专利名称：一种高灵敏度焦测序反应液及其配制方法
技术领域：
本发明属于基因测序领域，涉及一种高灵敏度焦测序反应液及其配制方法，具体
说是通过增加焦测序反应液中的三磷酸腺苷硫酸化酶和荧光素酶量，使焦测序反应信号显 著上升的同时，其背景信号控制在很低的水平。
背景技术：
DNA序列测定技术是现代生命科学研究的核心技术之一。目前普遍使用的DNA序 列分析技术基本上都是基于双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)，但Sanger法只能定性不 能定量；适合大规模测序不适合测定单碱基差异并且不能准确测定引物后面的碱基序列。 焦测序(pyrosequencing)技术在进行DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，可以直接测 定引物后面的碱基序列，定量性能好，结果准确，可实现自动化，很好的克服了 Sanger法的 缺点。 焦测序技术是一种DNA序列实时检测技术，可快速、准确地进行短DNA序列分析， 除可用于细菌、病毒、真菌的鉴定、分型及耐药性分析外，还可用于突变及插入缺失检测、 CpG甲基化分析、基因拷贝数鉴定等。其原理是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联 反应，引物与单链DNA模板退火后，在核酸聚合酶(klenow)的作用下，依次加入4种不同的 脱氧核糖核苷酸(dNTPs)中的l种，如果加入的dNTP与模板互补，则发生延伸反应，释放出 等摩尔量的PPi ;PPi在三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)的催化作用下，与5'-磷 酸化硫酸腺苷(APS)反应生成三磷酸腺苷(ATP) ;ATP与荧光素(luciferin)在荧光素酶 (luciferase)作用下产生荧光，荧光强度与结合的dNTP数成正比；如果加入的dNTP与模 板不互补，则无荧光产生，以此来测定引物后的碱基序列。反应中同时还加入了三磷酸腺苷 双磷酸酶(即yrase)将未结合的dNTPs和ATP降解。 在焦测序反应体系中，ATP硫酸化酶催化PPi和APS反应生成ATP，而因APS是ATP 的结构类似物，也可作为荧光素酶的底物，虽然与ATP相比反应效率为1/1000左右，但是由 此产生的背景信号会对检测信号产生干扰。在传统的焦测序反应液中，为了将单链延伸时 生成的PPi高效地转变为ATP，通常是将5iimol/L的APS加入到反应液中，比如反应液的体 积为100iiL时，5iimol/L的APS会产生相当于500fmol的ATP的背景信号。所以，传统的 焦测序反应液的检测灵敏度较低，必须使用pmol级以上的DNA样品。 焦测序反应的光信号可通过光电倍增管(PMT)、光电偶合器(CCD)或光敏管(PD) 采集，其中PMT的检测灵敏度最高，但由于价格昂贵、体积大难以阵列化等缺陷，限制了其 在焦测序仪器中的应用；CCD虽然有体积小可阵列化的优势，但其检测灵敏度低且成本较 高；而价格低廉且体积较小的光敏管虽可降低焦测序检测成本，但同样需要通过提高焦测 序反应液的灵敏度来克服其检测器的不足。 增加荧光素酶浓度可使光信号增强，但由APS产生的背景信号也会随之升高，因 此不能仅通过增加荧光素酶量来提高焦测序反应灵敏度。另外，由于减少使用的APS量，焦 测序反应中的荧光信号也会降低，因此也不能通过降低APS的量来降低焦测序反应的背景信号。有研究提出用丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)代替ATP硫酸化酶，其底物AMP和PEP不与 荧光素酶反应，所以增加荧光素酶量也不会导致背景信号的增加。使用PPDK的焦测序体系 可以通过增加荧光素酶量达到对fmol级模板的检测，但目前市场上还没有商品化PPDK供 应，且该酶不易通过基因工程表达获得。
发明内容
