专利名称：转基因玉米的基因芯片检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，具体说是利用基因芯片对转基因玉米产品进行检测的 方法。
背景技术：
随着基因工程技术的快速发展，转基因作物已进入大规模商品化生产阶段，转基 因作物品种达100多个，主要有大豆、玉米、棉花、油菜等，由转基因作物加工生产的转基因 食品和食品成分达4000余种。然而转基因作物在带来巨大经济效益的同时也存在许多潜 在问题。由于目前尚缺乏科学依据证明转基因产品对人类健康和环境的安全性，转基因产 品对健康和环境潜在的风险引起世界各国政府和公众的极大关注和广泛忧虑。农作物中转 基因成分的安全性问题已由科学问题上升为社会问题。为了保护消费者的知情权与选择 权，世界很多国家都加强了对转基因作物及产品的检测及监管，并要求对含有转基因成分 的食品进行明确标示。玉米是世界上重要的农作物，国内外对于应用基因工程技术改良玉米，特别是改 良玉米的抗虫性和品质都非常重视。通过多年努力已经取得很大成绩，转基因玉米研究与 产业化进入了快速发展阶段。中国是世界第二大玉米生产国，常年种植MOO万hm2，我国转 基因玉米研究进展较快，转基因玉米在我国即将进入生产阶段，转基因抗虫、除草剂玉米的 产业化蓄势待发，转基因玉米的安全性检测与监督迫在眉睫。转基因玉米的检测，目前用的比较多的是PCR技术与ELISA技术(酶联免疫法)。PCR检测技术的基本原理是根据产品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物， 经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大，最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无， 从而对产品中是否含有靶标基因序列成分进行判定。应用PCR技术的关键是所设计的DNA 引物的序列必须和转基因产品中所待扩增的DNA序列互补，因此为了设计有效引物，检验 者必须对转基因产品中所含有的外源基因DNA序列有一定的了解。转基因生物中被导入的 外源基因序列一般包括标记基因、目的基因、及各自的启动子、终止子等调控序列。PCR定性筛选检测方法1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了 PCR检 测转基因产品的可能性。检测的一般程序①提取待检品中的DNA ②设计与待测特异DNA片 断相适的引物③对待测DNA片断进行PCR扩增④用琼脂糖凝胶电泳分离扩增的DNA，EB 染色后，分析鉴定转基因成分。定量PCR检测方法定性筛选PCR本身具有局限性，所采取的PCR法因其高敏 感性常伴有假阳性现象，而操作上的误差，加上一些反应抑制因素亦可带来假阴性现象， 其最大的不足是无法对转基因成分进行定量分析。为此，研究者们在定性筛选PCR方法 的基础上，发展了不同的定量PCR检测方法。目前，国外较为成熟的方法主要有定量竞争 PCR(Quantitative competitive, QC-PCR)禾口 Real-time PCR 法。定量竞争PCR法先构建含有修饰过的内部标准DNA片断(竞争DNA)，与待测DNA 进行共扩增，因竞争DNA片断和待测DNA的大小不同，经琼脂糖凝胶可将两者分开，并可进行定量分析。①样品DNA的提取和定量。按常规方法提取DNA。DNA含量可用紫外分光光 度计测定。②竞争DNA的构建。常规分子生物学的方法，用基因重组技术构建竞争DNA片 段作为内部标准DNA，此片段除含有转基因成分外(如35S启动子、NOS终止子)，还插入数 +bp的DNA序列(或缺失数+bp的DNA序列)。③标准工作曲线的建立。取定量模板DNA， 所含GMO量分别为0 100%的系列参考样，分别与一定量的竞争DNA在同一反应体系进 行PCR扩增。特异转基因DNA与竞争DNA竞争反应体系中的相同底物、引物，PCR反应获得 相差数+bp的两条凝胶电泳带，两条带浓度随转基因成分含量的不同而有差异。当两条带 浓度相等，则说明此参考样GMO浓度与竞争DNA浓度相等。通常实验时竞争DNA浓度调整 到与含转基因成分的参考样相当。通过凝胶成像分析系统对琼脂糖凝胶电泳的结果进 行分析，得到每条带的相对浓度，以此数据作〔目标DNA浓度〕——〔目标DNA浓度〕/〔竞 争DNA浓度〕的对数图，线性回归分析后得出工作曲线。