮源选用硝酸钠浓度为0. 5g/L， EDTA-Fe (III)的 加入后浓度是1 X 10—4mol/L，氮源和EDTA-Fe (III)加入方式均为一次性加入，光照强度为10000Lx，光暗比为14 : 10，培养方式为通气培养20天。通气培养的通气量为一分钟通气 的气/液体积比100vvm。 离心收集藻细胞，冷冻真空干燥，称藻粉干重并计算藻粉产量为970mg/L，氯仿甲 醇法测定微藻油脂含量为20%，油脂净产量为194mg/L。
权利要求
一株小球藻Chlorella sorokiniana CS-01，其特征在于，保藏号为CCTCC M209220。
2. 权利要求1所述的小球藻产油脂的培养方法，其特征在于，包括以下步骤1) 无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到灭菌培养液中指数培养；2) 将经过指数培养的藻株接种于BG11灭菌培养液中，接种终浓度为lX106个/mL 3X 106个/mL培养基，培养温度为25 35。C，培养基pH 6 11，氮源选用硝酸钠或尿素， 浓度为0. 3 1. 5g/L培养基，加入EDTA-Fe(ni)浓度为1X10—5mol/L 1X10—3mol/LJ$ 养基，光照强度为6600 10000Lx，光暗比为14 : 10条件下通气培养18-22天收获或非通 气培养28-32天收获；3) 油脂提取将收获藻液离心分离，所得藻泥经冷冻干燥后提取。
3. 根据权利要求2所述的小球藻产油脂的培养方法，其特征在于所述培养温度为 30°C。
4. 根据权利要求2所述的小球藻产油脂的培养方法，其特征在于所述藻株培养时pH 值为8. 1。
5. 根据权利要求2所述的小球藻产油脂的培养方法，其特征在于所述氮源为硝酸钠， 浓度为0. 5g/L。
6. 根据权利要求2所述的小球藻产油脂的培养方法，其特征在于EDTA-Fe(III)浓度 为1X10—4mol/L。
7. 根据权利要求2-6中的任一项所述的小球藻产油脂的培养方法，其特征在于所述 的通气培养的通气量为一分钟通气的气/液体积比100vvm。
全文摘要
本发明公开了一株小球藻Chlorella sorokiniana CS-01及其产油脂的培养方法，该小球藻保藏号为CCTCC M209220。其产油脂的培养方法是将经过指数培养的藻株接种于BG11灭菌培养液中，加入0.3～1.5g/L硝酸钠或尿素，1×10-5mol/L～1×10-3mol/L EDTA-Fe(III)，25～35℃，pH 6～11；6600～10000Lx，光暗比为14∶10条件下通气培养或非通气培养收获；可收获细胞干重最高达970mg/L，油脂含量可达到57％。该藻株为淡水单细胞绿藻，环境适应性强、生长速度快、油脂产量较高，有潜力作为生物柴油制备原料在内陆地区大规模培养。
文档编号C12R1/89GK101705190SQ20091025239
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月29日 优先权日2009年11月29日
发明者万民熙, 刘鹏, 夏金兰, 李丽, 王润民, 聂珍媛, 邱冠周, 黄斌 申请人:中南大学