本发明的目的是在传统的APS-ATP硫酸化酶焦测序反应体系的基础上，建立一种 高灵敏度、低背景信号的焦测序反应液的配制方法，用于低成本的微量DNA的实时短序列 分析。 本发明的目的是通过下列技术方案实现的 —种焦测序反应液的配制方法，该方法通过提高传统的APS-ATP硫酸化酶焦测序 反应液中ATP硫酸化酶的浓度来降低焦测序反应的背景信号，从而提高焦测序反应的灵敏 度。 所述的焦测序反应液的配制方法，该方法在提高ATP硫酸化酶浓度的基础上，通
过将荧光素酶浓度提高2 30倍来进一步提高焦测序反应的灵敏度。 所述的焦测序反应液的配制方法，其中ATP硫酸化酶的浓度需提高至其活性浓度
大于反应液中的APS浓度；ATP硫酸化酶的活性浓度是指八倍于反应液中的ATP硫酸化酶
的浓度。 所述的焦测序反应液的配制方法，其中反应液中APS浓度为5 ii mol/L。 所述的焦测序反应液的配制方法，其中反应液中ATP硫酸化酶的浓度为10U/
mL(即0. 665iimol/L)。 所述的配制方法制备的焦测序反应液，该反应液的组成为0. lmol/L Tris-HAc(pH7. 7) ，2,1/L EDTA， 10,1/L Mg(Ac)2，0.1 % BSA， 1,1/L DTT，5践o1/ L APS，0.4g/L PVP，O. 4mmol/L D—luciferin，18U/ml klenow，1. 6U/ml apyrase，14. 6 292mg/Lluciferase，lOU/mL ATP sulfurylase。传统的APS-ATP硫酸化酶焦测序反应液的组成0. lmol/L Tris-HAc (pH7. 7)， 2翻1/L EDTA， lOmmol/L Mg(Ac)2，0.1 % BSA， 1翻1/L DTT， 5 ii mol/LAPS，0. 4g/LPVP， 0.4mmol/L D_luciferin，10 100U/mL Klenow，1 2U/mL apyrase，2 10mg/ Lluciferase，0. 2U/mL ATP sulfurylase。
详细地说，本发明技术方案的原理为
1、通过增加ATP硫酸化酶量以降低背景信号 焦测序反应中的背景信号主要是由APS产生的，因APS与ATP结构相似，可与荧光 素酶结合，在一定的温度和pH条件下，其反应平衡常数为kl ;同时，APS又是ATP硫酸化酶 的强底物，其反应平衡常数k2远大于kl。因此，如下述方程式(ATP硫酸化酶及荧光素酶催 化反应动力学方程式)所示，荧光素酶与ATP硫酸化酶竞争性地结合APS，并最终达到平衡 状态。游离的APS被荧光素酶捕获后生成的发光物质(Luciferase[oxyluciferin* *APS])
即是焦测序反应中产生背景信号的主要原因。
APS + luciferin + 02 + Liiciferase"<"~^~>Ludferase[oxyludferin * APS] + CO,
4
APS + ATP Si她rylase < 、 > ATP Si她ryase [APS]
在传统的焦测序反应体系中，APS浓度为5 ii mol/L， ATP硫酸化酶浓度为0. 2U/ mL(即0. 133iimol/L)。由于ATP硫酸化酶具有八个活性中心，所以0. 133践ol/L的ATP 硫酸化酶可以结合1. 064 ii mol/LAPS，游离的APS浓度为3. 936 y mol/L，这些未被ATP硫酸 化酶结合的APS可以与荧光素酶反应产生背景荧光信号，并且背景信号强度会随着荧光素 酶的浓度增加而增加。 保持APS量不变，若增大反应液中ATP硫酸化酶浓度至其活性浓度大于APS浓度，