④待测样品的测定，将500ng待测 DNA与经过定量的竞争DNA共扩增，凝胶电泳后经扫描分析得到两条带得到〔目标DNA〕/〔 竞争DNA〕的比值，依此数据在工作曲线图上求得待测样品的GMO含量。Real-time定量PCR法此方法须设计一个内部探针，该探针包含5’端荧光报告 因子和3’端猝灭因子。PCR反应前，由于猝灭因子与荧光报告因子的位置相近，使荧光受 到抑制而检测不到荧光信号。随着PCR反应从上游的PCR引物开始，引物和标记探针与目 标DNA分子中对应的互补序列复性，聚合酶与探针相遇，利用其5’核酸外切酶活性使报告 因子释放，产生的荧光可被内设的激光器记录，记录到的荧光强度可反映PCR的产物量，从 而实现实时定量分析。PCR检测技术灵敏度高，检测迅速。但现今的筛选方法，只是对特定启动子、终止子 和标记基因进行PCR检测，而PCR方法因其高敏感性常伴有假阳性现象。另一方面，随着转 基因技术的发展，越来越多的转基因生物采用全新的启动子、终止子和标记基因，使得现在 常用的筛选因子的覆盖面减小，失去筛选的意义。ELISA技术是建立在抗体抗原免疫学反应的基础上的。抗原抗体反应是一种非共 价键特异性吸附反应，即在通常情况下，抗原只和它自己(或具有相同抗原决定簇)诱导产 生的抗体发生反应，因此具有高度特异性，抗体抗原反应虽然产生肉眼可见的凝集反应，但 灵敏度太低而且需要大量的抗体和抗原。ELISA分析法特异性高，获得的结果很快，仪器简单，仪器操作，对人员要求不高； 免去了对样品进行核酸提取的麻烦，同时可降低检测的成本；由于酶具有很高的催化效率， 可极大的放大反应效果，从而使测定达到很高的灵敏度和稳定性。但是也有其局限性(1) 检测范围窄，需要转基因食品中含有待检测范围，如EPSPS基因的耐除草剂大豆，转Bt基因 的抗虫玉米等，因此只能在商业化GMF品种较少的情况下使用。目前商品化ELISA试剂盒 只能检测少数几种GMF，且一种试剂盒只针对某一特定转基因产物，无法高通量、快速的检 测具有多种混合成分的食品样品；( 易出现假阴性结果，一方面转基因产品中“新蛋白” 含量通常很低，难以检出，另一方面蛋白质在食品加工过程中易变性，已加工食品中的蛋白 质很可能失去抗体所针对的抗原表位，从而造成ELISA检测结果假阴性。此外，蛋白质在受 体生物基因组内表达前后如进行新的修饰，也可导致检测敏感性降低及假阴性结果。就目前转基因产品检测中常用的ELISA和PCR技术而言，最大的缺点是检测范围 窄，效率低，无法高通量大规模地同时检测多种样品，尤其是对转基因背景一无所知的情况下，对各种候选待检基因序列或蛋白的逐一筛查几乎是不可能的。因此，对转基因产品的检 测，需要有更有效、快速、特别是高通量的检测方法。
发明内容
本发明旨在提供一种高通量、微型化、自动化、快速高效、灵敏度高的转基因玉米 的基因芯片检测方法，涵盖的转基因玉米产品检测面很广，可一次性同时对目前我国批准 的转基因玉米中常用的启动子、终止子、抗虫基因、抗草甘膦基因等7种主要的外源DNA序 列进行检测分析的方法。本发明实现的步骤如下1)确定引物和探针2)采用多聚赖氨酸处理芯片载体，浸泡烘干。3)芯片制备探针与TE buffer充分混勻，采用芯片点样仪点样于处理过的芯片载体上，芯片经 过烘干，UV交联，化学封闭以及变性后，置于干燥箱中室温保存。4) PCR 扩增反应体系含有反应缓冲液，dNTP，引物，TITANUIM扩增酶，DNA模板，MgCl2,灭菌超 纯水。5) PCR产物标记反应体系含有反应缓冲液，Cy3_dNTP，Thermo sequence DNAPolymerase, SBE 引 物，多重PCR产物，灭菌超纯水。6)芯片杂交标记的PCR产物变性取出放置于冰上，加入杂交液，然后将杂交混合液滴于制备 的芯片上，杂交炉中杂交2h，杂交后的芯片经洗涤，离心，晾干。7)芯片扫描及数据处理利用芯片扫描仪对杂交反应后的芯片进行扫描，输出数据进行分析处理。本发明选择了最佳的的杂交条件和扩增、杂交引物，能使多基因PCR产物与芯片 上的杂交探针处于最佳的反应状态，大大提高了外源DNA的检出率，结果表明，灵敏度达 0. 01%。本发明通过一次性检测启动子、终止子、抗虫基因、抗除草剂基因等常见的7种外 源基因来判定待检样品是不是转基因玉米，是不是我国已批准的转基因玉米种类。本发明可广泛应用于进出口检验检疫。实施方式实施例1针对转基因玉米中常用的7个外源基因以及对照基因(18SrRNA、Invertase内源 基因)的序列，通过引物设计软件primer5. 0和oligo6. 0来设计引物和探针，并在ncbi进 行核苷酸序列的比对，从中选出符合要求的引物和探针，所选用的引物和探针信息详见表1 和表2。表 权利要求