则可在很大程度上限制APS与荧光素酶的结合，从而大大降低焦测序背景信号。 2、通过增加荧光素酶的量以提高光信号强度 —方面，在酶促反应中，反应的起始速度V与底物浓度[S]的关系可用米氏方程V =Vmax[S]/(Km+[S])表示，其中Vmax是酶被底物饱和时的反应速度，Km为一常数，只由酶 的性质决定，而与酶的浓度无关。在低浓度底物情况下，反应相对于底物是一级反应，若底 物浓度不变，则V与Vmax成正比；当底物浓度非常大时，反应相对于底物S是个零级反应， 则V趋近于Vmax。因Vmax = k。at[E] ， k。at是ES转化为游离的E和产物的速度常数，所以 Vmax正比于酶浓度，也就是说在底物一定的条件下，V与酶浓度成正比。具体在焦测序反应 体系中，随着荧光素酶浓度的增加，催化反应的速率加快，产生光信号所需要的时间縮短， 瞬间产生的光信号增强，故检测信号增加。 另一方面，由于焦测序反应过程是由四种酶共同参与的酶级联反应，在ATP硫酸 化酶及核酸聚合酶足量的情况下，检测信号的强度决定于荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶 的浓度。焦测序反应所形成的光信号峰的上升曲线是由于ATP与荧光素在荧光素酶催化下 产生光信号，而其下降曲线主要是因三磷酸腺苷双磷酸酶催化ATP的降解。当三磷酸腺苷 双磷酸酶浓度一定时，其降解ATP的速度一定，而随荧光素酶浓度增大，ATP作为荧光素酶 底物的反应速度加快，故信号峰的高度增高，检测信号增强。 因此，在使用高浓度ATP硫酸化酶的情况下，可以简单地通过增加荧光素酶的量
来实现高灵敏度的焦测序反应。 本发明的有益效果 本发明通过增加焦测序反应液中的ATP硫酸化酶量，从而抑制其底物APS和荧光 素酶反应，APS与荧光素酶的反应受抑制后可降低焦测序反应的背景信号，增加荧光素酶 量可提高光信号强度，同时背景信号不增加，使得在高浓度荧光素酶条件下，背景信号控制 在很低的水平，而反应信号显著上升，因此使用与通常相比低一个数量级的几十fmol量的 DNA就可进行碱基测序。同时，这一新型的高灵敏反应液可应用于以价格低廉的光敏管阵列 为检测器的便携式生物发光分析仪，从而实现快速、高效、低成本的DNA分析。本发明克服 了传统的技术偏见，通过提高传统的APS-ATP硫酸化酶焦测序反应液中ATP硫酸化酶的浓 度或者ATP硫酸化酶的浓度与荧光素酶的量就可以提高焦测序反应的灵敏度。
图1是不同浓度ATP硫酸化酶的焦测序反应液检测50fmol DNA单链的信号图。
图2是ATP硫酸化酶浓度与测序信号和背景信号的关系图。
图3是分别在低、高浓度ATP硫酸化酶条件下随荧光素酶浓度增加的测序信号和 背景信号变化图。 图4是禽流感病毒M、 HA基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图。 图5是禽流感病毒H5M基因的焦测序检测结果图。 图6是禽流感病毒H9M基因的焦测序检测结果图。 图7是禽流感病毒H5HA基因的焦测序检测结果图。 图8是禽流感病毒H9HA基因的焦测序检测结果图。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述
实施例1 :高灵敏度的焦测序反应液配制
l.ATP硫酸化酶浓度的优化 已知APS与ATP硫酸化酶形成酶底物复合体的反应的米氏常数Km = 0. 56 y mol/ L，为了达到最大反应速度，且过量的底物又不至于抑制酶活性，底物浓度需为Km值的10 倍，因此本实验中固定APS浓度为5iimol/L。焦测序反应液中的其他组分分别为0. lmol/ L Tris-HAc(pH 7.7)，2,1/L EDTA， 10,1/L Mg(Ac)2，0.1 % BSA， lmmol/LDTT，0. 4g/L PVP，0.4,1/L D-luciferin，5iimol/L APS， 18U/ml Klenow， 1. 6U/ml apyrase， 29. 2mg/ L luciferase。平行配制6份反应液，在每份100 y L测序反应液中分别加入0. 1、0. 2、 0.5、1、2、5iiL的ATP硫酸化酶(Sigma，20U/ml，13. 3iimol/L)，即ATP硫酸化酶浓度从 0. 0133iimol/L逐渐增大到0. 665 y mol/L，用该系列反应液分别对50fmol DNA单链进行检 测，结果如图1所示，背景信号随着ATP硫酸化酶浓度增加而急剧下降，并且信号强度略有 增加。以ATP硫酸化酶的一系列浓度与测序信号和背景信号分别作图，见图2，曲线A为ATP 硫酸化酶的浓度与测序信号的关系曲线，B为ATP硫酸化酶的浓度与背景信号的关系曲线。
结果显示当ATP硫酸化酶的浓度超过0. 0665 y mol/L后，测序信号与ATP硫酸化 酶浓度无关；当ATP硫酸化酶浓度大于0. 0133 y mol/L小于0. 266 y mol/L时，背景信号随 着ATP硫酸化酶浓度增加显著降低，而当ATP硫酸化酶浓度大于0. 266 y mol/L后，背景信 号降低幅度明显减小，直至ATP硫酸化酶浓度为0. 665 mol/L时，背景信号极低接近于零。
由此可见，在APS量一定的条件下，增加ATP硫酸化酶的浓度至0. 665 ii mol/L (即 lOU/mL)时，因其活性浓度达到5. 32 y mol/L，大于反应液中APS浓度，因此可在很大程度上 限制APS与荧光素酶的结合，从而大大降低焦测序背景信号。
2.荧光素酶浓度的优化 本实验分别比较低浓度与高浓度的ATP硫酸化酶条件下，荧光素酶浓度增大后对 检测灵敏度的影响。焦测序反应液中其他各组分浓度不变，a、b两组实验中ATP硫酸化酶浓 度分别为0. 0133 ii mol/L与0. 665 y mol/L，逐步增大荧光素酶量，在每100 y L的测序反应 液中分别加入荧光素酶(Promega， 14. 6mg/ml，5. 662GLU/ii L) 0. 1、0. 2、0. 5U、2ii L，依次对 应为0. 5662GLU、1. 1324GLU、2. 831GLU、5. 662GLU、11. 324GLU，即反应液中荧光素酶浓度变 化范围为14. 6 292mg/L。用上述反应液对50fmol DNA单链进行检测，结果分别如图3a、 b所示。分别将a、b两组实验中的各背景信号(BG)以及测序信号加上背景信号(SIG+BG) 绘制线性图，如图3c所示，(SIG+BG) 1和BG1分别表示图3a中"测序信号+背景信号"和"背景信号"，(SIG+BG) 2和BG2分别表示图3b中"测序信号+背景信号"和"背景信号"。由 图可见，当测序反应液中ATP硫酸化酶浓度较低时，随着荧光素酶浓度增大，背景信号同时 与测序信号以相近的比例升高，因此很高的测定值(SIG+BG)限制了检测灵敏度的进一步 提高；而当测序反应液中ATP硫酸化酶浓度较高时，测序信号随荧光素酶浓度增大而大幅 增高，且背景信号一直控制在很低的水平，不干扰DNA互补链合成所产生的光信号检测，从 而提高了焦测序的检测灵敏度。 实施例2 :焦测序法对禽流感病毒进行分型
l.cDNA样本 —株H5N1型禽流感病毒cDNA样本由江苏省疾病预防控制中心提供；3株H9N2型 禽流感病毒cDNA样本(A/HeNan/2/04， A/HeNan/3/04和A/HeNan/5/04)由北京农业大学医 学部提供。 2.基因特异性PCR扩增 采用基因特异性PCR分别扩增禽流感病毒H5和H9亚型的M基因和HA基因。100ii L PCR反应体系中含有引物各O. 2iimol/L(见表l)， dNTP 0. 5mmol/L， MgCl2 3. Ommol/L，lX 缓冲液，2. 5U Taq DNA聚合酶以及100 500ng cDNA模板。热循环参数为94。C预变性 3min ;然后以94。C变性10s，60。C (M基因)或者55。C (HA基因)退火20s， 72。C延伸40s， 扩增30个循环；最后72t:延伸7min使反应完全。反应完成后，取反应产物2 y L在2. 0% 琼脂糖凝胶上进行电泳(1XTAE电泳缓冲液，电压IOOV，恒压电15min)，凝胶成像系统拍摄 电泳图谱。 表1用于基因特异性PCR扩增的引物序列(SEQ ID NO. 1 5)