1.一种转基因玉米的基因芯片检测方法，检测步骤如下1)确定引物和探针2)采用多聚赖氨酸处理芯片载体，浸泡烘干。3)芯片制备探针与TE buffer充分混勻，采用芯片点样仪点样于处理过的芯片载体上，芯片经过烘 干，UV交联，化学封闭以及变性后，置于干燥箱中室温保存。4)PCR扩增反应体系含有反应缓冲液，dNTP，引物，TITANUIM扩增酶，DNA模板，MgC12，灭菌超纯水。5)PCR产物标记反应体系含有反应缓冲液，Cy3_dNTP，Thermo sequence DNAPolymerase, SBE引物,多 重PCR产物，灭菌超纯水。6)芯片杂交标记的PCR产物变性取出放置于冰上，加入杂交液，然后将杂交混合液滴于制备的芯 片上，杂交炉中杂交2h，杂交后的芯片经洗涤，离心，晾干。7)芯片扫描及数据处理利用芯片扫描仪对杂交反应后的芯片进行扫描，输出数据进行分析处理。
2.如权利要求1所述的转基因玉米的基因芯片检测方法，其特征是步骤1所选用引物 如下1)18SrRNA.TAA TAG AGC AAT GAA CAG TCG G CTT TCA ACA ACG GAT CTC TTG G2)intervase内源基因GGC CGG ATC GTC ATG CTC TAC A TTG GCG TCC GAC TTG ACC CAC T3)CaMV 35S启动子GAT TCC ATT GCC CAG CTA TCT G TAG AGG AAG GGT CTT GCG AAG G4)T-nos终止子GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG CGA ATT CCC GAT CTA GTA AC5)修饰型CP4-EPSPSCGT CTT GAA GGT CGT GGT A GCA ACA GCG AGA ATT GGA TA6)杀虫毒蛋白CryIAb基因 TCG ACA TCA GCC TGA GCC TG TGG TTG ATC AGC TGC TCG ATC7)耐除草剂Ivrl基因CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC TGGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C8)抗虫kin基因GCT TGC ATT GTT CGC TCT C CGA TGG CAT GTC AAC TCA TTA9)抗虫zSSnb基因CGG TGG ATG CTA AGG CTG ATG AAA GGG CCA GGT TCA TTA TCC TC。
3.如权利要求1所述的转基因玉米的基因芯片检测方法，其特征是步骤1所选用探针 如下TTC AGA CCT CCA CCC TTG AATCGA GCA GAC CGC CGT GTA CTT CTA CCGGC CAT CGT TGA AGA TGC CTC TGC CAAT GTA TAA TTG CGG GAC TCT AAT CTGG CTG ACT TGC GTG TTC GTT CTT CTA CTT TGATG GTG CTC CGC GAT GTC TCCACT TTA ATA GCA TAC GTT ATT CCAGGT ATG AAC CCA GCA GGA ATT GGACGT GTA CTT CTA CC GTG TTC TTG。
全文摘要
一种转基因玉米的基因芯片检测方法，主要步骤包括确定引物和探针、芯片制备、PCR扩增、PCR产物标记、芯片杂交、芯片扫描及数据处理。该检测方法可一次性对转基因玉米中常用的启动子、终止子、抗虫基因、抗草甘膦基因等7种主要的外源DNA序列进行检测分析，是一种高通量、微型化、自动化、快速高效、灵敏度高的转基因玉米的检测方法，可广泛应用于进出口检验检疫等相关领域。
文档编号C12Q1/68GK102115783SQ200910256119
公开日2011年7月6日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者孙炜伟, 杜蕾蕾 申请人:威海华康生物芯片有限公司