顿基因引物序列(5'—卩)产物长度(bp〉
Sequence (53 )Product size (tp)
H3' H9MMFBbin"GTGCCCAGTG\GCQ\GG\C300
MRAGTTGCCATCTGTCTGT(HG
H5HAH5FB iDtJQ-TATGCATACAAAATTGTCAAG259
HRACCTGC1ATAGCTCCAAATAG
H9HAH9F233 3.焦测序用单链的制备 (1)取lOii L链亲和素包被的磁珠于PCR反应管中，用磁铁吸弃上清液，加100 ii L 洗涤缓冲液洗2遍；(2)将磁珠悬浮于90 ii L洗涤缓冲液中，然后加入90 ii L PCR产物，在 磁珠结合仪中于37t:反应lh，反应过程中通过轻轻振摇PCR管使磁珠始终处于悬浮状态； (3)用磁铁固定磁珠，吸弃上清液；用洗涤磁珠2 3遍，每次加入180 ii L H20 ;加入 0. lmol/LNaOH溶液20 y L，混匀，室温放置10min使之变性；吸出上清液置于另一个PCR反 应管中。固相磁珠再用10 y L 0. lmol/L NaOH洗1遍，合并上清液；(4)用100 y L洗涤缓 冲液洗涤固相磁珠2遍；然后用100 ii L IX退火缓冲液洗1遍；再将固相磁珠溶于20 ii L IX退火缓冲液中，加入2ii L 10iimol/L测序引物5'-AGT TGC CATCTG TCT GTG AG-3，进 行退火，退火条件为93°C 30s;55°C 3min。 4。C保存备用。
4.焦测序反应 按照本发明的焦测序反应液的组成配制如下0. lmol/L Tris-HAc(pH 7.7)， 2mmol/L EDTA，10mmol/L Mg(Ac)2，0. 1 % BSA，lmmol/L DTT，0.4g/L PVP，0.4mmo1/
7LD_luciferin，5 li mol/L APS，18U/ml klenow，1.6U/ml apyrase，292mg/L luciferase， 10U/mLATP sulfurylase。依次加入dCTP、 dTTP、 dGTP和dATP a S，对各个与引物退火后的 样本单链模板进行序列测定。
5.结果 用MF/MR、H5F/HR、H9F/HR这3对引物分别扩增人基因组DNA样本、1个H5N1型病 毒样本和3个H9N2型病毒样本，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示A表示M基 因扩增结果；B表示H5HA基因扩增结果；C表示H9HA基因扩增结果。泳道l为空白；泳道 2为人基因组DNA ;泳道3为H5N1病毒样本；泳道4 6为H9N2病毒样本。结果表明MF/ MR能特异性的扩增出禽流感病毒的M基因，据此可判断被测样本是否为禽流感病毒样本， 或者是否含有禽流感病毒；H5F/HR能特异性的扩增H5N1型病毒的H5HA基因，据此可判断 被测样本是否为H5N1型禽流感病毒；H9F/HR能特异性的扩增H9N2型病毒的H9HA基因，据 此可判断被测样本是否为H9N2型禽流感病毒。 但仅靠PCR扩增技术无法准确检测禽流感病毒，所以我们使用焦测序技术对现有 样本进行序列检测。结果显示其中一个样本的序列为"5'-ACC GAT GCT GTG AATCTG CAA TCT GCT CAC AA-3'"(见图5)，另外3个样本的序列均为"5'-ACC TATGGT GTG AAT CAG CAA TCT GCT CAC AA-3'"(见图6)。为了判断禽流感病毒及其亚型，将检测到的基因序列 与NCBI中已知序列进行blast比对分析。因我们所测得的基因序列为反向链，故将其转换 为正向链即分别为"5'-TTG TGA GCA GAT TGC AGATTC ACA GCA TCG GT' (SEQ ID NO. 6)" 禾口"5， -TTG TGA GCA GAT TGC TGA TTCACA CCA TAG GT_3， (SEQ ID NO. 7)"。比对分析结 果表明，检测到的序列含有禽流感病毒特征的M基因序列，可判断被测样本为禽流感病毒。 焦测序法测得其中一个样本的裂解位点附近碱基序列为"5'-TCC TCT TTT TCT TCT TCT TTC TCT T-3'"(见图7)，转换为正向链即为"5' -AAG AGA AAG AAG AAG AAA AAG AGG A-3， (SEQID NO. 8) "，blast比对分析结果表明该样本为H5亚型；使用软件BioXM 2. 2将该 序列翻译成氨基酸序列为"RERRRKRG" (SEQ ID NO. 9)，根据OIE推出的新禽流感病毒致病 力鉴定标准，判断该样本具有潜在高致病力。焦测序法测得另外3个样本的裂解位点附近 碱基序列为"5' -TCC TCT ACT TGA TCT AGC AGG CAC ATT-3'"(见图8)，转换为正向链即 为"5' -AAT GTG CCT GCT AGA TCA AGT AGA GGA-3' (SEQ IDNO. 10) "， blast比对分析表 明这些样本为H9亚型；将该序列翻译成氨基酸序列为"NVPARSSRG" (SEQ ID NO. 11)，根据 标准判断这些样本具有较低的致病力。同时用Sanger法进行了对比测定，测序结果与焦测 序法完全一致。
序列表 〈110〉华东医学生物技术研究所 〈120〉 一种高灵敏度焦测序反应液及其配制方法 〈160〉 11 〈210>1 〈211>19 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉:0068] 〈223〉禽流感病毒H5和H9亚型M基因的正向引物
:0069] 〈400〉 1
:0070] gtgcccagtg agcgaggac 19
:0071] 〈210>2
:0072] 〈211>20
:0073] 〈212>DNA
:0074] 〈213〉人工序列
:0075] 〈220〉
:0076] 〈223>禽流感病毒H5和H9亚型M基因的反向引物
:0077] 〈400>2
:0078] agttgccatc tgtctgtgag 20
:0079] 〈210>3
:0080] 〈211>21
:0081] 〈212>DNA
:0082] 〈213〉人工序列
:0083] 〈220〉
:0084] 〈223〉禽流感病毒H5亚型HA基因的正向引物
:0085] 〈400>3
:0086] tatgcataca aaattgtcaa g 21
:0087] 〈210>4
:0088] 〈211>21
:0089] 〈212>DNA
:0090] 〈213〉人工序列
:0091] 〈220〉
:0092] 〈223>禽流感病毒H5和H9亚型HA基因的反向引物
:0093] 〈400>4
:0094] acctgctata gctccaaata g 21
:0095] 〈210>5
:0096] 〈211>21
:0097] 〈212>DNA
:0098] 〈213〉人工序列
:0099] 〈220〉
:0100] 〈223>禽流感病毒H9亚型HA基因的正向引物
:0101] <400>5
:0102] ttcaggagag agccacggaa g 21
:0103] 〈210>6
:0104] 〈211>32
:0105] 〈212>DNA
:0106] 〈213〉天然序列，来源于禽流感病毒H5亚型M基因
9
〈220〉 〈223〉 〈400>6 ttgtgagcag attgcagatt cacagcatcg gt 32 [O川]〈210>7 〈211>32 〈212>DNA 〈213〉天然序列，来源于禽流感病毒H9亚型M基因 〈220〉 〈223〉 〈400>7 ttgtgagcag attgctgatt cacaccatag gt 32 〈210>8 〈211>25 〈212>DNA 〈213〉天然序列，来源于禽流感病毒H5亚型HA基因 〈220〉 〈223〉 〈400>6 a 3ga g朋3ga 3ga 3ga 3朋3ga gga 25 Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly 1 5 〈210>9 〈211>8 〈212>PRT 〈213〉天然序列，来源于禽流感病毒H5亚型 〈220〉 〈223〉 〈400>9 Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly 1 5 〈210>10 〈211>27 〈212>DNA 〈213〉天然序列，来源于禽流感病毒H9亚型HA基因 〈220〉 〈223〉 〈400>10 aat gtg cct get aga tea agt aga gga 27
Asn Val Pro Ala Arg Ser Ser Arg Gly 1 5 〈210>11 〈211>9 〈212>PRT 〈213〉天然序列，来源于禽流感病毒H9亚型 〈220〉 〈223〉 〈400〉 11 Asn Val Pro Ala Arg Ser Ser Arg Gly 1 权利要求
一种焦测序反应液的配制方法，其特征在于通过提高传统的APS-ATP硫酸化酶焦测序反应液中ATP硫酸化酶的浓度来降低焦测序反应的背景信号，从而提高焦测序反应的灵敏度。
2. 根据权利要求1所述的焦测序反应液的配制方法，其特征在于在提高ATP硫酸化酶 浓度的基础上，通过将荧光素酶浓度提高2 30倍来进一步提高焦测序反应的灵敏度。
3. 根据权利要求1所述的焦测序反应液的配制方法，其特征在于ATP硫酸化酶的浓度 需提高至其活性浓度大于反应液中的APS浓度；ATP硫酸化酶的活性浓度是指八倍于反应 液中的ATP硫酸化酶的浓度。
4. 根据权利要求1所述的焦测序反应液的配制方法，其特征在于反应液中APS浓度为 5 li mol/L。
5. 根据权利要求1所述的焦测序反应液的配制方法，其特征在于反应液中ATP硫酸化 酶的浓度为10U/mL(即0. 665 y mol/L)。
6. 根据权利要求1所述的配制方法制备的焦测序反应液，其特征在于该反应液的组 成为:0. lmol/L Tris-HAc(pH 7.7)，2,1/L EDTA， lOmmol/L Mg Ac)2，0. 1 % BSA， lmmol/L DTT， 5 ii mol/LAPS， 0. 4g/L PVP， 0. 4mmol/L D_荧光素，18U/ml核酸聚合酶，1. 6U/ml三磷酸 腺苷双磷酸酶，14. 6 292mg/L荧光素酶，10U/mLATP硫酸化酶。
7. 根据权利要求1所述的焦测序反应液的配制方法，其特征在于传统的APS-ATP硫酸 化酶焦测序反应液的组成0. lmol/L Tris-HAc(pH7. 7) ，2mmol/L EDTA， lOmmol/LMg(Ac)2， 0. 1%BSA， 1,1/L DTT，5践ol/L APS，0.4g/L PVP， 0. 4mmol/L D-荧光素，1 2U/mL三磷 酸腺苷双磷酸酶，10 100U/mL核酸聚合酶，2 10mg/L荧光素酶，0. 2U/mLATP硫酸化酶。
全文摘要
本发明涉及一种高灵敏度焦测序反应液的配制方法，它通过增加焦测序反应液中的ATP硫酸化酶量来抑制其底物APS和荧光素酶的反应，使得在高浓度荧光素酶条件下，背景信号能够控制在很低的水平，而反应信号显著上升，因此使用与通常相比低一个数量级的几十fmol量的DNA就可进行碱基测序。因此，对于来源稀少的样本以及扩增效率低下的产物能够实现准确的短序列测定，同时，这一新型的高灵敏反应液还可应用于以价格低廉的光敏管阵列为检测器的便携式生物发光分析仪，从而实现快速、高效、低成本的DNA分析。
文档编号C12Q1/68GK101724704SQ20091026406
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者吴文娟, 周国华, 武海萍 申请人:华东医学生物技术研究所